青稞根腐病生防放線菌的篩選及防效研究

李雪萍，徐冬麗，劉梅金，許世洋，王國平，郭建煒，李建軍，李敏權

(1.甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅甘南州農業(yè)科學研究所，甘肅合作 747000； 3.甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅蘭州 730070)

青稞(L. var. nudum Hook.f.)是我國藏區(qū)人民的主食，對藏區(qū)的發(fā)展和穩(wěn)定作用重大。在西北青藏高原地區(qū)，青稞根腐病的發(fā)病率達5%～20%，嚴重影響青稞的生產。目前，有關青稞根腐病的研究較少。關于青稞根腐病的防治，在國外，主要通過選育抗禾谷鐮孢的大麥品系及采用化學藥劑與木霉素結合的方法進行；在國內，辛忠民等開展了篩選化學藥劑進行防治的研究。抗性品種選育難度大，化學防治易引起病原菌產生抗藥性，且容易造成環(huán)境污染等負面效應。因此，生物防治成為了研究熱點。

目前，針對由鐮孢菌引起的根腐病已發(fā)現了多種有良好防效的生防真菌，如哈茨木霉和康寧木霉對由尖鐮孢、半裸鐮孢、燕麥鐮孢和腐皮鐮孢引起的苜蓿根腐病有良好的防效；灰黃青霉和土曲霉對由鐮孢菌引起的草莓根腐病防效較好；淡紫青霉對尖鐮孢菌抑制作用較強；可減輕由鐮孢菌屬引起的土傳病害。在生防細菌方面，貝萊斯芽孢桿菌對大豆根腐病、馬鈴薯枯萎病以及由立枯絲核菌、腐皮鐮孢、尖鐮孢和鏈格孢引起的番茄根腐病防效良好；枯草芽孢桿菌對由鐮孢菌引起的黃芪根腐病防效較好。在生防放線菌方面，以鏈霉菌屬為主的生防菌株對鐮孢菌的抑制效果較強，如渾圓鏈霉菌、黃鏈霉菌、微白黃鏈霉菌等。然而，在青稞根腐病生物防治方面，僅有岳海梅等發(fā)現球毛殼菌對青稞全蝕病和根腐病有良好的防效，在生防細菌方面仍為空白。鑒于此，本研究采集健康青稞植株及其根際土壤，以期從中篩選出對青稞根腐病有良好防效的放線菌，為青稞根腐病的生物防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采用多點采樣法在甘肅省甘南藏族自治州合作市、卓尼縣、臨潭縣等地采集青稞健康植株及其根際土壤各35份，裝入放有冰袋的保溫盒中，待用。

1.2 根部放線菌的分離

將健康青稞植株根部土壤沖洗干凈、晾干；在超凈工作臺中，剪下青稞根部放入裝有70%酒精的小燒杯中2～3 s；放入0.1%的升汞溶液中消毒10 s；用無菌水沖洗4次，放在已滅菌的濾紙上吸干水分；用無菌解剖刀將根段兩端切去，剩余根段接于高氏一號平板之上，每皿上均勻接三段根；在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱約15～30 d后，在根段附近挑單菌落轉移到另一高氏一號平板之上，所得菌株即為放線菌。

1.3 土壤中放線菌的分離

取10 g從健康青稞植株根部抖下的土壤，裝入盛有100 mL無菌水的三角瓶中，在振蕩機上振蕩10 min；將振蕩后的土壤懸液稀釋到10，用無菌移液槍吸取50 μL于高氏一號平板之上，立即用涂布器涂抹均勻；在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，挑單菌落轉移至另一高氏一號平板，所得菌落即為放線菌。

1.4 菌株純化

將分離得到的放線菌菌株采用平板劃線法純化，觀察其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)，2～3次后純化，然后在PDA培養(yǎng)基繁殖備用。

1.5 拮抗放線菌菌株初篩

采用平板對峙法在PDA培養(yǎng)基上進行，即用直徑為2.5 mm的打孔器打取平板培養(yǎng)的供試病原木賊鐮孢菌，接種于直徑為9 cm的PDA平板正中心；將待測放線菌等距離點接4次于距病原菌邊緣2 cm處，每株放線菌5組重復，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，測量抑菌圈。

1.6 拮抗放線菌復篩

對初篩得到的平均抑菌圈大于20 mm的放線菌用發(fā)酵液法進行復篩，即將菌株接種于裝有200 mL培養(yǎng)液(馬鈴薯∶葡萄糖=10∶1)的500 mL的三角瓶中，每株菌3個重復，在28 ℃、150 r·min的搖床中振蕩培養(yǎng)5 d；將培養(yǎng)液裝入離心管中，10 000 r·min離心10 min；將上清液過0.22 μm的微孔濾膜，取1 mL濾液于預先制備好的PDA平板上，用涂布器涂抹均勻，3個重復，制成帶毒平板；用無菌打孔器取供試病原菌接種于帶毒平板中央，以未帶毒的平板接種供試病原菌作為對照；25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，測量供試病原菌的菌落直徑，計算生長抑制率。

生長抑制率(%)=(對照平板病原菌菌落直徑-帶毒平板病原菌菌落直徑)/(對照平板菌落直徑-接入菌餅直徑)×100%

1.7 拮抗放線菌生防效果測定

采用盆栽法進行防效測定，對生長10 d的青稞植株進行接菌處理，分別為接入40 mL無菌水(陰性對照，CK1)，接入病原菌懸液20 mL+無菌水20 mL(陽性對照，CK2)，接病原菌懸液20 mL+篩選出的拮抗放線菌菌懸液20 mL(EG)，統計其發(fā)病率，計算病情指數和防效，防效=(對照組病情指數-處理組病情指數)/對照組病情指數×100%。

1.8 生防放線菌的鑒定

DNA提取采用OMEGA細菌試劑盒按其說明書進行。PCR擴增采用細菌的通用引物進行：27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。反應體系為25 μL，包括 DNA模板1.0 μL，10×Buffer(含2.5 mM Mg) 2.5 μL，Taq 聚合酶(5 U·μL) 0.5 μL，dNTP(10 mM)1.0 μL，Primer(±10 μM) 1 μL，ddHO補至25 μL；輕彈混勻，瞬時離心收集管壁上的液滴至管底。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，35個循環(huán)；72 ℃下延伸 7 min，4 ℃保存。反應完成后，取2 μL PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒按說明書進行。將純化后的PCR 產物送于北京天一輝遠生物科技有限公司進行測序。使用的測序儀為ABI3730-XL。參照李雪萍等方法比對測定序列并構建系統發(fā)育樹。

1.9 數據處理與分析

基因序列采用CLUSTALX1.83、MEGA7處理；數據用Excel 2007和 DPS 15.10處理，用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌的篩選

從供試青稞的根及其根際土壤中共分離得到放線菌47株，經過初篩得到16株抑菌圈大于20 mm的菌株(圖1)。

圖1 部分放線菌與病原菌拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of part actinomycetes and pathogen

初篩得到的NH4-1等16株菌抑菌效果如圖2所示。復篩時的生長抑制率如表1所示，其中，AP11和H35-1兩株菌的抑制率最高，分別為80%和71.26%，二者間差異顯著，且顯著高于其他菌株，其他各菌株的生長抑制率均低于60%。

圖2 放線菌抑制效果Fig.2 Inhibition effect of actinomycetes

表1 各放線菌對病原菌的生長抑制率Table 1 Growth inhibition rate of each actinomycetes to pathogen

2.2 拮抗放線菌的防效

對病原菌生長抑制率較高的兩株菌H35-1和AP11進行防效測定，結果(表2)發(fā)現， H35-1與AP11均對青稞根腐病防效良好，各處理間發(fā)病率、病情指數及防效均差異顯著，其中H35-1的防效為30.74%，AP11的防效為48.31%，使根腐病的病情指數降低50%左右。

表2 兩株放線菌的防效Table 2 Control effect of the two actinomycetes

2.3 拮抗放線菌的鑒定

對菌株AP11進行分子鑒定，系統發(fā)育樹如圖3所示，與酸瘡痂鏈霉菌()的遺傳距離為零，自展支持率為100，鑒定其為酸瘡痂鏈霉菌。

圖3 基于16S rDNA序列的系統發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

3 討 論

3.1 拮抗放線菌的篩選

定殖在植株體內及根際土壤中的放線菌是寶貴的生物防治資源，其能夠抑制靶標病原物的生長從而起到防治植物病害的作用。本研究中采用平板對峙法從青稞植株及根際土壤中初篩得到47株對青稞鐮孢根腐病病原具有拮抗作用的放線菌，不同菌株抑制病原菌生長的作用效果不一。

目前國內仍缺乏對菌株拮抗效果的評定標準，僅有楊 蕾等、張 瑾等對拮抗菌株的拮抗效果進行了初步的分級，故本研究根據初篩結果共挑選16株抑菌圈大于20 mm的菌株進行復篩，結果發(fā)現，各放線菌對病原菌的生長抑制率與初篩拮抗效果一致，這與曾文婷等、李 威等的研究結果相似。但是部分初篩效果較好的菌株經復篩后其抑菌效果一般，這可能與其產生的抑菌活性物質種類、代謝物質種類和量的不同有關，具體原因還需進一步研究。

3.2 拮抗放線菌的防效

本研究對拮抗性能較好的菌株H35-1和AP11進行防效測定，結果發(fā)現，兩株放線菌對青稞鐮孢根腐病的防效良好，與復篩結果一致，說明其產生的活性物質穩(wěn)定性良好。但在田間應用中，土壤環(huán)境因子復雜，菌株還會受微生物間相互作用及植物與根際微生物間關系的影響，如賴寶春等研究發(fā)現，盆栽防效良好的單一菌劑在田間試驗中效果并不明顯。因此，其防效需要進一步田間實施驗證。

生防菌的防病性不僅與其本身相關，還可以通過對培養(yǎng)基質和發(fā)酵條件優(yōu)化等途徑進行提高，如梁春浩等通過對放線菌門暗黑鏈霉菌的培養(yǎng)基質和發(fā)酵條件進行優(yōu)化后，發(fā)現其對番茄葉霉病的抑菌活性顯著提高。大量研究表明，復合菌劑處理可顯著降低發(fā)病率，對植物病害有較高的防效。因此，本研究對所篩選具有良好防效菌株的發(fā)酵條件及復合配比等有待進一步研究。鏈霉菌屬的多數菌株是良好的生防菌資源，具有生防廣譜性，本研究對所篩選的高效防病菌株AP11鑒定發(fā)現，其為酸瘡痂鏈霉菌，屬鏈霉菌屬且防效較好，且無致病性，與姚錦愛等、熊仕俊等研究結果一致。但也有研究發(fā)現，酸瘡痂鏈霉菌是馬鈴薯和白蘿卜瘡痂病的病原，這可能和寄主以及生長環(huán)境等因素相關。