巴氏芽孢桿菌生物修復重金屬污染溶液試驗研究

黃小松 章榮軍 崔明娟 鄭俊杰

摘 要：垃圾填埋場中重金屬污染問題嚴峻，亟待高效的修復技術予以處理。近年來，MICP技術修復重金屬污染土體/水體的潛力被廣泛探究。在眾多土著微生物中，巴氏芽孢桿菌脲酶活性和重金屬耐受性更佳，但少有研究探究巴氏芽孢桿菌對高濃度重金屬的固定/去除潛力，且僅利用MICP理論難以解釋巴氏芽孢桿菌對不同重金屬的固定/去除機理，此外，常見生物修復工藝的效率有待進一步提高。為避免填埋場中腐殖土和滲濾液物化特性的影響，以重金屬污染溶液為研究對象，采用簡單拌和法開展生物修復試驗;基于MICP和化學平衡理論，利用Visual MINTEQ軟件對生物修復重金屬污染溶液的過程進行簡化模擬。結果表明：高濃度范圍內，巴氏芽孢桿菌可通過生物礦化和生物富集作用有效去除溶液中的Cd、Cr（Ⅲ）和Zn等重金屬;此外，簡單拌和法操作簡便，生物修復效率高，具有工程應用的潛力。

關鍵詞：巴氏芽孢桿菌;生物修復;重金屬;簡單拌和法

中圖分類號：X505?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：2096-6717（2022）03-0160-08

收稿日期：2021-06-03

基金項目：國家重點研發計劃（2018YFC1802302）

作者簡介：黃小松（1997- ），男，主要從事環境巖土工程研究，E-mail：huangxs@hust.edu.cn。

章榮軍（通信作者），男，教授，E-mail：ce_zhangrj@hust.edu.cn。

Received：2021-06-03

Foundation item：National Key Research and Development Program （No. 2018YFC1802302）

Author brief：HUANG Xiaosong （1997- ）， main research interest： environmental geotechnical engineering， E-mail： huangxs@hust.edu.cn.

ZHANG Rongjun （corresponding author）， professor， E-mail： ce_zhangrj@hust.edu.cn.

Experimental investigation on bioremediation of heavy metal contaminated solution by Sporosarcina pasteurii

HUANG Xiaosong， ZHANG Rongjun， CUI Mingjuan， ZHENG Junjie

（Institute of Geotechnical and Underground Engineering， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430074， P.R. China）

Abstract： It is urgent to deal with the severe problem of heavy metal pollution in landfills using efficient remediation technology. In recent years， the potential of MICP technology to remedy heavy metals contaminated soil/water has been extensively explored. Sporosarcina pasteurii shows better urease activity and heavy metal tolerance among the indigenous microorganisms. However， few researches have explored the immobilization/removal potential of S. pasteurii to heavy metals in high concentration. Then， it is difficult to explain the immobilization/removal mechanism of S. pasteurii to different healy metals using only MICP theory. In addition， the efficiency of commonly used bioremediation processes needs to be further improved.To avoid the impact of humus and leachate in the landfill， this study took heavy metal contaminated solutions as the research object and used simple mixing methods to carry out bioremediation experiments. Based on the MICP and chemical equilibrium theory， the Visual MINTEQ software was used to simplify and simulate the bioremediation process of heary metal contaminated solutions. The results show that in the high concentration range， S. pasteurii can efficiently remove heavy metal such as Cd， Cr（Ⅲ） and Zn through biomineralization and bioaccumulation.In addition， the simple mixing method is easy to operate， the bioremediation efficiency is high， and it has the potential for engineering applications.

Keywords： Sporosarcina pasteurii; bioremediation; heavy metal; simple mixing method

中國城市生活垃圾年產量逐年增加，現有填埋場垃圾容量趨于飽和，同時，高昂的土地使用費用限制了新填埋場的開發[1-2]。因此，亟待對封場多年的填埋場進行開挖和資源化利用。但對填埋場腐殖土和滲濾液取樣檢測發現，填埋場中重金屬含量超標現象普遍，重金屬濃度高、種類多，且具有累積性[3-5]。其中，Zn、Cu、Ni和Cd等重金屬污染問題普遍存在，此外，Cr（Ⅲ）大量應用于皮革、油漆、殺菌劑等工業生產中而對環境造成污染，近年來，部分學者采用納米生物材料、復合藻酸鹽針鐵礦珠等手段對其進行修復[6-7]，因此，Cr（Ⅲ）污染問題同樣值得關注。為避免開挖和資源化利用過程中重金屬遷移造成二次污染，選擇高效、實用的修復技術具有重要意義。

近年來，MICP技術在重金屬污染土體/水體修復領域的應用潛力被廣泛探究。MICP技術利用微生物固定重金屬離子，可降低重金屬的可遷移性、活性和生物毒性[8]。大量研究從污染環境中分離出重金屬耐受性強的土著微生物，如黃色考克氏菌（Kocuria flava CR1）[9]、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[10]、微桿菌（Exiguobacteium undae）[11]、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus YR5）[12]和腫大地桿菌（Terrabacter tumescens）[13]等，并探究其固定/去除重金屬的潛力。但研究發現，相較于巴氏芽孢桿菌（Sporosarcina pasteurii），其他土著微生物的脲酶表達量較低。

巴氏芽孢桿菌適應性強、脲酶活性高、環境友好[14]，此前主要應用于砂土固化等領域[15-16]。近年來，部分學者開創性地將巴氏芽孢桿菌應用于重金屬污染水體的修復，并證明其具有去除重金屬的潛力[13，17-18]。但研究顯示，超過一定濃度后重金屬會抑制微生物活性，影響生物修復效果，如Cu2+易被微生物吸收，致使其蛋白質變性并喪失功能;同時，生物礦化形成的碳酸銅沉淀會附著在碳酸鈣表面，從而阻止MICP反應進一步進行[17-18]，因此，有必要在高濃度范圍內探究巴氏芽孢桿菌固定/去除重金屬的能力。此外，常用的生物修復工藝效率較低[17-18]。目前大部分研究僅根據MICP理論分析巴氏芽孢桿菌固定/去除重金屬的機理，較難解釋生物修復這一復雜的生物化學過程。

為避免腐殖土體顆粒和滲濾液物化特性的影響，筆者以Zn、Cu、Ni、Cd和Cr（Ⅲ）等重金屬污染溶液為研究對象，采用簡單拌和法開展生物修復重金屬污染溶液試驗，確定巴氏芽孢桿菌對不同重金屬的去除能力，并分析修復時間、重金屬種類和濃度等因素對生物修復效果的影響;基于MICP和化學平衡理論，利用Visual MINTEQ軟件對微生物修復重金屬污染溶液的過程進行簡化模擬，對比試驗和模擬結果，并結合XRD表征結果，分析微生物固定/去除重金屬的機理。

1 試驗內容

1.1 試驗用菌種

試驗使用從中國普通微生物菌種保藏管理中心購入的巴氏芽孢桿菌（Sporosarcina pasteurii），菌種編號為CGMCC 1.3687。菌種的活化和擴大培養均使用相同的培養液，其成分包括：20 g/L酵母提取物、10 g/L NH4Cl、10 mg/L MnSO4·H2O和24 mg/L NiCl2·6H2O。將各成分按比例混合均勻后，用1 mol/L NaOH調節培養液pH值至8.5。接種微生物前，培養液需經121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。菌種活化時，取適量購入的細菌凍干粉加入100 mL無菌培養液中，在30 ℃、170 r/min搖床中培養48 h。基于活化后的菌液進行擴大培養得到試驗用菌液，使用分光光度計測得菌液光密度（OD600）為2.0左右，脲酶活性為10 U/mL。培養完成的菌液需放置在4 ℃恒溫環境中保存。

1.2 微生物修復重金屬污染溶液

1.2.1 試驗工況

試驗主要探究重金屬種類、濃度和修復時間對生物修復效果的影響。設置Zn、Cu、Ni、Cd和Cr（Ⅲ）5個試驗組。各試驗組根據重金屬初始濃度分為6個工況，工況0不添加重金屬，為對照組;工況1中重金屬濃度根據《綠化種植土壤》[19]重金屬含量技術要求值（Ⅲ級）換算得到，工況2～5中重金屬濃度在工況1的基礎上依次遞增。此外，分別在1、2、4、8、12、24、48 h檢測各試驗參數。具體試驗方案見表1。

1.2.2 試驗步驟

微生物修復重金屬污染溶液試驗包括制備重金屬污染溶液和生物修復重金屬污染溶液兩大步驟：

1）制備重金屬污染溶液：首先在去離子水中分別加入ZnCl2、CuCl2·2H2O、NiCl2·6H2O、CdCl2·2.5H2O和CrCl3·6H2O，配制高濃度重金屬原液，然后在膠結液（即尿素CaCl2溶液）的基礎上混合高濃度重金屬原液，配制成重金屬污染溶液。

2）制備生物修復重金屬污染溶液：生物修復試驗在250 mL燒杯中進行，將50 mL菌液與同體積的重金屬污染溶液混合均勻。混合完成時尿素和CaCl2的濃度為0.5 mol/L，各重金屬離子濃度見表1。分別在不同時間測定pH值、重金屬離子濃度和Ca2+濃度等試驗參數。其中，pH值使用pH計（pH-100A）測定;重金屬離子濃度和Ca2+濃度使用原子吸收分光光度計（AA-6880）測定。試驗中同種工況設置3個平行試樣，測試值平均后得到最終的結果。

1.2.3 試驗指標

采用生物修復完成率（γi）、重金屬殘余率（δ）和Ca2+殘余率（ε）等試驗指標表示生物修復的進行程度和效果，計算過程見式（1）～式（3）。其中，αi和βi分別為i h的重金屬離子濃度和Ca2+濃度。由于48 h時生物修復反應基本完成，因此，將i h已去除重金屬濃度（α0-αi）與48 h已去除重金屬濃度（α0-α48）相比得到生物修復完成率，以表示生物修復進行程度，1～48 h時生物修復完成率小于等于100%。重金屬殘余率（δ）和Ca2+殘余率（ε）則是48 h時溶液中殘余離子濃度（α48或β48）占初始離子濃度（α0或β0）的百分比，以此表征生物修復效果。殘余率（δ或ε）越高，生物修復效果越差。

γi=α0-αiα0-α48×100%（1）

δ=α48α0×100%（2）

ε=β48β0×100%（3）

1.3 Visual MINTEQ軟件模擬

Visual MINTEQ是一款可模擬環境純化學平衡、水體中離子和礦物平衡的軟件，可用于計算環境水化學體系中物質的化學形態分布、pH值及固相沉淀等[20]。因此，基于MICP和化學平衡理論，使用Visual MINTEQ對巴氏芽孢桿菌生物修復重金屬污染溶液過程進行簡化模擬，即認為在脲酶的催化作用下，溶液體系中的尿素可完全水解為NH+4及CO2-3，并與Ca2+和其他重金屬離子達到平衡狀態。具體過程為：1）設置模擬環境。pH值和離子強度均為默認選項，分別設定為"Calculated from mass balance"和"To be calculated"。此外，濃度單位為"Molal"，溫度為25 ℃;2）添加物質成分，并設置初始濃度。包括1 mol/L NH+4，0.5 mol/L CO2-3和0.5 mol/L Ca2+，并根據表1中工況1～5的數值依次設置重金屬離子濃度和Cl-濃度;3）添加化學平衡后可能轉化的固相成分，如Zn試驗組添加Zn2（OH）3Cl（s）、Zn5（OH）8Cl2（s）、ZnCl2（s）、ZnCO3（s）和ZnCO3·H2O（s）;4）運行計算，輸出結果，得到化學平衡后產生的固相成分及濃度，并以此計算重金屬殘余率和Ca2+殘余率。

1.4 XRD分析

使用X射線衍射儀分析試驗生成固相沉淀的成分。在進行X射線衍射分析前，將收集的沉淀烘干并研磨，并用0.1 mm細篩篩分。檢測的結果使用軟件MDI Jade 6鑒定。

2 結果與討論

2.1 生物修復完成率與修復時間的關系

相同試驗組（重金屬種類相同）不同工況（重金屬濃度不同）下的生物修復完成率隨時間的變化差異不大，因此，圖1僅展示各試驗組工況1的生物修復完成率與時間的關系。如圖1所示，Cr（Ⅲ）試驗組的生物修復完成率幾乎不隨修復時間變化，始終接近100%，表明溶液中游離態的Cr（Ⅲ）在微生物誘導下迅速沉淀。隨著反應進行，Ni、Zn、Cd試驗組的生物修復逐漸完成，并分別在24、24、2 h時趨于穩定。由于Cu2+未被去除，因此圖中顯示Cu試驗組生物修復完成率為0。

其他學者在開展生物修復重金屬污染溶液試驗時菌液與污染溶液體積比較小，并在微生物生長過程中修復重金屬，通常需要72 h才能完成修復處理，如表2所示。試驗采用簡單拌和法，將菌液和污染溶液按照體積比1∶1進行混合，提高溶液體系菌液初始濃度，早期脲酶濃度增多，尿素快速水解，因此，生物修復速率顯著提高。

2.2 重金屬生物修復效果

圖2～圖4分別展示了48 h時重金屬殘余率、Ca2+殘余率、pH值與重金屬種類和濃度的關系。在本研究的重金屬濃度范圍內，以重金屬殘余率為主要評價指標，將巴氏芽孢桿菌對不同重金屬的生物修復效果分為：

1）良好且穩定，如對重金屬Cd和Cr（Ⅲ）。Cd和Cr（Ⅲ）試驗組的重金屬殘余率均接近0%（如圖2所示），Ca2+殘余率低于10%（如圖3所示）。此外，試驗過程中發現，經修復處理后溶液體系的pH值呈現不同程度的增長，最終達7.4左右（如圖4所示）。Li等[13]和Jalilvand等[17]同樣發現，巴氏芽孢桿菌對Cd2+耐受性強，生物修復效果好。此外，此前研究表明微生物可通過誘導Cr（Ⅵ）生成CaCrO4或將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）以完成去除[21-22]，但幾乎沒有研究探究微生物對Cr（Ⅲ）的去除。研究結果顯示，巴氏芽孢桿菌同樣可有效去除Cr（Ⅲ），具體機理將結合Visual MINTEQ軟件模擬結果和XRD結果進行分析。

2）非穩定，如對重金屬Zn。圖2顯示，當Zn2+濃度在500～1 000 mg/L范圍時，重金屬殘余率低于10%。但當離子濃度高于1 000 mg/L時，重金屬殘余率迅速增加，最終達到47.5%。同時，Ca2+殘余率明顯增加（如圖3所示）。因此，在研究濃度范圍內，隨著Zn2+初始濃度增加，生物修復效果明顯降低。Jalilvand等[17]研究表明，Zn2+最低抑制濃度為195 mg/L;Mugwar等[18]同樣發現，當Zn2+初始濃度高于130 mg/L時，巴氏芽孢桿菌活性開始受到抑制。綜上所述，巴氏芽孢桿菌僅可在一定濃度范圍內高效去除Zn2+。

3）欠佳，如對重金屬Ni和Cu。Ni試驗組結果顯示，Ca2+殘余率穩定在20%～30%（如圖3所示），表明Ni2+不會顯著抑制微生物活性，但Ni2+殘余率始終保持在80%～92%（如圖2所示），生物修復效果不佳。Gheethi等[23]研究表明，當Ni2+濃度在0.1～0.8 mg/L范圍內時，巴氏芽孢桿菌可通過生物富集作用去除50%～80%的重金屬離子，且隨著Ni2+初始濃度增加，生物去除率降低。因此，研究中巴氏芽孢桿菌可能同樣通過生物富集作用去除Ni2+，但由于Ni2+濃度較高，導致生物修復率始終較低。

Cu試驗組結果顯示，在本研究濃度范圍內（Cu2+初始濃度為400～2 000 mg/L），重金屬殘余率和Ca2+殘余率均接近100%（如圖2和圖3所示），且與其他試驗組不同的是，經生物修復后Cu試驗組pH值略微降低（如圖4所示）。試驗的上述現象（如圖2和圖3所示）表明，溶液中的尿素或并沒有被微生物水解，巴氏芽孢桿菌的活性可能完全喪失。其他研究表明，即使當Cu2+濃度較低（32～320 mg/L）時，巴氏芽孢桿菌對Cu2+去除效果仍不佳[18，24-25]。因此， Cu2+濃度相對較高，微生物活性被顯著抑制。

2.3 試驗值和模擬值的比較

圖5和圖6分別為不同試驗組重金屬殘余率和Ca2+殘余率試驗值和模擬值的比較。由于通過純化學平衡不能生成Cd相關的沉淀，因此，Cd試驗組重金屬殘余率模擬值為100%（圖5（a））。圖5（b）～（e）顯示，Cr（Ⅲ）、Zn、Cu和Ni試驗組的重金屬殘余率模擬值基本穩定在10%以下，其中，模擬結果顯示游離態Cu2+、Ni2+、Zn2+可分別轉化為CuCO3、NiCO3、ZnCO3，Cr3+則以Cr2O3形式沉淀。圖6（a）～（e）表明，溶液體系中的Ca2+幾乎可完全被誘導生成CaCO3沉淀。綜上，基于MICP和化學平衡理論，在尿素完全水解時，大部分金屬離子將以碳酸鹽或氧化物的形式沉淀。

圖5（b）和圖6（b）顯示，Cr（Ⅲ）試驗組的試驗值和模擬值基本一致。但其他試驗組的試驗值和模擬值存在差異：1）圖5（a）顯示Cd試驗組重金屬殘余率試驗值幾乎為0%，但模擬結果顯示無Cd相關沉淀生成。由于純化學平衡不能生成Cd相關沉淀，但有研究表明Cd2+可能通過CaCO3的吸附作用被去除[26]，因此，試驗值和模擬值差異較大;2）圖5（c）、（d）和圖6（c）、（d）顯示，Zn和Cu試驗組的重金屬殘余率和Ca2+殘余率試驗值不同程度地高于模擬值。已有研究表明，超過重金屬最低抑制濃度后，重金屬會抑制微生物活性，尿素水解不充分或幾乎未被水解，生物修復反應被抑制或終止[17-18，24-25]。因此，試驗中Cu2+和Zn2+濃度較高，巴氏芽孢桿菌活性受到抑制;3）試驗表明，巴氏芽孢桿菌可能通過生物富集作用去除Ni2+，但去除效果有限，因此，試驗值和模擬值存在較大差異（圖5（e）和圖6（e））。

2.4 XRD分析

圖7為不同試驗組固相沉淀的XRD分析結果。結果顯示，對照組固相沉淀以方解石和球霰石為主，而Cr（Ⅲ）試驗組固相沉淀的主要成分為碳酸鈣鉻（3CaO·Cr2O3·CaCO3），與Cr（Ⅵ）以CrO2-4形式沉淀的機理類似，與純化學平衡模擬生成Cr2O3相比，可知在微生物作用下，修復產物更復雜。Zn試驗組沉淀中含少量的（CaZn（CO3）2），Buekers等[27]同樣發現Zn能以Ca-Zn-CO3形式被吸附并沉淀。Cr（Ⅲ）和Zn試驗組XRD分析結果表明，巴氏芽孢桿菌可通過生物誘導成礦作用去除重金屬離子，即金屬離子在微生物的誘導下形成氧化物或碳酸鹽沉淀。此外，在Cd和Ni試驗組的固相沉淀中未發現相應的氧化物及碳酸鹽沉淀。Fang等[28]發現，當Cd2+濃度在2～50 mmol/L范圍時可以CdCO3形式沉淀，但可能由于本研究中初始Cd2+濃度較低，導致相關化合物含量極低，因而無法被檢測;Ni2+或因通過生物富集作用被去除[23]，因此未形成氧化物或碳酸鹽沉淀。

3 結論

通過巴氏芽孢桿菌生物修復重金屬污染溶液試驗，對比試驗值和Visual MINTEQ軟件模擬值，并結合XRD對固相沉淀成分的分析結果，得到如下結論：

1）巴氏芽孢桿菌具有高效修復高濃度重金屬污染溶液的潛力。在本研究重金屬濃度范圍內，巴氏芽孢桿菌幾乎可完全去除Cr（Ⅲ）、Cd2+;隨著Zn2+初始濃度增加，其修復效果降低，具體表現為重金屬殘余率從3.7%增至47.5%;但巴氏芽孢桿菌對Ni2+和Cu2+去除效果不佳。

2）巴氏芽孢桿菌可能通過生物礦化和生物富集作用去除重金屬離子，如巴氏芽孢桿菌可誘導Cr（Ⅲ）和Zn2+生成氧化物和碳酸鹽沉淀，并可能通過生物富集作用去除Ni2+。

3）研究采用的簡單拌和法操作簡便，生物修復效率更高，具有生物修復重金屬污染溶液和沉積物工程應用的潛力。參考文獻：

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（編輯 黃廷）