利用光譜法研究泥炭腐植酸與吡唑草胺相互作用

Romualda Bejger，Lilla Mielnik，Ma?gorzata W?odarczyk，Pawe? Nicia 著

孫詩奇4 劉莎莎4 趙紅艷4* 譯

1 西波美拉尼亞科技大學物理與農業物理系 波蘭什切青市 71-459

2 西波美拉尼亞科技大學環境化學微生物學與生物技術系 波蘭什切青市 71-434 3 克拉科夫農業大學土壤科學與土壤保護系 波蘭克拉科夫市 31-120

4 東北師范大學地理科學學院 長春 130024

多年來，盡管圍繞農藥對環境的負面影響存在許多爭議，但農藥的應用一直是保護作物免受各種生物來源威脅的最有效和最現代的方法（Aktar等，2009）。由于農藥使用廣泛并且半衰期較長，它們的殘留物現在可以在自然環境的各個角落找到，包括水（Tankiewicz等，2010）、土壤（Aktar等，2009）、底部沉積物（Erkmen等，2013）、空氣（Zivana等，2016）、植物（Fantke等，2011）和生物有機體（Jayaraj等，2016）。除了對環境的直接威脅，存在于生態系統中的農藥可以在生態系統內部以及生態系統之間遷移。包括農藥在內的各種有機污染物在生態系統中的自然儲存是有機物（OM）。OM對農藥的吸附通過改變其遷移、方向、生物有效性和毒性，在自然環境中發揮著重要作用（Aktar等，2009；W?odarczyk，2014；W?odarczyk等，2015）。物理吸附和化學吸附是不同OM組分對外來生物的兩個吸附過程，其中包括離子、氫和共價結合、范德華力、電子供體-受體和電荷轉移機制，以及配體交換和疏水結合（Gevao等，2000）。然而，必須指出的是，并非所有機制都同時發生。觀察到的結果取決于OM組分官能團的性質和反應介質的pH值。表面吸附并不是積累有機污染物的唯一途徑，它們可以被困在OM的三維結構中（Oleszczuk，2007；Ukalska-Jaruga等，2015）。

土壤有機質（SOM）是一種非均質、復雜的大分子化合物混合物。它由不同分解階段的動植物源輸入物質，以及具有特定性質的有機物質即腐殖質（HS）組成（Kumada，1987；Stevenson，1994）。HS的結構和化學性質因氣候地球化學條件而異，而氣候地球化學條件決定了HS的吸附能力。吸附速率與HS來源、分子質量和極性有關（Senesi等，1995；Oleszczuk，2007；D’Orazio等，2016）。腐植酸（HA）、黃腐酸（FA）和腐黑物等腐殖質通常是土壤有機質的主要組成部分（Kumada，1987；Stevenson，1994）。眾所周知，HA是具有“統計”結構的異聚縮合物，主要由與-O-，-（CH2）n-，=NH和-S-橋連的芳香環組成，含有各種官能團（如-COOH，-OH，=C=O，-OCH3）。這種“富有”的活性官能團致使HA成為最強大的反應劑，能夠與重金屬（Boguta等，2016）、芳香族化合物（Sun等，2008）、有機酸（Cozzolino等，2001）、除草劑（D’Orazio等，2016）、殺菌劑（Morales等，2013）、殺蟲劑（Scaglia等，2016）等發生反應。研究表明，HA對無機和有機污染物的吸收、運輸、沉積、生物有效性、生物積累、降解和毒性都有很強的影響。許多不同的光譜技術被用于研究HA的結構及其與外生物質的相互作用，如：熒光光譜（D’orazio等，2016）、核磁共振（Huang等，2012）、電子自旋探針（Pandey等，1999）、紅外光譜（Senesi等，1995）和紫外-可見光譜（Leita等，2009）。

延遲發光（DL）現象涉及材料在光照停止后的發光快速衰減。DL通常通過記錄材料輻照后在特定時間序列中的發光衰減動力學或其強度來進行測試（Prokowski等，2012）。DL提供關于光化學反應之前的光物理過程的信息。HS引起的光化學反應涉及從激發態HS*到反應態組分，如溶劑化電子（eaq）、羥基自由基（·OH）、單線態氧（1O2）和反應三重態（3HS*）等的能量轉移。眾所周知，HS作為光敏劑，可以激活許多光化學過程（Aguer等，1999；Nkhileal，2014）。DL是一種靈敏、高效的水環境狀態監測方法（Mielnik，2009；Prokowski等，2012）。到目前為止，還沒有利用DL研究HA與有機污染物的相互作用的文獻。因此本文利用光譜方法分析了從泥炭土中分離的HA與吡唑草胺的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象為波蘭南部和北部的5塊泥炭地。第1塊是位于Orava Nowy Targ盆地區域的排水泥炭地，第2、3塊是位于Babiogórski國家公園區域的山地礦養沼澤地，以及第4、5塊是分別位于Dolna Odra溝谷區域的礦養沼澤和隆起式雨養沼澤。從表層（0～50 cm）采集代表性泥炭土樣品。將收集的泥炭土樣品直接運至實驗室，風干并研磨備用。

根據國際腐殖質學會程序（Swift，1996），從研究泥炭土樣品中分離出腐植酸（HA1、HA2、HA3、HA4和HA5）。按以下步驟提取：（1）使用HCl去除鈣離子；（2）使用NaOH三次萃取；（3）使用HCl使HA沉淀；（4）添加固體KCl在KOH中再溶解提純HA；（5）使用HCl再沉淀HA；（6）用重蒸水沖洗，直到使用AgNO3通過Cl-測試；（7）HA冷凍干燥。

本研究使用除草劑吡唑草胺懸浮液濃縮物（吡唑草胺500 SC），該除草劑含有的生物活性物質吡唑草胺結構見圖1。這是一種土壤和葉面施用的選擇性除草劑，用于防治冬季油菜、春季油菜、白頭甘藍、紅頭甘藍、羽衣甘藍和抱子甘藍中的單子葉和雙子葉一年生雜草。這種藥劑可以通過正在發芽的雜草的根吸收，在出苗時被除去。雜草出苗后直到第一片葉子出現時，也是有效的。（Praczyk等，2004；W?odarczyk，2014）。

圖1 吡唑草胺的化學結構Fig.1 Chemical structure of metazachlor [2-chloro-N-(pyrazol-1-ylmethyl) acet-2’, 6’-xylidide]

1.2 分析方法

在泥炭土樣品中，測定了以下特性：（1）使用電位滴定法（Tan，2005）測量1∶2.5（w/v）土壤∶水懸浮液和1 mol/dm3KCl溶液中的pH值；（2）測量在馬弗爐溫度為500～550 ℃時的灰分含量；（3）使用分光光度法（Or?ow等，1969）測量有機碳含量（Corg）；（4）使用LECO CNS 2000自動分析儀（Leco，1996）測得全氮含量（Ntot）。

在VARIOEL III分析儀上進行C、H、N元素的分析。在分析前，HA樣品在105 ℃風干。原子比率在無灰和無水的基礎上表示。氧的百分含量是用100%減去C、H、N的總和。

測定了在含和不含吡唑草胺的0.01 mol/L NaOH溶液中分散的HA粒子的流體力學直徑（dh）范圍為0.6～6000 nm。該研究采用動態光散射（DLS）方法，用的是ZetaSizer Nano ZS裝置，該裝置配備了He-Ne激光器（633 nm）。背向光散射技術（173°）被使用（Zetasizer Nano系列用戶手冊，2004）。在20 ℃條件下，通過使用“粒度和電位”的毛細管池進行3次重復測量，共12次。

這種方法的局限性在于大顆粒掩蓋了多分散樣品中小顆粒的存在。散射光的強度與小于激光波長的粒子半徑的六次方成反比。因此，較大的粒子比較小的粒子散射光更強（Filella等，1997）。

使用SPECORD UV-VIS M-42進行紫外可見分光光度測量，SPECORD UV-VIS M-42是一種計算機輔助雙光束分光光度計，由Carl Zeiss Jena提供START軟件。在測量前，每個溶液都要經過一個0.45 μm注射器式過濾器。使用1cm寬的比色皿。將HA制劑溶于0.01 mol/L NaOH溶液中。0.01 mol/L NaOH溶液作為參比。加入吡唑草胺前后，HA溶液光度法測得碳濃度為0.005 mg C/mL。HA溶液中吡唑草胺的濃度為0.45 mg/mL。

HA溶液的DL測量時使用了激發和延遲連續裝置。這套裝置是由波蘭什切青市西波美拉尼亞科技大學的物理和農業物理系開發的。專用光敏流動比色皿是該裝置的主要和最重要的組成部分。它們可以同時連續記錄激發和DL（Prokowski，2009，Pat，2003）。

所研究的溶液被放置在一個容器中，內容物流過一起暴露在光線下的一個測量比色皿。比色皿通過可移動照明器暴露在單色光下。然后，溶液流過測量比色皿并返回到容器中，而蠕動泵維持溶液的流動。

用藍光（465～485 nm）和紅光（620～630 nm）誘導HA溶液的DL，輻照光子通量密度為1500 [μmol（quantum）PAR/m2s]。激發后從0.10～0.35 s記錄DL。在185～850 nm的光譜范圍內測量DL強度。在碳含量為30 mg C/L的0.01 mol/L NaOH、25 ℃的溫度下，分別對不含和含吡唑草胺的HA溶液進行DL測量。HA溶液中吡唑草胺的濃度為450 mg /L。

所有HA除草劑體系的測定均在24 h后進行。

2 結果與討論

基于其形態和化學性質，研究的泥炭土可分為以下幾類：（1）強分解的高腐有機土，（2）較強分解的高腐有機土，（3）中分解的半腐有機土，（4）較弱分解的半腐半纖維有機土，以及（5）弱分解的纖維有機土。

所研究泥炭土樣品的選定化學參數數據如表1所示。研究結果表明，泥炭土的全氮、有機碳含量、pH和C/N值各不相同，最有可能是在泥炭沉積中發生轉化的強度和方向不同造成的。

表1 所研究泥炭土樣品選定的化學參數Tab.1 The selected chemical parameters of studied peat soils samples

HA是由特定結構發展而來的異型化合物的組合。因此，檢驗它們化學組成的分析方法能夠確定它們的結構的某些部分官能團的近似含量；有時，后者會出現重大錯誤。用特定元素的量和原子百分比結構表示HA組成是描述和比較不同來源HA最常用的方法。H/C和C/N比率的計算和比較提供了有關HA分子中芳香族、脂肪族和雜環體系之間比例的信息（Gieguzynska等，2009）。表2中報告了所研究HA樣品的元素組成、原子比和內氧化。結果表明，所研究的HA樣品的元素組成是從泥炭土中分離出的HA的特征（Szajdak等，2007，2016；Huang等，2012）。

表2 所研究HA樣品的元素組成、原子比和內氧化Tab.2 Elemental composition, atomic ratio, and internal oxidation of studied HA samples

根據H/C比，我們可以估計HA分子的“芳構化率”。H/C值越低，HA分子的“芳構化率”越高。所研究的HA樣品的H/C原子比在1.03～1.36之間（表2）。根據van Krevelen（1950），H/C原子比從0.7到1.5對應于芳香體系與脂肪鏈耦合，并包含多達10個碳原子。

Kumada（1987）用C/N比作為有機質分解程度的指標。HA5樣品C/N值最高，HA3樣品最低。C/N的差異和H/C的差異表明，N含量是鑒別HA樣品的主要因素。

根據元素組成和Kumada（1987）的規定，內氧化值（CQ）根據以下方程式CQ = [4C/（4C+H+3N-2O）]進行計算。內氧化反映了基于總碳含量的HA分子中C-H鍵和所有C-X鍵（X-電負性雜原子）之間的比例（Gieguzynska等，2009）。HA2樣品CQ值最高，HA5樣品CQ值最低（表2）。

Szajdak等（2007；2016）的研究表明，泥炭HA的元素組成取決于泥炭地的植物學性質。

紫外-可見光譜法是近年來應用于HA性質測定的一種簡便無損的方法。由此產生的HA吸收光譜是單調的，非特征的，彼此非常相似的（Kumada，1987；Stevenson，1994）。為此，我們采用A465/A665比值計算得到的E465/665光譜系數（E4/6）。該比值主要與HA分子的大小及其分子量、HA芳香核碳含量和HA脂肪碳含量與總碳的比值呈負相關（Chen等，1977）。

得到的光譜系數E4/6的取值范圍為7.9～18.8（圖2）。E4/6系數最低的HA2樣品粒徑最大，E4/6系數最高的HA3樣品粒徑最小。在HA溶液中加入吡唑草胺后，E4/6系數降低了33%～72%。在HA溶液中加入吡唑草胺后，不同樣品的E4/6系數之間無顯著差異。Terschalk等（2004）同樣沒有發現HA的E4/6系數與菲的吸附之間有統計學上顯著的相關性。

HA具有兩親性，這就是為什么它們在水溶液中自發形成膠束狀結構的原因（Palmer等，2001；Chilom等，2009）。大量研究表 明，HA聚集的程度和類型與HA組分、pH、離子強度、電解質類型和溫度有關（Palmer等，2001；Terashima等，2004；Chilom等，2009；Wang等，2013）。加入吡唑草胺的腐植酸溶液的dh的取值范圍為133.2～218.6 nm（圖2）。結果表明，HA3樣品的dh最小，而HA5樣品的dh最大。在HA溶液中加入吡唑草胺可使dh降低4%～32%。HA5樣品的dh變化最大，表現為氮氧含量最低，CQ值最低，C/N值最高。

圖2 所研究腐植酸溶液和加入吡唑草胺后的E4/6（a）和dh（b）Fig.2 Values of E4/6 (a) and dh (b) of studied humic acids solutions and after adding of metazachlor

HA表現出DL的電磁輻射能力（Bejger等，2011；Mielnik，2013）。Mielnik（2009，2013）和Prokowski等（2012）研究表明，HA溶液的DL強度取決于激發光的波長以及這些物質分子中活性中心（發光體）的數量和質量。HS是多酚-氮縮聚物，含氮縮聚物在總電荷不變的情況下，具有接受π電荷和去除σ電荷的能力，因而具有分子內能量傳遞的可能。由于HA分子中雙鍵的存在，能量傳輸也是可能的（Lakowicz，2006）。

圖3為加入吡唑草胺后HA溶液在藍光（a）和紅光（b）照射下的DL強度值，輻照光子通量密度為1500 [μmol（quantum）PAR/m2s]。在所研究的HA中，HA2樣品在藍光和紅光的刺激下，DL強度均最高。根據Mielnik（2009）的研究，HA2分子中存在更多的脂肪族官能團，從而增加了DL強度。

圖3 藍（a）和紅（b）光所研究腐植酸溶液和加入吡唑草胺后的延遲發光強度（IDL）的數值Fig.3 Values of delayed luminescence intensity (IDL) of studied humic acids solutions and after adding of metazachlor induced by blue (a) and red (b) light

結果表明，藍光（更高的能級Ehν=2.69 eV）激發的HA溶液（含或不含吡唑草胺）比紅光激發的HA溶液具有更高的DL強度。除HA2樣品中加入吡唑草胺降低了DL強度外，在HA溶液中加入吡唑草胺提高了藍光誘導的DL強度。在HA3、HA4和HA5樣品中加入吡唑草胺后，在紅光激發下HA溶液DL強度增加，而在HA1和HA2樣品中，DL強度降低。

在加入吡唑草胺后，在藍光和紅光的激發下，HA2樣品的DL強度變化最大，表現為粒徑最大，氧含量和CQ值最高，“芳構化率”最低。

3 結論

E4/6系數測得的HA分子粒徑對相同比例測得的HA吡唑草胺體系的粒徑沒有影響。

延遲發光具有簡單、快速、靈敏等優點，具有重要的應用價值。此外，與化學方法相比，結果顯示誤差較小。該方法可提供有關HA的結構和性質及它們的光反應性信息。利用延遲發光技術研究HA與農藥的相互作用，可更好地了解HA發光特性。

參考文獻（略）