基于特異性PCR的梅花鹿茸和馬鹿茸區分

黃家樂，莫惠鳳，羅沛豪，馬惠儀

香港特別行政區政府衛生署 中醫藥規管辦公室 政府中藥檢測中心，香港特別行政區

根據《中華人民共和國藥典》2020 年版，鹿茸是鹿科梅花鹿和馬鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，其混淆品部分來自馴鹿、水鹿、麋鹿等[2-3]。性狀鑒別和顯微鑒別可快速鑒別鹿茸原藥材[4-5]，但對部分缺失性狀特征的鹿茸制品存在局限性。DNA 鑒別技術分辨能力強，尤其適用于動物類藥材或近緣物種的鑒別。目前的DNA 技術中，特異性聚合酶鏈式反應（PCR）所涉及的分析儀器少，操作容易且有明確的判定準則，利于檢測業界采用和中藥業界納入其質量控制流程，以確保藥材貨源的正確性和生產中投料的規范性。本研究旨在開發及驗證一種基于特異性PCR 技術區分鹿茸正品梅花鹿和馬鹿的篩選方法，能有效補充現行鹿茸鑒別法，為相關標準化檢測流程的建立及質量控制系統的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Heraeus Megafuge 8R 型離心儀、NanoDrop One型微量核酸濃度測定儀、ProFlex 型PCR 儀（美國Thermo Scientific 公司）；MM400 型球磨儀（德國Retsch 公司）；Thermomixer C 型恒溫混合器（德國Eppendorf 公司）；QIAsymphony SP 型全自動樣品純化儀、QIAxcel 型全自動核酸蛋白分析儀（德國Qiagen 公司）；Matrix A 型組織研磨管（美國MPBio公司）。

1.2 試藥

蛋白酶K、QIAsymphony DNA Investigator Kit、QIAxcel DNA High Resolution Kits、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、QX DNA Size Marker（德國Qiagen公司）；Platinum?TaqDNA 聚合酶（美國Thermo Sicentific 公司）；自定義引物（比利時Eurogentec 公司和美國Thermo Sicentific 公司）；二硫蘇糖醇（DTT，美國Sigma 公司）；GelRed 核酸染劑（美國Biotium公司）。

馬鹿茸、梅花鹿茸及鹿茸混淆品共43 份樣品，收集自北京、吉林、遼寧、新疆、江蘇、海南、山西和香港等地，樣品由首都醫科大學趙奎君研究員及香港科技大學畢丹和徐紅研究員鑒定。香港市面流通的鹿類幼角切片、鹿筋、鹿鞭、鹿肉及食用家畜樣品共25 份。其他動物、植物和真菌類樣品共5 份，購自中國食品藥品檢定研究院。4份魚肉樣品來自英國FAPAS?實驗室能力測試計劃。所有樣品都經DNA 測序，利用BLAST 程序與美國國家生物技術信息中心（NCBI）所收載的cytochrome c oxidase subunit 1（CO Ⅰ）、cytochrome b 和16S ribosomal RNA 序列進行比對，確定其來源。樣品保存于香港特別行政區政府衛生署政府中藥檢測中心，見表1。

2 方法與結果

2.1 引物設計

從NCBI 的Nucleotide Database 下載梅花鹿Cervus nipponTemminck、馬鹿C.elaphusLinnaeus、水鹿Sambar unicolorKerr、麋鹿Elaphus davidianusMilne-Edwards 和馴鹿Rangifer tarandusLinnaeus 共87 份線粒體基因組DNA 序列（表2），使用MUSCLE[6]進行多重序列比對，分別以梅花鹿或馬鹿作為比較對象，在BioEdit[7]上尋找特異性單核苷酸多態性（SNP）位點，設計引物后導入Primer 3[8]分析其物理特性，修正二聚體或發夾結構，最后合成引物。

表2 鹿類樣品線粒體基因組DNA序列

經多重序列比對后，找出梅花鹿和馬鹿的特異性位點。梅花鹿線粒體基因組序列DQ985076.1 和馬鹿線粒體基因組序列KT290948.1分別定為梅花鹿和馬鹿特異性引物設計參照，共設計了8 個梅花鹿（S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29）和1個馬鹿（S33）的特異性引物組合，其序列和物理特性見表3。

2.2 樣品研磨

按樣品采取下述2 種方法研磨：1）稱取樣品約1 g，剪切成約3 mm×6 mm×6 mm方塊后置于不銹鋼球磨罐，加入直徑15 mm 不銹鋼研磨球，用球磨儀在28 Hz 頻率下研磨5 min，稱取約50 mg 粉磨樣品于2 mL 平底離心管。2）若樣品體積小，稱取樣品約50 mg，經剪切后移入Matrix A研磨管中，放入球磨儀，在28 Hz頻率下研磨30 min。

2.3 DNA提取

利用QIAsymphony DNA Investigator Kit，在樣品、陽性對照和提取陰性對照的管中加入ATL緩沖液960 μL、20 mg·mL-1蛋白酶K 40 μL 和1 mol·L-1DTT 40 μL。漩渦混勻后，放入恒溫混合器，56 ℃、2000 r·min-1振蕩3 h 或過夜。16 000×g離心15 min，取上清液600 μL加入2 mL平底離心管中，上樣到全自動樣品純化儀，按照儀器說明書操作。利用NanoDrop One 型微量核酸濃度測定儀測定樣品總基因組DNA 質量濃度，以水調整其終質量濃度至約10 ng·μL-1。

2.4 引物篩選

按以下條件對表3 中的引物進行篩選。反應在200 μL離心管中進行，反應體系包括10×PlatinumTaqPCR緩沖液（不含Mg2+）2.5 μL、50.0 mmol·L-1Mg2+1.0μL、5.0 mmol·L-1dNTPs 1.0 μL、5.0 μmol·L-1正向引物2.0 μL、5.0 μmol·L-1反向引物2.0 μL、PlatinumTaqDNA聚合酶0.25 μL、DNA模板約20 ng，加無菌超純水至25 μL。PCR 反應參數為95 ℃預變性5 min，循環反應30次（94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。結果顯示，S22～S24和S29引物對梅花鹿和馬鹿樣品都產生強度相近的PCR 產物，表明這4 個引物組合不能分辨梅花鹿和馬鹿，因此被剔除。S25～S28、S33 的結果中，非目標品種出現比目標品種較弱的DNA條帶。

表3 梅花鹿和馬鹿PCR引物設計及其物理特性

考察不同的PCR條件對S25～S28、S33的擴增目標條帶的改進，包括PCR 緩沖液（Platinum?TaqPCR 緩沖液、Platinum ?TaqDNA Polymerase High Fidelity緩沖液）、Mg2+濃度（1.0～2.0 mmol·L-1）、Taq酶（Platinum?TaqDNA 聚合酶、Platinum?TaqHigh Fidelity 酶）、退火溫度（55～68 ℃）和循環次數（25～30 個循環）對擴增目標條帶的影響，選擇Platinum?TaqPCR 緩沖液、Platinum?TaqDNA 聚合酶、Mg2+最終濃度1.2 mmol·L-1、退火溫度63 ℃和循環次數30 為最適宜條件。S27 引物對梅花鹿樣品產生單一約223 bp 的條帶，而S33 對馬鹿樣品產生單一約248 bp 的條帶，而非目標品種均不會產生任何目標條帶，表明S27和S33能分別作為梅花鹿和馬鹿的特異性測試引物。因此，最終選擇S27和S33引物用于樣品DNA擴增。

2.5 PCR擴增

為更能反映引物組合所針對的目標品種，將S27 定名為CNIP-f/CNIP-r，而S33 定名為CELA-f/CELA-r，首4 字母是科學名縮寫，f 和r 代表引物方向。CNIP-f/CNIP-r 的目標區域位于DQ985076.1 的第110～332 位堿基，而CELA-f/CELA-r 位 于KT290948.1的第119～366位堿基，均屬于12S核糖體RNA。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 的PCR擴增條件見表4。

表4 鹿茸樣品的PCR擴增條件

2.6 電泳分析

按需求選擇下述電泳方法觀察PCR 擴增情況：1）瓊脂糖凝膠電泳，體系為1.5%凝膠濃度、0.5%TBE 緩沖液、GelRed 核酸染色、紫外透射儀上觀察電泳結果。2）自動化電泳系統，利用QIAxcel DNA High Resolution Kit在QIAxcel Advanced System分析電泳結果。

2.7 方法學驗證

2.7.1考察樣品DNA 樣品DNA 模板需進行UnivP/UnivQ 的PCR 擴增和電泳分析，獲得1 條約104 bp的條帶才會被采用。

2.7.2重復性 以對應品種的3 份樣品A、B 和C進行重復測試，其中A 抽取9份重復樣品，B和C各抽取3 份，即合共15 份，按2.5項下條件擴增分析，比較15份重復樣品的PCR 擴增情況。所有重復樣品都應出現對應品種的特異性條帶。結果表明，15 個梅花鹿茸重復樣品在CNIP-f/CNIP-r 的PCR 反應中，均產出梅花鹿特異性條帶。15 個馬鹿茸重復樣品，在CELA-f/CELA-r 的PCR 反應亦擴增了馬鹿特異性條帶，說明方法重復性良好。

2.7.3重現性 共進行3 次測試，每次測試的操作人員、儀器及測試日期的組合不相同。3 次測試都采用同一份的對應品種的樣品，每次抽取3 份重復樣本，按2.5項下條件擴增分析，比較3次測試中共9 份重復樣品的PCR 擴增情況。所有重復樣品都應出現特異性條帶。結果表明，在不同的操作人員、時間、儀器的組合下，對CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 各進行3 次測試，9 個梅花鹿茸重復樣品均得到梅花鹿特異性條帶，9 個馬鹿茸重復樣品獲得馬鹿特異性條帶。

2.7.4檢測限 以對應品種的1 份樣品抽取8 份重復樣品，按2.3項下方法進行DNA 提取，用水將DNA 模板質量濃度調至10 ng·μL-1。再以水進行10倍序列稀釋，得到10.0、1.0、0.1 ng·μL-1和10、1 pg·μL-1共5 個質量濃度，按2.5項下條件擴增分析，找出最低可被擴增的DNA 模板質量濃度。結果表明，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 檢測限均為10 ng·μL-1，而其余質量濃度均不能檢出。

2.7.5專屬性 利用鹿科動物樣品作測試，包括目標品種和非目標品種，所采用的鹿類樣品包括19 份梅花鹿茸、20份馬鹿茸、2份水鹿的幼角和2份麋鹿角，每份樣本抽取2份重復樣品進行測試，按2.5項下條件擴增分析，CNIP-f/CNIP-r 的測試結果表明，19 份梅花鹿茸樣品都檢出梅花鹿特異性條帶，而其他樣品沒有可觀察的DNA 條帶。CELA-f/CELA-r 測試中的20 份馬鹿茸樣品都獲得馬鹿特異性條帶，其余樣品皆為陰性。

2.7.6假陽性 利用非鹿科動物、食用家畜、植物和真菌樣品作測試，包括水牛、黃牛、綿羊、豬、雞、大頭鱈、無須鱈、綠青鱈、大西洋鱈、刺五加、馬鞭草、葛和靈芝。每份樣品抽取2 份重復樣品進行測試。CNIP-f/CNIP-r 的測試結果表明，梅花鹿茸樣品檢出梅花鹿特異性條帶，而其他樣品沒有可察的DNA 條帶。CELA-f/CELA-r 測試中的馬鹿茸樣品都獲得馬鹿特異性條帶，其余樣品皆為陰性。

2.7.7可行性 在香港市場收集鹿茸及其他鹿類產品21 份，包括9 份馬鹿茸切片、5 份馴鹿幼角切片、1份白唇鹿角切片、4份馬鹿筋、1份馬鹿鞭和1份梅花鹿肉干，每份樣本抽取2 份重復樣品進行測試，按照按2.5項下條件擴增分析，考察方法的適用性。結果表明，CNIP-f/CNIP-r 測試中梅花鹿肉干樣品出現梅花鹿特異性條帶，而CELA-f/CELA-r 能篩選出馬鹿茸切片、馬鹿筋和馬鹿鞭，與DNA 測序的結論一致。

2.7.8實驗室間比對 委托獨立實驗所進行實驗室間比對工作，共同驗證測試方法，確保實驗操作的規范性和結果的一致性。各實驗室對同一樣本的共同驗證特異性PCR 結果應一致。實驗室間比對結果表明，參與比對的實驗室所得的結果相同，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 能區分梅花鹿和馬鹿。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 引物對梅花鹿、馬鹿和其他混淆品的電泳結果見圖1～6。

圖1 梅花鹿的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖2 馬鹿的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖3 其他鹿科動物的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖4 梅花鹿的CELA-f/CELA-r電泳圖

圖5 馬鹿的CELA-f/CELA-r電泳圖

圖6 其他鹿科動物的CELA-f/CELA-r電泳圖

2.8 混合樣品研究

對混合來源的鹿樣品進行研究。配制3 組等質量混合樣品，包括梅花鹿和馬鹿混合樣品、梅花鹿和馴鹿混合樣品、馬鹿和馴鹿混合樣品。提取模板DNA后，利用CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r進行測試。結果顯示，CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r均能檢出目標品種，且不受其他鹿品種影響（圖7～8）。

圖7 混合樣品的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖8 混合樣品的CELA-f/CELA-r電泳圖

3 討論

目前已發表的鹿茸DNA 鑒別方法有特異性PCR[9-12]、PCR 限制性內切酶片段[13]、實時熒光定量PCR[14]、多重PCR[15]、熔解曲線分析[16]、隨機擴增DNA[17]、DNA 條形碼[18-20]等，都證明DNA 技術能有效鑒別鹿茸。相對上述研究，本實驗所建立的篩選方法有4 個特點：1）能篩選源自梅花鹿和馬鹿的鹿茸飲片和鹿制品。基于梅花鹿和馬鹿同為鹿茸的來源品種[1]，有2 種可行的設計方案。第一種方案是同時檢驗出梅花鹿和馬鹿，優點是操作較簡單。第二種方案是分別針對梅花鹿和馬鹿進行檢測，優點是可明確區分梅花鹿和馬鹿。考慮到梅花鹿茸的市價明顯高于馬鹿茸，所以本篩選方法取第二種方案。2）已通過了一系列的方法學驗證測試，實驗室間比對結果亦表明方法可靠。3）設有動物類DNA 模板的質量控制。UnivP/UnivQ 的目標區域是線粒體16S rRNA 上的保守位置，對動物類基因組具有廣譜性，加上PCR 產物長度只有104 bp，符合作為質量控制的先決條件，確定可從樣本中提取出的動物源DNA，其PCR 擴增情況能作為篩選結果的佐證。4）CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r采用相同的PCR 試劑配方和反應條件，可減省工序。本篩選方法已上載到香港特別行政區政府衛生署的網站供參考（https://www.cmro.gov.hk/html/gb/GCMTI/gcmti_dnamethod.html）。

建立方法時，引物設計應遵循3 條準則：1）限制PCR 擴增物于200～350 bp，有助于提升PCR 成功率。因中藥材的基因組DNA 大多已被降解，理論上越短的PCR產物越容易被擴增。2）將特異性SNP位點置于引物3′的最末端。在PCR 的延伸過程中，未能互補的3′端會影響5′至3′聚合酶活性，令引物具有區分目標物種和非目標物種的能力。3）若目標品種在引物3′端的第三和第四個堿基位置出現種內變異，將該位置轉為簡并堿基，避免因堿基不互補而降低PCR 產物，減損檢測靈敏度。根據下載的梅花鹿和馬鹿的線粒體基因組序列排序結果，發現兩者的種內的變異大，穩定的特異性SNP 位點不多，局限了引物設計，按上述3 條準則，最終只能設計出1 個馬鹿引物組合，并需為3′末端的第三和第四個堿基轉為簡并堿基。檢測限測試中，DNA 質量濃度梯度設定為0.001～10 ng·μL-1，測試結果顯示最低質量濃度為10 ng·μL-1，即檢測上限，較合適的設定應為50.0、20.0、10.0、1.0、0.1 ng·μL-1。

為獲得可靠的結果，使用本篩選方法時應注意：1）加入陽性對照和提取陰性對照；2）在PCR 反應中加入PCR陰性對照；3）以UnivP/UnivQ的PCR擴增作為質量控制；4）確保DNA 模板量達到方法要求。關于第四點，在方法學驗證的可行性測試中，已表明本方法不僅能篩選鹿茸，亦適用于鹿筋、鹿肉干和鹿鞭，本方法的檢測限為10 ng·μL-1，操作人員應評估某些部位，如毛發的DNA 模板量能否滿足相關要求。若樣品不符合最低要求，或需要進一步確定本方法的篩選結果，可按檢測目的采用其他鑒別方法作為互補，如鑒別動物類藥材的DNA 條形碼檢測法。

已有文獻證實，DNA 技術能應用于混合來源藥材。賈靜等[21]對市售鹿茸粉進行DNA 條形碼檢測，發現當中3 份樣本的COⅠ測序峰圖雜合度較高，重新測序前利用分子克隆方法得到單一來源序列，以解決因存在多于1 種COⅠ序列而令測序峰圖雜亂，導致無法作出判斷的問題，結果表明，該3 份樣本均含多于1 種的鹿品種或類群。本課題組嘗試利用本方法對混合來源的鹿樣品進行篩選，初步發現CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 均能檢出目標品種，且不受其他鹿品種影響。但本方法的適用范圍是篩選單一來源的鹿類樣品，是否同樣適用于混合來源樣品需進行方法學驗證測試。