金針菇蛋白聚糖對脂多糖誘導的Caco-2/RAW264.7細胞共培養模型炎癥的抑制作用

蘇安祥，胡 燁，胡秋輝，徐 輝，劉建輝，謝旻皓，裴 斐，楊文建*

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

腸道性炎癥包括結腸炎和直腸炎，近年來其發病率不斷升高，嚴重影響人們的身體健康和日常生活。腸道性炎癥的產生和發展與飲食結構、精神壓力、生活習慣有關[1-2]。從飲食方面入手，篩選有抑制炎癥作用的食物成分、調節膳食組成是預防和控制腸道炎癥的可行途徑。文獻報道顯示，大蒜素[3-4]、乳鐵蛋白[5]、白藜蘆醇[6]、人參水溶性膳食纖維[7]、金針菇多糖[8]、藍莓花色苷[9]、靈芝多糖[10]、松仁多糖[11]、百合多糖[12]等均對腸道炎癥有抑制作用。食用菌功能成分的生物活性已被廣泛證實[13]，多糖被發現具有可控制病毒感染[14]、增強免疫應答[15]等生物活性功能。靈芝蛋白聚糖作為一種復雜的糖復合物，當其直接作用于癌細胞時或作用于免疫細胞時，可通過刺激細胞釋放因子，從而抑制腫瘤細胞的增殖，表現出抗腫瘤活性；而蛋白聚糖作用于免疫細胞時，同樣通過抑制一氧化氮（nitrite oxide，NO）的釋放，同時抑制細胞釋放細胞因子（白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、下調腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）等），達到抗炎效果，有效減緩炎癥[16]。本課題組前期對金針菇的功能成分進行了系統的分析研究，闡明了金針菇多糖、金針菇多酚等成分的功能作用[17-19]。本實驗通過分離純化得到金針菇蛋白聚糖（Flarnmulina velutipesproteoglycans，FPG）1-1，擬從細胞水平探討其對腸道炎癥的生物活性。

Caco-2細胞來源于人結腸腺癌細胞，具有微絨毛結構，能夠生產小腸刷狀緣上皮相關的酶，細胞培養成熟后可形成完整的細胞單層膜，其結構和功能類似于小腸上皮細胞，是國際上公認的研究小腸上皮細胞吸收和轉運等功能的最佳模型之一[20]。Caco-2細胞容易在體外培養，穩定性好，實驗重現性高，與動物實驗相比具有容易操作、耗費時間少、需要的樣品量小等優點，被廣泛應用于體外活性快速篩選、腸道相關問題的科學研究[21]。但是僅用Caco-2細胞難以有效模擬體內微環境，特別是細胞與細胞之間的相互作用。近年來研究發現，腸上皮細胞與免疫細胞之間具有精細的對話機制，腸上皮細胞通過信號傳導調節免疫細胞細胞因子等物質的分泌，從而改善腸道健康[22]。Caco-2細胞和免疫細胞（巨噬細胞RAW264.7）共培養技術可以彌補Caco-2細胞單培養在模擬體內微環境上的不足，有助于系統探討生物活性物質對腸道上皮細胞的屏障作用、腸黏膜上皮細胞與免疫細胞的對話機制[22]。

本實驗以來源于金針菇的蛋白聚糖為原料，建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的Caco-2細胞、巨噬細胞RAW264.7共培養炎癥模型，測定NO、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及細胞因子水平等指標，以分析FPG1-1對炎癥抑制的作用，為金針菇功能成分的開發和利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FPG1-1根據文獻報道方法[23]分離純化獲得。人克隆結腸腺癌細胞（Caco-2）和小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）購于復旦大學生物醫學研究院細胞資源中心。

LPS、DMEM高糖培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶 美國Gibco生物科技公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、NO、ROS等試劑盒 碧云天生物技術研究所；IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10等酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 南京建成生物工程生物研究所。

1.2 儀器與設備

生物安全柜、8000系列二氧化碳細胞培養箱、超低溫冰箱、Barnstead GenPure xCAD超純水儀 美國Thermo Fisher公司；酶標儀 美國Molecular Devices公司；倒置式生物顯微鏡 北京Precise儀器有限公司；高壓滅菌鍋 日本Tomy Koqyo公司；RES-2電阻儀德國Millicell公司；DM2500 LED熒光顯微鏡 德國Leica公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；Transwell培養皿 美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

由10%胎牛血清、0.5%青鏈霉素與DMEM配制細胞培養液，將Caco-2或RAW264.7細胞接種至含完全培養液T25細胞培養瓶中，置于細胞培養箱中培養（37 ℃、5% CO2）。當細胞增殖至80%時進行傳代，用3 mL PBS洗滌兩次。加入3 mL培養液并吹打細胞，使其脫落，轉移至15 mL離心管中，離心（37 ℃、1 000 r/min、5 min），去除上清，加1 mL完全培養液吹打成細胞懸浮液。吸取0.5 mL細胞懸液加入到T25培養瓶，然后加10 mL完全培養液，于恒溫培養箱中培養[24]。

1.3.2 細胞增殖率的測定

使用MTT法測定FPG1-1對RAW264.7的細胞毒性作用。RAW264.7細胞在96 孔板中37 ℃孵育24 h后，用PBS洗滌數次。對照組（含RAW264.7細胞）和空白組（不含RAW264.7細胞）分別加入200 μL DMEM，各處理組加入等體積不同質量濃度（25、50、75、100、150、200 μg/mL）的樣品，每組設置6 個平行，孵育24 h后，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）并在37 ℃培養基中孵育4 h。去除MTT溶液后每孔加入100 μL DMSO。將96 孔板置于恒溫振蕩器上室溫振蕩20 min后，測定波長570 nm處吸光度，按照式（1）計算細胞增殖率。

式中：A1表示處理組吸光度；A2表示對照組吸光度；A0表示空白組吸光度。

1.3.3 Caco-2細胞單層細胞模型的建立

培養的Caco-2細胞消化離心后制備細胞懸浮液，按照Transwell實驗使用方法，在Transwell小室和下室中均加入培養基，Caco-2細胞接種于Transwell小室，使細胞終濃度為2.5×105個/mL，第一周每2 d更換一次Transwell小室和下室細胞培養基，第2、3周每天更換培養基[24]。以跨膜電阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）和細胞形態評估單層細胞的形成情況，步驟參照方法1.3.4節和1.3.5節。

1.3.4 Caco-2細胞單層細胞模型跨膜電阻的測定

Caco-2細胞單層跨膜電阻值（trans-epithelial electrical resistance，TEER）采用電阻儀每天測定電阻，并根據公式（2）計算TEER。其中空白組為未接種細胞的孔，樣品組為接種細胞的孔。

式中：Rs為樣品組的電阻值/Ω；Ra為空白組的電阻值/Ω；S為孔板的膜面積/cm2。

1.3.5 細胞形態學觀察

使用倒置光學顯微鏡觀察細胞形態并拍照。

1.3.6 Caco-2細胞和RAW264.7巨噬細胞共培養模型建立

參考文獻[25]的方法并稍作修改。通過形態學觀察，Caco-2細胞單層細胞模型培養合格后，去除下室培養液，PBS清洗3 次，將培養的RAW264.7巨噬細胞懸液接種于下室，加入培養基使下室RAW264.7巨噬細胞密度為1×105個/mL。

實驗分組：對照組小室和下室以無血清培養基孵育；模型組小室加入無血清培養基，下室加入LPS，使其質量濃度為10 μg/mL；蛋白聚糖處理組下室加入LPS（終質量濃度10 μg/mL）處理4 h后，小室分別加入終質量濃度25、50、100、200 μg/mL的蛋白聚糖，孵育12 h。每組樣品設置5 個平行實驗。

1.3.7 NO濃度的測定

按照NO試劑盒操作說明進行測定。根據公式（3）計算NO含量。

式中：An為樣品組吸光度；A0為空白組吸光度；A為標準品組吸光度；c為標準品濃度（100 μmol/L）；N為樣品測試前稀釋倍數。

1.3.8 ROS相對水平的測定

參考文獻[26]報道的方法，利用二氯熒光乙酰乙酸鹽（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針法檢測細胞ROS水平。按照ROS測試試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測熒光強度，并根據公式（4）計算ROS相對水平。

式中：Bn為各處理組熒光強度值；B0對照組熒光強度值。

1.3.9 細胞因子質量濃度的測定

按照ELISA試劑盒操作說明，測定IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10細胞因子質量濃度。

1.4 數據統計分析

數據結果以平均值±標準差表示，采用SPSS軟件對實驗數據進行統計分析，以One-Way ANOVA進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

采用MTT法研究FPG1-1對巨噬細胞活力的影響。細胞增殖率可用來反映細胞生長分裂情況，常用來指示樣品對細胞活性的影響，以確定適用于細胞實驗的樣品質量濃度。定義對照組測得的細胞增殖率為100%，測得質量濃度為25、50、75、100、150、200 μg/mL的FPG1-1樣品處理后的細胞增殖率分別為（96.13±2.47）%、（91.34±2.19）%、（90.01±2.06）%、（91.65±3.24）%、（89.74±4.79）%和（88.26±2.21）%，增殖率均高于80%，這些質量濃度遠高于半數抑制質量濃度（half-maximal inhibitory concerntration，IC50），但是FPG1-1質量濃度為200 μg/mL時，細胞增殖率顯著降低（P＜0.05）（圖1）。由此可知當FPG1-1處理濃度低于200 μg/mL時，對小鼠巨噬細胞活性無顯著影響且毒性作用低，可用于細胞實驗。為了保證所選的樣品質量濃度范圍大，同時減少實驗組數，因此選取FPG1-1質量濃度25、50、100、200 μg/mL作為樣品處理質量濃度進行后續研究。

圖1 FPG1-1對RAW264.7細胞增殖率的影響Fig.1 Effect of FPG1-1 on viability of RAW264.7 cells

2.2 Caco-2細胞單層細胞模型的建立

Caco-2細胞結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，其結構與人小腸上皮細胞類似，可用作腸道轉運模型[27-28]。培養過程Caco-2細胞單層細胞模型TEER的變化如圖2所示，TEER是一種反映Caco-2細胞單層完整性的指標，TEER與細胞單層通透性呈負相關關系，與細胞單層完整性、致密性呈正相關關系，其變化可以反映細胞單層結構的形成情況，可通過測量Caco-2單層的TEER來判斷單層Caco-2細胞的完整性。結果顯示TEER整體上呈“S”型增長，Transwell中的Caco-2細胞在培養1～4 d內TEER升高緩慢（低于100 Ω·cm2）；5～11 d內TEER升高迅速；12～15 d內TEER繼續升高，但增速降低，該范圍內TEER超過400 Ω·cm2，第15天時TEER已在500 Ω·cm2左右。16～22 d，TEER變化不明顯，趨于穩定，處于500～550 Ω·cm2范圍內，說明15 d時細胞已形成完整的致密單層，單層細胞模型建立成功。此結果與丁濤[29]、余自成[30]等的研究結果一致。

圖2 Caco-2細胞單層細胞模型TEERFig.2 Transepithelial electrical resistance (TEER) of Caco-2 cell monolayer model as a function of culture time

結合細胞形態學觀察進一步確定單層細胞完整性形成情況，如圖3所示，觀察不同培養時間下的Caco-2細胞（Transwell小室）形態。Caco-2細胞接種到培養板培養8 d后，貼壁生長的Caco-2細胞繁殖，細胞呈現不規則形狀，單細胞層開始逐漸連接形成片狀，18 d后細胞結合緊密，已形成完整的細胞單層，此時Caco-2細胞開始出現成熟腸道黏膜上皮細胞的結構特征，此時細胞單層結構完整性好，適于進一步實驗。

圖3 培養時間對Caco-2單層細胞形態的影響（×20）Fig.3 Effect of culture time on Caco-2 monolayer cell morphology (× 20)

2.3 FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7 NO分泌的影響

有研究報道NO參與免疫應答相關的生理過程，是巨噬細胞殺傷病原微生物的主要效應分子之一[31]。NO的分泌水平可以表征細胞狀態，巨噬細胞通過釋放細胞因子，積極參與炎癥反應。如圖4所示，LPS處理極顯著增加了細胞中NO的生成量，而經FPG1-1處理后細胞中的NO濃度顯著降低，并顯示出劑量依賴性，NO濃度隨著FPG1-1處理質量濃度的升高而下降，200 μg/mL FPG1-1處理后的細胞內NO濃度為（16.23±1.46）μmol/L，極顯著低于LPS模型組。由此推測，FPG1-1可能通過抑制NO分泌，保護Caco-2細胞和RAW264.7細胞共培養模型，發揮抗炎作用，這與胡曉祎[22]的研究結果一致。

圖4 FPG1-1對RAW264.7細胞中NO生成量的影響Fig.4 Effect of FPG1-1 on NO production in RAW264.7 cells

2.4 FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7 ROS生成的影響

ROS包括超氧自由基、其衍生物過氧化氫和羥自由基等，通過檢測細胞內ROS水平可以反映生物體氧化損傷的程度。圖5為FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7 ROS生成的影響。結果顯示，LPS處理能顯著誘導RAW264.7細胞內ROS生成量提高（P＜0.01），FPG1-1處理會降低細胞內LPS導致的氧化應激產生ROS水平，經過不同質量濃度FPG1-1（25、50、100、200 μg/mL）處理后，細胞內ROS分泌量顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），并且FPG1-1干預質量濃度越高，ROS水平下降越多。FPG1-1質量濃度為200 μg/mL時，ROS相對水平降至102.68%。有研究報道，ROS促進腸道炎癥中的氧化應激，而ROS水平增加與疾病加重和惡化有關，炎性腸病實驗中，隨著ROS水平增加，內源性抗氧化物質的消耗和氧化應激標志物水平顯著增加，過量的ROS引起氧化應激，在體內產生氧化分解產物從而誘發炎癥，同時激活炎癥細胞去分泌促炎因子，導致氧化損傷[31]。另有研究顯示，ROS水平與細胞增殖密切相關，當ROS濃度過高時，會誘導細胞發生氧化應激反應，從而造成氧化損傷[32]。結合實驗結果可知，FPG1-1能夠有效降低ROS的產生，避免氧化應激，從而緩解細胞炎癥。

圖5 FPG1-1對RAW264.7細胞中ROS生成量的影響Fig.5 Effect of FPG1-1 on ROS production by RAW264.7 cells

2.5 FPG1-1對RAW264.7細胞因子水平的影響

為了研究FPG1-1對細胞炎癥抑制作用是否是通過調控細胞因子的分泌水平而實現，將不同質量濃度FPG1-1（25、50、100、200 μg/mL）作用于Caco-2細胞與RAW264.7細胞共培養模型，通過ELISA法測定細胞培養液中各細胞因子的水平。不同質量濃度的FPG1-1對細胞的IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10質量濃度的影響如圖6所示。經過25、50、100、200 μg/mL FPG1-1處理后，IL-6質量濃度分別為（10.46±1.01）、（10.12±0.90）、（8.88±1.32）、（8.48±0.31）ng/mL，模型組為（14.45±1.12）ng/mL，對照組為（9.93±1.34）ng/mL，FPG1-1處理組與模型組IL-6質量濃度有顯著性差異（P＜0.05），說明FPG1-1能顯著抑制炎癥因子IL-6的分泌。對于IL-10而言，25、50、100、200 μg/mL FPG1-1處理后其質量濃度分別為（189.75±4.62）、（221.40±18.39）、（290.36±36.14）、（329.15±25.12）ng/mL，模型組為（154.92±10.32）ng/mL，說明高質量濃度FPG1-1能有效促進抗炎細胞因子IL-10釋放。同時，與模型組相比，FPG1-1處理顯著降低IL-1β分泌（P＜0.05），極顯著降低TNF-α的生成量（P＜0.01）。研究顯示，免疫細胞在腸炎過程中分泌過量的促炎因子是腸道炎癥發展的重要因素之一，某些生物活性成分可抑制LPS誘導的小鼠細胞產生TNF-α，間接抑制IL-1β的合成表達，并抑制促炎細胞因子（如IL-6）的過度分泌，促進抗炎性細胞因子（IL-10）產生，從而緩解炎癥[33]。以上結果表明，FPG1-1的抗炎作用與抑制促炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6分泌和提高抗炎細胞因子IL-10分泌有關。

圖6 FPG1-1對RAW264.7細胞因子含量的影響Fig.6 Effect of FPG1-1 on cytokine secretion by RAW264.7 cells

3 結 論

本研究建立了Caco-2細胞和RAW264.7細胞共培養腸炎模型，分析FPG1-1的抗炎作用。利用NO釋放量表征巨噬細胞的炎癥活化狀態，與模型組相比，FPG1-1處理顯著降低了細胞NO、ROS水平（P＜0.05、P＜0.01），表明FPG1-1可顯著抑制NO、ROS分泌，保護細胞進而緩解氧化應激。ELISA測定細胞因子水平結果表明FPG1-1能上調IL-10和下調TNF-α、IL-1β、IL-6分泌。以上結果表明，FPG1-1可以作用于腸上皮細胞，通過上皮細胞與免疫細胞之間的相互作用，降低細胞NO、ROS水平，抑制炎癥細胞因子的分泌，發揮改善腸道炎癥的作用。下一步將通過動物實驗深入研究其在體內的作用效果及機制。