牡蠣多肽組分OE-I抗氧化活性及其對秀麗隱桿線蟲抗衰老作用

王 力，肖嵋方，陳弘培，劉 斌，曾 峰,*

（1.閩臺特色海洋食品加工及營養健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

衰老是一個由遺傳和環境共同介導的復雜生物過程，由多種因素如氧化應激、細胞凋亡和DNA損傷等引起[1]。在大多數情況下，與衰老有關的疾病和程序性細胞死亡主要由細胞氧化應激引起[2]。越來越多的證據表明，天然活性物質（如多肽）具有較強的抗氧化活性，可以提高機體內的抗氧化能力，減輕氧化損傷，并通過控制衰老過程中重要基因的表達和相關途徑的相互作用來延緩衰老，但目前鮮有具有明確抗衰老功效的藥物；因此，尋找抗衰老的天然活性物質對于延緩衰老具有十分重要的意義[3]。

牡蠣是海洋生態系統中的重要物種，對全世界的漁業和水產養殖業具有重大的經濟效益，在營養和藥用方面也體現出極高的價值，是我國衛生部公布的第一批藥食同源食品原料，含多種氨基酸、維生素，還富含鈣、磷、鐵、鋅、硒等營養成分，并具有治虛弱、解丹毒、降血壓、滋陰壯陽等功能[4]。福建省海洋貝類資源豐富，2016年海水貝類產量276.4×104t，占全省海水養殖產量的63.9%；養殖面積為82 389 hm2，占全省海水養殖面積的47.2%，而牡蠣是福建省沿海最重要的養殖貝類[5]。在本課題組前期研究中發現，牡蠣含有豐富的蛋白質，使用中性蛋白酶酶解牡蠣肉糜得到的牡蠣多肽具有較強的羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，表現出較強的抗氧化活性，能顯著增強小鼠體內抗氧化能力；此外，牡蠣多肽組分OE-I的結構鑒定結果發現其組分主要含有10 個肽序列[6]。Miao Jianyin等[7]探究復合蛋白酶酶解牡蠣肉（OM）的特性，用6 kDa超濾膜將牡蠣水解產物（OH）分離成OH-I（＜6 kDa）和OH-II（＞6 kDa）兩個組分，考察了OM、OH、OH-I和OH-II組分的抗氧化活性，并進一步分析了OH-I和OH-II的抗疲勞作用，結果表明，OH-I具有很強的抗氧化活性，與對照組相比，OH-I能顯著延長小鼠的游泳時間。Umayaparvathi等[8]使用SU12蛋白酶酶解牡蠣，發現酶解制備的抗氧化肽有較強的過氧化氫自由基清除活性和羥自由基清除活性，通過超高效液相色譜-質譜進一步純化活性肽段，共收集到7 種抗氧化肽，其中的SCAP 1、SCAP 3和SCAP 7這3 種多肽對DPPH自由基有很強的清除能力。宋文靜[9]發現用中性蛋白酶酶解的牡蠣蛋白和經Sephadex G-25凝膠柱分離純化后的組分均具有較好的DPPH自由基清除能力，并發現分離的牡蠣肽NA、NB組分對雙氧水誘導的LO2細胞氧化損傷有一定的保護作用。抗氧化肽的活性與其分子質量大小密切相關，分子質量較小的多肽活性相對較好，雖然已經有研究證實了牡蠣多肽的抗氧化作用，但是關于其體內抗氧化和延緩衰老的報道仍比較少，其作用機制尚不明晰，因此本實驗將對牡蠣多肽延緩衰老的機制作進一步研究。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種在生物醫藥領域應用廣泛的模式生物，具有生命周期短、繁殖能力強、飼養簡單、便于計數和觀察等特點，國際上公認為線蟲在抗氧化和延緩衰老研究領域中具有優勢[10-11]。Vayndorf等[12]研究了全蘋果提取物對線蟲壽命和體內抗脅迫能力的影響，結果表明，經全蘋果提取物處理后，線蟲的平均壽命和最長壽命均顯著延長，且具有劑量依賴性。金司儀[13]以秀麗隱桿線蟲為模式生物，探究了不同粒度的三七粉對線蟲壽命的影響，結果表明，三七粉可以延長線蟲的壽命，具有一定的抗衰老作用。本實驗以秀麗隱桿線蟲為模型，測定不同質量濃度的牡蠣多肽組分OE-I對線蟲正常情況下壽命、急性氧化應激情況下壽命和熱應激情況下壽命的影響，以及線蟲體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、細胞凋亡、體內抗氧化酶活力和相關基因表達水平的變化，對牡蠣多肽的抗氧化活性以及抗衰老的作用機制進行研究，以期為海洋生物資源的精深加工及抗衰老功能食品的研究與開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

野生N2型秀麗隱桿線蟲 福建上源生物科學技術有限公司。

牡蠣 福州市金山大潤發超市。

Western及細胞IP裂解液 上海碧云天生物技術公司；2’,7’-二乙酸二氯熒光素（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA） 中性蛋白酶（50 000 U/g）、VC、DPPH 北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；吖啶橙、鹽酸左旋咪唑、UNlQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Green染料法Mix 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機 日本久保田株式會社；人工氣候箱 上海一恒科學儀器有限公司；SpectraMax i3x酶標儀、ABI多功能聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、ABI7300實時熒光定量PCR儀 美國賽默飛公司；熒光顯微鏡 德國卡爾-蔡司股份公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣多肽的制備

稱取適量牡蠣肉糜，選用中性蛋白酶進行酶解，固液比（牡蠣肉糜/超純水）為1∶10，加酶量1 400 U/g（以牡蠣肉糜質量計），調節pH值為7.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間4.0 h，酶解結束后沸水浴滅酶，5 000 r/min離心30 min，分離上清液即為牡蠣酶解液（oyster enzymatic hydrolysate，OE），采用截留分子質量分別為10、5 kDa的超濾膜對酶解液進行分級，收集得到3 個組分OE-I（＜5 kDa）、OE-II（5～10 kDa）與OE-III（＞10 kDa）樣品，分別冷凍干燥，儲存備用[6]。

1.3.2 牡蠣多肽的體外抗氧化活性評價

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測定

取0.5 mL的DPPH溶液（0.4 mmol/L），分別加入0.5 mL不同質量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液并混勻，同時以VC作為陽性對照，以超純水代替樣品為空白組，以超純水代替DPPH溶液為對照組，在避光、室溫的條件下反應30 min，于517 nm波長處檢測其吸光度，每個質量濃度樣品做3 個平行。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對照組的吸光度。

1.3.2.2 羥自由基清除能力測定

取0.5 mL的FeSO4溶液（15 mmol/L）和1 mL不同質量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液混合，再加50 μL體積分數為0.03%的H2O2啟動反應，37 ℃孵育10 min，最后加入150 μL的水楊酸-乙醇溶液（20 mmol/L），在37 ℃反應30 min，在562 nm波長處測定的吸光度為A1，以超純水代替水楊酸-乙醇為對照組，所測定的吸光度為A2，以超純水代替樣品為空白組，所測定的吸光度為A0，以VC作為陽性對照，每個質量濃度樣品做3 個平行。按式（2）計算羥自由基清除率。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

取4.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2、50 mmol/L）分別與1 mL不同質量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液混合，25 ℃水浴中預熱20 min，再加入0.4 mL的鄰苯三酚溶液（25 mmol/L），混勻后于25 ℃水浴中反應5 min，最后加入1 mL的HCl溶液（8 mmol/L）終止反應，于325 nm波長處測定吸光度A1，以超純水代替鄰苯三酚溶液為對照組，所測定的吸光度為A2，以超純水代替樣品溶液為空白組，所測定的吸光度為A0，以VC作為陽性對照，每個質量濃度樣品做3 個平行。按式（3）計算超氧陰離子自由基清除率。

1.3.2.4 亞鐵離子螯合能力測定

取50 μL不同質量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液分別與185 μL的甲醇和5 μL的FeCl2溶液（2 mmol/L）混合，加入10 μL的菲啰嗪溶液（5 mmol/L）開始反應，在室溫下靜置10 min后，在562 nm波長處測其吸光度A1，以超純水代替菲啰嗪溶液為對照組，所測定的吸光度為A2，以超純水代替樣品溶液為空白組，所測定的吸光度為A0，以乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）為陽性對照，每個質量濃度樣品做3 個平行。按式（4）計算亞鐵離子螯合率。

1.3.3 線蟲同期化處理

挑選含有大量產卵期雌雄同體線蟲的培養基，用M9緩沖液（3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl溶解于1 L的超純水中，高壓滅菌后加入1 mL的1 mol/L MgSO4）吹洗培養基數次，使菌苔中附著的線蟲和蟲卵脫落，用滅菌的1.5 mL離心管收集含線蟲的洗液，加1 mL的M9緩沖液沖洗蟲體，1 000 r/min離心1 min棄上清液，重復3 次，再加入現配的1 mL細胞裂解液裂解線蟲，振蕩后，在顯微鏡下觀察，直至大部分蟲體裂解，將離心管于6 000 r/min下離心1 min，棄上清液，加M9緩沖液洗滌3 次，將洗滌后的蟲卵轉移至線蟲生長培養基（nematode growth medium，NGM）上，在20 ℃恒溫下培養48 h后蟲卵基本發育成L4期幼蟲，即完成同期化。

1.3.4 線蟲壽命實驗

將同期化的線蟲隨機分為4 組，每組設置3 個平行，每板30 只，分別為空白組（0 μg/mL）及不同質量濃度的OE-I（20、40、80 μg/mL）的實驗組。將線蟲轉移到NGM上，然后在20 ℃人工氣候箱中培養，此時記為第0天，每2 d更換NGM培養基并記錄死蟲和活蟲的數量（用鉑金絲輕輕觸碰線蟲沒有反應，即認為是死蟲），直至所有線蟲死亡為止。根據線蟲生存和死亡的時間繪制生存曲線[14]。

1.3.5 線蟲急性氧化應激實驗

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節方法培養72 h后，將各組線蟲轉移到新的NGM上，此時每10 mL NGM培養基中添加體積分數30%的雙氧水10 μL，每1 h記錄一次線蟲存活數量，直至線蟲全部死亡。根據線蟲生存和死亡的時間繪制生存曲線。

1.3.6 線蟲熱應激實驗

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節方法培養72 h后，將各組線蟲轉移至35 ℃培養箱中培養，每2 h記錄一次線蟲存活數量，直至線蟲全部死亡。根據線蟲生存和死亡的時間繪制生存曲線。

1.3.7 線蟲體內ROS水平的測定

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節方法培養72 h后，收集各組線蟲，用M9緩沖液沖洗3 次。ROS水平測定：將線蟲轉移到含20 μL H2DCF-DA的180 μL M9緩沖液中，室溫黑暗中孵育30 min，M9緩沖液沖洗3 次，用酶標儀檢測線蟲的熒光強度，激發波長和發射波長分別為485、530 nm[15]。

1.3.8 線蟲細胞凋亡染色測定

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節方法培養72 h后，收集各組線蟲，用M9緩沖液沖洗3 次。細胞凋亡染色測定：將線蟲轉移到200 μL的吖啶橙溶液（25 μg/mL）中，室溫黑暗中孵育1 h，用M9緩沖液洗除染液后，將線蟲轉移到空白NGM培養皿上，用鹽酸左旋咪唑溶液（60 μg/mL）麻醉線蟲，置于質量分數3%瓊脂糖載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察線蟲，拍照并計算熒光強度，激發波長和發射波長分別為485、530 nm。

1.3.9 線蟲體內抗氧化酶活力的測定

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節方法培養72 h，用M9緩沖液清洗3 次，然后加入200 μL的細胞裂解緩沖液，在冰上孵育1 h，用手持式勻漿機勻漿處理后在3 000 r/min下離心5 min，取上清液，分別用SOD、CAT、GSH-Px活力測定試劑盒檢測相應酶活力[16]。

1.3.10 衰老相關基因表達水平的測定

收集培養72 h后的線蟲，用M9緩沖液沖洗。采用試劑盒提取總RNA并通過逆轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR采用SYBR染料法和ABI 7300 PCR系統進行。擴增條件：95 ℃預變性2.5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環。引物的設計如表1所示，act-1為mRNA的內參基因，基因表達量以2—ΔΔCt法計算[17]。

表1 定量聚合酶鏈式反應中所用引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative polymerase chain reaction (qPCR)

1.4 數據處理與分析

采用Excel軟件、Origin 8.0軟件對實驗結果進行統計和作圖，用Image Pro Plus 6.0軟件定量線蟲的熒光強度，結果用平均值±標準差表示。利用SPSS R26.0統計分析軟件對線蟲壽命的實驗數據以及對線蟲抗氧化相關生理指標的數據進行單因素方差分析，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 牡蠣多肽的體外抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除能力

不同質量濃度的牡蠣多肽組分對DPPH自由基的清除率如圖1所示，3 個組分多肽都表現出較強的DPPH自由基清除能力，在2～10 mg/mL范圍內，隨著質量濃度的增加，牡蠣多肽組分的DPPH自由基清除率增大，3 個組分都表現出顯著的劑量-效應關系。其中組分OE-I的DPPH自由基清除率高于OE-III，OE-II的DPPH自由基清除率略低于OE-I，組分OE-I的DPPH自由基清除率最高。

圖1 OE-I、OE-II、OE-III及VC對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of OE-I, OE-II, OE-III and VC

2.1.2 羥自由基清除能力

不同質量濃度的牡蠣多肽組分對羥自由基的清除率如圖2所示，3 個組分多肽均具有一定的羥自由基清除能力，且其羥自由基清除能力與質量濃度之間存在劑量-效應關系，OE-I組分的羥自由基清除能力較其他兩個組分高，明顯高于組分OE-III，且在高質量濃度（10 mg/mL）下，組分OE-I的羥自由基清除能力接近陽性對照VC。

圖2 OE-I、OE-II、OE-III及VC的羥自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging capacity of OE-I, OE-II, OE-III and VC

2.1.3 超氧陰離子自由基清除能力

不同質量濃度的牡蠣多肽組分對超氧陰離子自由基的清除率如圖3所示，隨著質量濃度的增加，各組分的超氧陰離子自由基清除率均呈上升趨勢，且組分OE-I的清除率最高，與組分OE-III相比差異明顯。

圖3 OE-I、OE-II、OE-III及VC的超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging capacity of OE-I, OE-II,OE-III and VC

2.1.4 亞鐵離子螯合能力

不同質量濃度牡蠣多肽組分的亞鐵離子螯合率如圖4所示，隨著質量濃度的升高，各組分的亞鐵離子螯合能力均呈上升趨勢，且組分OE-I的活性最高，與其他兩組分相比差異明顯。牡蠣多肽具有高含量的谷氨酸及天冬氨酸，為牡蠣多肽提供了亞鐵離子結合位點，其亞鐵離子螯合能力可能與氨基酸的組成有關[18]。

圖4 OE-I、OE-II、OE-III及EDTA的亞鐵離子螯合能力Fig.4 Ferrous ion chelating capacity of OE-I, OE-II, OE-III and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)

2.2 牡蠣多肽對線蟲壽命的影響

壽命是評價牡蠣多肽抗衰老效果最直接的指標[19]。由表2可知，空白組平均壽命為14.53 d，最長壽命為15.71 d，OE-I中劑量組線蟲的平均壽命和最長壽命分別相比空白組延長了14.73%（P＜0.05）和25.59%（P＜0.05），OE-I高劑量組線蟲的平均壽命和最長壽命分別相比空白組延長了35.37%（P＜0.01）和43.92%（P＜0.05）。線蟲的生命曲線如圖5所示，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲的壽命隨著牡蠣多肽質量濃度的升高而延長，且具有明顯的劑量-效應關系，表明牡蠣多肽OE-I可以延長線蟲的壽命，發揮抗衰老作用。

表2 牡蠣多肽對線蟲壽命的影響Table 2 Effects of oyster peptides on the lifespan of C.elegans

圖5 線蟲的壽命曲線Fig.5 Lifespan curves of C.elegans

2.3 牡蠣多肽對線蟲急性氧化應激的影響

由表3可知，空白組平均壽命為2.48 h，最長存活時間為6 h；OE-I高劑量組線蟲的平均壽命最長，與空白組相比有極顯著差異（P＜0.01）。線蟲的壽命曲線如圖6所示，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲壽命與牡蠣多肽質量濃度有明顯的劑量-效應關系，表明牡蠣多肽OE-I對雙氧水氧化損傷線蟲具有明顯的保護作用，相對于空白組，在OE-I干預后，20、40、80 μg/mL劑量組線蟲平均壽命分別延長了6.04%、7.26%及26.21%。

圖6 雙氧水急性氧化應激損傷線蟲的壽命曲線Fig.6 Lifespan curves of C.elegans with H2O2-induced acute oxidative stress

表3 牡蠣多肽對雙氧水急性氧化應激損傷線蟲壽命的影響Table 3 Effects of oyster peptides on the lifespan of C.elegans with H2O2-induced acute oxidative stress

2.4 牡蠣多肽對線蟲熱應激壽命的影響

由表4可知，空白組線蟲的平均壽命為6.33 h，最長存活時間為10 h；在35 ℃時，不同質量濃度的牡蠣多肽OE-I對線蟲抵抗熱應激能力的分析結果顯示，OE-I中劑量組線蟲的平均壽命相比空白組延長了13.27%（P＜0.05），OE-I高劑量組線蟲的平均壽命相比空白組延長了22.91%（P＜0.01），牡蠣多肽OE-I中劑量組、高劑量組顯著增強了線蟲的熱應激抵抗能力。如圖7所示，牡蠣多肽劑量組線蟲熱應激下壽命與牡蠣多肽質量濃度呈現明顯的劑量-效應關系，OE-I高劑量組線蟲的壽命曲線相比空白組明顯右移。

表4 牡蠣多肽對線蟲熱應激壽命的影響Table 4 Effects of oyster peptides on the lifespan of C.elegans under heat stress

圖7 熱應激下線蟲的壽命曲線Fig.7 Lifespan curves of C.elegans under heat stress

2.5 牡蠣多肽對線蟲體內ROS的影響

ROS作為最重要的氧化劑之一，其水平可以間接反映機體細胞的氧化程度，其蓄積會對機體造成氧化損傷[20]。由圖8可知，OE-I中劑量組和高劑量組線蟲細胞內ROS相對含量較正常組顯著降低（P＜0.05），且OE-I高劑量組對線蟲細胞內ROS的下調能力明顯優于OE-I低劑量組。

圖8 牡蠣多肽對線蟲體內ROS的影響Fig.8 Effects of oyster peptides on ROS accumulation in C.elegans

2.6 牡蠣多肽對線蟲細胞凋亡的影響

DNA損傷與細胞凋亡密切相關，吖啶橙染色結果可以反映線蟲DNA的整合狀況，這是由于吖啶橙可以進入凋亡細胞的細胞膜與DNA結合，細胞在熒光燈照射下呈綠色[21]。如圖9A～D所示，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲蟲體總體呈淺綠色，而空白組線蟲蟲體呈亮綠色，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲蟲體的亮綠色面積小于空白組。此外，由圖9E可知，牡蠣多肽OE-I高劑量組的熒光強度極顯著低于空白組（P＜0.01）。吖啶橙染色結果的差異表明，牡蠣多肽OE-I可以減輕線蟲DNA的損傷，從而延長線蟲的壽命。

圖9 牡蠣多肽對線蟲細胞凋亡的影響Fig.9 Effects of oyster peptides on cell apoptosis in C.elegans

2.7 牡蠣多肽對線蟲體內抗氧化酶活力的影響

CAT、SOD和GSH-Px是線蟲體內主要的抗氧化酶，提高抗氧化酶活力可以清除線蟲體內多余的自由基，從而促進體內氧化平衡[22]。如圖10所示，與空白組相比，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲體內3 種抗氧化酶活力隨著質量濃度增加而升高。與空白組相比，OE-I低劑量組、中劑量組和高劑量組線蟲體內GSH-Px活力分別是空白組的1.25 倍（P＜0.05）、2.1 倍（P＜0.01）和2.6 倍（P＜0.01）。與空白組相比，OE-I中劑量組和高劑量組線蟲體內SOD活力提高，分別為空白組的1.11 倍和1.17 倍（P＜0.05）；OE-I中劑量組和高劑量組線蟲體內CAT活力為空白組的1.38 倍（P＜0.05）和1.64 倍（P＜0.01）。以上結果表明牡蠣多肽OE-I能提高線蟲體內抗氧化酶活力，從而延長線蟲的壽命。

圖10 牡蠣多肽對秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活力的影響Fig.10 Effects of oyster peptides on antioxidant enzyme activities in C.elegans

2.8 牡蠣多肽對線蟲衰老相關信號通路的影響

胰島素通路是影響線蟲壽命的典型通路之一，daf-2、daf-16和age-1是主要起調節作用的信號基因[23]。由圖11A可知，經牡蠣多肽OE-I干預后，線蟲體內daf-2和age-1mRNA的基因表達量均顯著下調，OE-I高劑量組線蟲體內的daf-2和age-1mRNA表達量較空白組相比分別降低了69.1%和42.4%（P＜0.01），daf-16mRNA相對表達量較空白組相比升高了80.2%（P＜0.01）。skn-1是抵抗氧化應激最重要的機體防御分子，主要通過調節抗氧化酶相關基因的表達緩解氧化應激引起的機體損傷；sod-3是線蟲體內超氧化物歧化酶家族成員之一，與線蟲過氧化損傷和抗氧化酶有關。sod-3和mtl-1都是daf-16的下游基因，mtl-1對重金屬毒性和氧化應激有一定的保護作用[24-25]。由圖11B可知，經牡蠣多肽干預后，OE-I高劑量組線蟲體內skn-1、sod-3和mtl-1mRNA相對表達量相比空白組分別升高了62.2%、51.4%和189.5%（P＜0.01），這與實驗組線蟲體內SOD抗氧化酶水平提高的結果相一致。以上結果表明，牡蠣多肽OE-I可以上調daf-16及其下游基因mtl-1和sod-3，并上調機體防御分子skn-1，以及下調daf-2和age-1，從而延長線蟲的壽命。

圖11 牡蠣多肽對秀麗隱桿線蟲衰老相關基因表達的影響Fig.11 Effects of oyster peptides on expression of senescence-related genes in C.elegans

3 討 論

本研究以DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和亞鐵離子螯合能力為指標，對牡蠣多肽體外抗氧化作用進行了探究，結果發現小分子組分OE-I（＜5 kDa）的抗氧化活性最強。在本課題組前期的研究中，對組分OE-I的氨基酸組成和序列進行了鑒定，發現其主要含有10 個肽序列，前5 個豐度較高的多肽依次為SFGSGLTPQQQ、GEPGPEGPAGPIGPR、NAVNSLNSQP、GPQGLVGPAG、GEPGPEGPAGPI[6]。蔡樹杏等[26]研究發現通過酶解獲得的牡蠣酶解液中含有豐富的蛋白質、微量元素和維生素，有較強的抗氧化活性。葉昱輝[27]采用酶解法酶解近江牡蠣，將牡蠣多肽進行超濾分級并利用Sephadex G-25葡聚糖凝膠進一步分離純化得到兩個組分，并對抗氧化活性高的組分進行超高效液相色譜-串聯質譜結構解析，結果發現有13 條多肽序列，其中含有較多的七肽，經牡蠣多肽干預后，UV輻照的HaCaT細胞活力有顯著提升，牡蠣多肽可以通過調節相關通路的靶點基因的表達，從而調控HaCaT細胞的抗光老化效應，說明牡蠣多肽可以很好地抑制細胞中ROS自由基的生成。Wang Qiukuan等[28]研究了太平洋牡蠣水解肽的抗氧化活性，將經酶解之后的牡蠣多肽進一步用Sephadex G-15凝膠過濾層析分離，隨后將分離的兩個生物活性肽用Kromasil C18柱進行反相高效液相色譜純化，并測定其氨基酸序列，發現兩種新多肽在羥自由基和DPPH自由基清除能力方面表現出較高的抗氧化活性，其分子質量分別為518、440 Da。采用蛋白酶對牡蠣多肽進行酶解，能夠得到大分子質量的牡蠣多肽，為進一步得到活性更高的牡蠣多肽，一般采用超濾法、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法和反向高效液相色譜法等對牡蠣大分子肽進行分離純化，以獲取生物活性更高的小分子肽[29]。結合以上研究結果與本研究抗氧化實驗相關結果，表明牡蠣多肽對于自由基有較強的結合能力，具有較強的抗氧化活性，且多肽的分子質量越小，其抗氧化能力越強。

ROS是氧化代謝的有害產物，它們的積累會破壞細胞結構和組織，加速機體衰老[30]。一旦機體的抗氧化防御系統被破壞，過量的ROS會對細胞造成功能性的氧化損傷，因此，減少ROS積累已被證明是延緩衰老的有效策略[31]。同時，細胞會產生各種非酶和酶類物質來防止氧化反應，包括維生素、硒、CAT、SOD和GSH-Px等，它們能催化超氧化物降解產生氧和過氧化氫，從而抑制ROS的積累[32]。線蟲體內抗氧化酶被認為是影響線蟲壽命的關鍵因素之一，線蟲體內抗氧化能力與壽命有一定的相關性[33]。李玉英等[34]研究連翹花黃色素對線蟲在氧化應激下的保護作用，發現連翹花黃色素有很好的抗氧化活性，能顯著提高線蟲在氧化應激下的壽命，降低線蟲體內ROS水平，同時提高CAT、SOD和GSH-Px活力，緩解了線蟲體內的氧化應激損傷，證明線蟲壽命與抗氧化有關。陳純[35]通過線蟲實驗發現紫薯提取物能顯著延長線蟲的壽命，緩解線蟲的衰老，線蟲體內抗氧化酶活力有所增加，相關抗衰老基因表達量也有所上調，并與紫薯提取物的質量濃度有劑量關系。本研究以秀麗隱桿線蟲為模型生物，探究牡蠣多肽組分OE-I對線蟲壽命和體內抗氧化能力的影響，結果發現牡蠣多肽組分OE-I能顯著提高線蟲體內CAT、SOD和GSH-Px 3 種抗氧化酶的活力，降低線蟲體內ROS水平，并減輕線蟲DNA損傷，對線蟲的壽命有顯著的延長作用。以上研究表明，線蟲壽命與抗氧化能力有一定的關聯性，而牡蠣多肽能增強線蟲體內抗氧化能力，清除有害的自由基，減輕線蟲的氧化損傷；因此，牡蠣多肽可能是通過調節機體的抗氧化能力發揮其抗衰老作用。

胰島素信號通路是研究機體衰老的重要信號通路之一，在胰島素信號通路中，受體蛋白與胰島素受體daf-2結合并激活age-1的表達，3-磷酸磷脂酰肌醇的水平增加，導致絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化，從而抑制daf-16的表達[36-37]。本研究結果表明，牡蠣多肽能顯著下調daf-2和age-1mRNA的表達水平，而daf-16的下游基因sod-3、mtl-1mRNA的相對表達量都顯著升高，sod-3與線蟲體內SOD有關；因此，牡蠣多肽的抗衰老作用可能是通過上調sod-3的表達來減少ROS的積累。同時，daf-16和機體防御分子skn-1mRNA的相對表達量也顯著升高，證明了牡蠣多肽能通過胰島素信號通路daf-2/daf-16延長線蟲的壽命，并能促進機體防御分子skn-1、sod-3和mtl-1mRNA的表達，進而介導機體應激抵抗，延長壽命。這與張曉寒等[16]研究發現根皮素通過調控daf-2、daf-16和sod-3mRNA的表達延長線蟲壽命的結果一致，證實了daf-16在調節線蟲壽命和抗氧化能力方面的重要性。

綜上所述，牡蠣多肽組分OE-I具有較強的體外抗氧化活性，能顯著增加線蟲體內抗氧化酶的活力，減輕線蟲體內ROS積累導致的氧化損傷和細胞凋亡，并通過調控胰島素信號通路和氧化應激調控因子skn-1、sod-3和mtl-1的表達，有效延長線蟲的壽命。今后將對牡蠣多肽組分OE-I進一步分離純化，獲得單一的牡蠣多肽組分，對其結構進行鑒定并開展抗衰老功能評價，采用轉錄組學、蛋白組學和代謝組學等方法對牡蠣多肽的抗衰老作用機制進行多層次的深入研究。總而言之，牡蠣多肽作為一種活性肽，具有較強的體外抗氧化活性，對增強機體抗氧化能力和延長壽命有一定的積極作用。