牦牛酥油鞘磷脂對小鼠脂質代謝紊亂和肝臟組織炎癥的調節作用

羅 鑫，孫萬成，羅毅皓*

（青海大學農牧學院，青海 西寧 810016）

牦牛酥油是似黃油的一種乳制品，是從牦牛奶中提煉出的脂肪。產于夏秋季的牦牛酥油色澤鮮黃、味道香甜、口感極佳，產于冬季的牦牛酥油則呈淡黃色。酥油含多種維生素，與普通奶油相比營養價值頗高，其硬脂酸含量更高、棕櫚酸含量更低，反式油酸和共軛亞油酸分別是普通奶油的近8 倍和2 倍[1]。

鞘磷脂是含鞘氨醇或二氫鞘氨醇的磷脂，其分子不含甘油，是一分子脂肪酸以酰胺鍵與鞘氨醇的氨基相連形成的，是細胞膜的重要組成成分[2]，也是一種膳食成分，在雞蛋、牛奶、肉類和魚類等食物中最為豐富[3]。近年來有研究表明，鞘磷脂與多種疾病的發生和治療有密切關系[4]，鞘磷脂主要位于細胞膜、脂蛋白和其他富含脂類的組織結構上，對維持細胞膜結構尤其是細胞膜的微控功能十分重要，還與人體內的脂肪酸、膽固醇所引起的一些疾病有著密切的關系[5]。膳食中的鞘磷脂可通過調節結腸癌發生早期表達的蛋白質，抑制結腸癌、肝癌細胞增殖，使得鞘磷脂在結腸癌和肝癌的發生過程中可能成為一種潛在的治療候選藥物[6-8]；膳食鞘磷脂可顯著上調缺鎂飲食導致的特異性皮炎模型表皮中神經酰胺合成酶的表達，抑制缺鎂飲食無毛小鼠皮膚炎癥的發生[9-10]；研究表明，與對照組相比，飼喂含鞘磷脂飼料的大鼠血漿中膽固醇含量減少了30%[11-13]。目前，高脂飲食習慣正逐漸影響著人類的健康，長期高脂飲食、體內營養過剩易引起高脂血癥，患者長期處于炎癥的狀態，機體的脂代謝平衡也會發生改變。鞘磷脂具有一定的抗炎癥功能[14]和調節脂質代謝[15]的作用。Norris等[11]研究發現牛奶鞘磷脂能降低高脂肪飲食誘導的C57BL/6J小鼠的血清血脂和肝臟甘油三酯。Chung等[12]發現當將雞蛋鞘磷脂添加到高脂肪的飲食中時，其會以劑量依賴地方式有效降低肝臟膽固醇和甘油三酯的水平，并且對飲食誘導的肝臟脂肪組織炎癥具有潛在的預防作用。依帕爾古麗·阿不拉等[13]研究了新疆拜城油雞中的鞘磷脂提取物對高脂血癥小鼠血脂及肝臟的影響，發現拜城油雞鞘磷脂提取物可顯著降低高脂血癥小鼠的血脂水平，保護肝細胞、改善肝細胞脂肪變性。

不同食物中鞘磷脂的含量不同，某些水果和蔬菜中鞘磷脂含量不到100 μmol/kg，在雞蛋、奶制品和部分植物種子中可達2 000 μmol/kg 以上[16]，諸多學者通過對市售嬰兒配方乳粉中磷脂的含量進行分析，發現磷脂在嬰兒配方奶粉中的含量為15～607 mg/100 g，其中鞘磷脂為12～125 mg/100 g，磷脂在牛乳中的質量濃度為4.60～49.10 mg/100 mL，磷脂中鞘磷脂相對含量為17%～41.10%，磷脂在母乳中的質量濃度為13.30～40.60 mg/100 mL，鞘磷脂占磷脂的24.0%～45.9%[17]，而牦牛酥油中鞘磷脂含量可達1 918 mg/100 g，通過分析牦牛酥油中鞘磷脂的脂肪酸組成及含量，發現其飽和脂肪酸占脂肪酸總量的73.73%～75.89%，不飽和脂肪酸占24.12%～26.27%，與牦牛酥油和牦牛酥油磷脂中超長鏈脂肪酸含量相比，牦牛酥油鞘磷脂中超長鏈脂肪酸（占23.15%）的含量具有極顯著性差異[18-19]。因此，本實驗分析牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食引起的小鼠脂代謝紊亂及肝臟組織炎癥的作用，初步探討鞘磷脂調節脂代謝及改善組織炎癥的機制，為更好地開發和利用鞘磷脂提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6J小鼠，SPF級，雄性，4 周齡，體質量約13.00 g，由蘭州獸醫研究所提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（甘）2015-0001。

牦牛酥油鞘磷脂 本實驗室自制；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹血糖、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6等基因 上海生物有限公司合成；Total RNA試劑盒美國Omega Bio-Tek公司；Evo M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒 艾科瑞生物技術有限公司。小鼠低脂飼料（TP23302，脂肪質量分數為10%）和高脂飼料（TP23300，脂肪質量分數為60%） 江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MμLtiskan FC酶標儀 美國Thermo Fisher公司；YM立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；CFX96熒光定量儀 美國 BIO-RAD公司；2-16KL冷凍離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計 美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛酥油鞘磷脂的制備

牦牛酥油鞘磷脂參考本課題組已發表的方法制得[18]。參照GB/T 35867—2018《糧油檢驗 卵磷脂中磷脂含量的測定 高效液相色譜蒸發光散射檢測法》測得牦牛酥油中鞘磷脂的含量為1 918 mg/100 g，提取的鞘磷脂純度為78%。鞘磷脂標準溶液和牦牛酥油鞘磷脂樣品的高效液相色譜圖分別見圖1、2。

圖1 鞘磷脂標準溶液高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of sphingomyelin standard solution

圖2 牦牛酥油鞘磷脂樣品溶液高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of yak ghee sphingomyelin solution

1.3.2 動物分組及飼喂

將30 只雄性C57BL/6J小鼠按體質量隨機分為5 組，每組6 只，并適應性飼喂7 d后進行實驗，小鼠分組如下：低脂組（LF組）、高脂組（HF組）、鞘磷脂高劑量組（HF+HSM組，鞘磷脂添加量為1.20 g/100 g）、鞘磷脂中劑量組（HF+MSM組，鞘磷脂添加量為0.60 g/100 g）和鞘磷脂低劑量組（HF+LSM組，鞘磷脂添加量為0.30 g/100 g），根據Norris等[21]的方法確定鞘磷脂添加量，按照不同劑量直接將鞘磷脂拌入到飼料中，觀察確保每次飼喂的含鞘磷脂飼料均能被小鼠食用完。除低脂組小鼠飼喂低脂飼料外，其他組小鼠均給予高脂飼料或高脂飼料+鞘磷脂進行飼喂，所有小鼠均被安置在恒定的溫度、濕度條件和12 h的光暗循環下。自由攝食和飲水，飼料每日更新并測定攝食量，按公式（1）計算食物利用率。每周測量體質量。

鞘磷脂飼喂4 周后，小鼠禁食10 h，麻醉摘眼球取血后處死，處死前進行稱質量，麻醉取血后打開小鼠腹腔和胸腔，立即分離肝臟、心臟、脾、腎、腹部脂肪和腎周脂肪，測定質量，然后取腹部脂肪和100 mg肝臟組織進行組織病理學觀察，剩余組織于-80 ℃貯存待用。分別按公式（2）、（3）計算臟器指數和臟器脂肪指數。

1.3.3 血清和肝臟生化指標檢測

用1.5 mL的無菌EP管收集小鼠眼球血，室溫靜置1 h后，于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，吸取上層血清，分裝保存于-80 ℃，參照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C和空腹血糖的濃度。再根據試劑盒的方法測定肝臟組織中ALT、AST的活力，結果以蛋白質量計。

1.3.4 肝臟和脂肪組織病理學分析

收集肝臟和腹部脂肪組織，經體積分數4%多聚甲醛固定后，石蠟切片用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下觀察組織病理學變化，并進行圖像采集。

1.3.5 實時定量聚合酶鏈式反應分析

使用Total RNA試劑盒按照說明對5 個組小鼠的肝臟組織RNA進行提取，并利用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計對提取的RNA濃度和純度進行測定，OD260nm/280nm值在1.80～2.10之間。根據Evo M-MLV反轉錄試劑盒的方法合成cDNA第一條鏈。根據SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒的方法對18 個基因進行實時定量聚合酶鏈式反應分析，脂質代謝和炎癥因子的引物序列見表1。所有基因均以GAPDH為參考基因，采用比較閾值法（2-ΔΔCt）進行相對定量，計算小鼠肝臟組織脂代謝和炎癥因子mRNA相對表達量。注：ACC-α.乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alpha）；FADS1.脂肪酸去飽和酶1（fatty acid desaturase 1）；FADS2.脂肪酸去飽和酶2（fatty acid desaturase 2）；GPAT4.甘油-3-磷酸酰基轉移酶4（glycerol-3-phosphate acyltransferases 4）；GPAM.3-磷酸甘油酰基轉移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase）；THRSP.甲狀腺激素應答蛋白（thyroid hormone responsive protein）；HMGCR.3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaric acid coenzyme A reductase）；CPT1.肉堿棕櫚酰轉移酶1（carnitine palmitoyl transferase 1）；FABP1.肝型脂肪酸結合蛋白（hepatic fatty acid binding protein）；A-FABP.脂肪細胞脂肪酸結合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein）；IL-1Ra.白介素1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist）；IFN-γ.干擾素γ（interferon-γ）。

表1 引物序列信息Table 1 Primers sequences

續表1

1.4 數據處理與分析

所有數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，采用鄧肯檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鞘磷脂對高脂飲食小鼠體質量和總攝食量的影響

由表2和圖3可知，與高脂組相比，牦牛酥油鞘磷脂組小鼠（除鞘磷脂低劑量組外）的最終體質量顯著降低（P＜0.05）。相對于低脂組，高脂組小鼠的攝食量顯著降低（P＜0.05），而其體質量增加量顯著升高（P＜0.05），說明高脂飲食能夠誘導小鼠肥胖的發生；與高脂組相比，鞘磷脂組小鼠的總攝食量與之相近，但體質量增加量有所降低，尤其是高劑量組具有顯著差異（P＜0.05）。相對于高脂組，低脂組的食物利用率顯著降低（P＜0.05），高劑量鞘磷脂組雖有較低的食物利用率，但差異不顯著（P＞0.05）。上述數據表明牦牛酥油鞘磷脂具有降低由肥胖飲食引發體質量增加的作用。

表2 各組小鼠的體質量增加量、總攝食量和食物利用率（n＝6）Table 2 Body mass gain, total feed intake, and utilization rate of mice in each group (n = 6)

圖3 牦牛酥油鞘磷脂對小鼠體質量的影響Fig.3 Effect of yak ghee sphingomyelin on body mass of mice

2.2 鞘磷脂對高脂飲食小鼠臟器指數、腹部和腎周脂肪指數的影響

由表3可知，與低脂組相比，高脂組小鼠心臟、腎臟和脾臟指數均有所升高；肝臟指數顯著增高（P＜0.05），從39.90 mg/g增加至44.15 mg/g。與高脂組相比，鞘磷脂各組小鼠的脾臟、心臟和腎臟指數較低，但無顯著差異；高劑量鞘磷脂組的肝臟指數顯著下降了8.54%（P＜0.05）。此外，與低脂組相比，高脂組小鼠腹部脂肪和腎周脂肪指數顯著升高（P＜0.05），鞘磷脂低、中、高劑量組中小鼠腹部脂肪指數較高脂組分別降低了28.54%、29.83%和34.37%，腎周圍脂肪指數也顯著降低（P＜0.05）。以上研究表明牦牛酥油鞘磷脂對小鼠的心臟、腎臟和脾臟無明顯影響，且能夠改善高脂飲食引起的小鼠肝臟指數變化和緩解腹部脂肪及腎周脂肪的積聚。

表3 各組小鼠的臟器指數、腹部脂肪指數和腎周脂肪指數（n＝6）Table 3 Visceral organ indexes, abdominal fat index, and perirenal fat index of mice in each group (n = 6)

2.3 鞘磷脂對高脂飲食小鼠血清血脂水平的影響

高脂飲食引起的血液中TC、TG和LDL-C水平升高會導致動脈粥樣硬化等疾病的發生，本研究對小鼠血清血脂水平的分析評估了牦牛酥油鞘磷脂的脂代謝作用。由圖4可知，與低脂組相比，高脂組小鼠TC、TG和LDL-C和血糖水平顯著升高，HDL-C水平顯著下降（P＜0.05）；相對于高脂組，鞘磷脂組中TC、TG、LDL-C和血糖水平顯著下降（P＜0.05），高劑量鞘磷脂組TC、TG和LDL-C和血糖水平分別下降了26.26%、24.70%、38.96%和42.16%。Zhang Ping[20]、Norris[21]等發現牛奶和雞蛋鞘磷脂可通過抑制內源性膽固醇的吸收降低血液中膽固醇的含量，從而改善高脂飲食引起的血脂水平增加。牦牛酥油鞘磷脂對體內血脂具有代謝作用，其降血脂的潛在機理表現為可以通過抑制膽固醇的吸收防止膽固醇沉積，有效地維持血液中膽固醇水平的平衡；此外，牦牛酥油鞘磷脂中不飽和脂肪酸含量較高，不飽和脂肪酸具有調節血脂、降低血液中膽固醇含量的作用。

圖4 牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食小鼠血清血脂水平的影響Fig.4 Effect of yak ghee sphingomyelin on serum lipid levels in HFD-fed mice

2.4 鞘磷脂對高脂飲食小鼠肝臟AST和ALT活力的影響

ALT和AST活力為評價肝功能的重要指標，肝臟組織受損時，細胞膜的通透性增加，肝細胞漿內ALT和AST釋放到血液中，會引起肝臟和血清中轉氨酶水平升高[22]。從圖5可以看出，與低脂組相比，高脂飲食引起了肝臟ALT和AST活力的顯著升高（P＜0.05），低脂組中ALT和AST的活力分別為11.16 U/g和11.76 U/g；高脂組中ALT和AST的活力分別為24.37 U/g和15.76 U/g；與高脂組相比，鞘磷脂高、中、低劑量組小鼠肝臟ALT和AST活力均顯著降低（P＜0.05），ALT的活力分別為15.99、18.63、21.58 U/g，AST的活力分別為12.91、14.24、14.32 U/g。Norris[21]等發現與低脂飲食相比，高脂飲食能夠使血清中ALT、AST活力分別顯著增加43%和30%（P＜0.05），雞蛋鞘磷脂和牛奶鞘磷脂均能降低ALT（分別降低了8.30%和8%）和AST（分別降低了5%和10%）的活力。

圖5 牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食小鼠肝臟ALT（A）、AST（B）活力的影響Fig.5 Effect of yak ghee sphingomyelin on liver alanine aminotransferase (A)and aspartate transaminase (B) activity in HFD-fed mice

2.5 鞘磷脂對高脂飲食小鼠肝臟和腹部脂肪組織病理學的影響

為了研究飼喂鞘磷脂后對小鼠肝臟及腹部脂肪組織病理變化的影響，進一步對肝臟和腹部脂肪組織進行HE染色。由圖6、7可知，低脂組和高脂組中，小鼠肝臟組織結構正常完整，肝細胞沿中央靜脈呈放射狀排列，未見變性、壞死，高脂組偶見輕微肝細胞空泡變；腹部脂肪組織的脂肪細胞形態結構正常，間質未見充血、水腫和炎細胞浸潤。鞘磷脂組中小鼠肝臟組織結構正常完整，肝細胞沿中央靜脈呈放射狀排列，未見變性、壞死，肝竇未見擴張，間質未見充血、水腫和炎細胞浸潤；腹部脂肪組織的脂肪細胞形態結構正常，間質未見充血、水腫和炎細胞浸潤。染色結果表明，飼喂鞘磷脂后，可以減輕由高脂飲食引起的小鼠肝臟細胞空泡變，從而對肝臟起到一定的保護作用。

圖6 牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食小鼠肝臟組織病理學的影響Fig.6 Effect of yak ghee sphingomyelin on liver histopathology in HFD-fed mice

圖7 牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食小鼠腹部脂肪組織病理學的影響（×200）Fig.7 Effect of yak ghee sphingomyelin on the histopathology of abdominal adipose tissues in HFD-fed mice (× 200)

2.6 鞘磷脂對高脂飲食小鼠肝臟脂代謝和炎癥因子表達量的影響

2.6.1 對脂質代謝基因表達的影響

如圖8所示，與高脂組相比，飼喂鞘磷脂后，小鼠肝臟組織中FAS、A-FABP、ACC-α、FADS2、THRSP、FADS1、GPAM、CPT1和GPAT4基因的表達受到抑制，其表達量顯著降低（P＜0.05）；FABP1、HMGCR和SCD1基因的表達顯著上調。

圖8 牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食小鼠肝臟脂代謝基因表達量的影響Fig.8 Effect of yak ghee sphingomyelin on lipid metabolism gene expression in liver tissues of HFD-fed mice

FADS1和FADS2基因的表達在多不飽脂肪酸的合成中起關鍵作用，ACC-α是脂肪酸生物合成第一步的限速酶[23]，GPAM定位于線粒體，GPAT4定位于內質網[24]，是甘油三酯合成第一步反應的關鍵酶。THRSP基因參與甲狀腺激素和碳水化合物誘導的脂肪生成過程[25]，FAS的表達量隨著THRSP表達增強而提高[26]。SCD1基因是單不飽和脂肪酸合成過程中的限速酶[27]。因此，牦牛酥油鞘磷脂調節脂質代謝的作用機制表現為：通過抑制磷酸甘油途徑合成甘油三酯、減少甲狀腺激素和碳水化合物誘導脂肪的合成、調節肝臟中脂類的轉運和代謝從而減少肝臟和血清中脂質的積累。牦牛酥油鞘磷脂的降血脂機理與肝臟組織中脂質代謝相關酶的表達密切相關，鞘磷脂通過影響相關酶的表達量調節機體中的飽和及不飽和脂肪酸的含量，進而對血脂起調節作用。

2.6.2 對炎癥因子基因表達的影響

促炎因子和抗炎因子在多種炎癥反應中起重要作用[28]。高脂飲食不僅會引起血脂代謝紊亂，還會使機體長期處于慢性炎癥狀態[29]。高脂飼料飼喂小鼠會顯著上調機體促炎癥因子的表達[30]，TNF-α和IL-6等促炎因子的釋放，能夠增強炎癥反應，引起肝損傷[31]。因此，本實驗利用熒光定量聚合酶鏈式反應檢測炎癥因子在肝臟中的表達水平，由圖9可知，高脂組小鼠肝臟中促炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表達量顯著高于低脂組（P＜0.05），鞘磷脂組小鼠肝臟中促炎癥因子的表達量均顯著低于高脂組（P＜0.05）。與高脂組相比，鞘磷脂中、高劑量組中抗炎癥因子IL-10的表達量顯著升高（P＜0.05），IL-1Ra和IL-4表達量隨著鞘磷脂添加量的增加呈上升趨勢，因此，牦牛酥油鞘磷脂改善炎癥反應的作用機制可能與抑制TNF-α和IL-6等促炎因子的生成相關，但本研究中鞘磷脂對體內炎癥因子的表達量影響無明顯劑量對應關系，可能與本實驗的設計相關，需要通過建立相應的炎癥模型或增加飼喂時間及樣本量進行驗證。

圖9 牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食小鼠肝臟炎癥因子基因表達量的影響Fig.9 Effect of yak ghee sphingomyelin on inflammatory gene expression in liver tissues of HFD-fed mice

3 結 論

本實驗初探了牦牛酥油鞘磷脂對高脂飲食誘導的小鼠脂質代謝及肝臟組織炎癥的作用。研究發現，牦牛酥油鞘磷脂能夠減輕高脂飲食小鼠的體質量和預防高脂飲食引起的高脂血癥。通過對肝臟組織中炎癥因子及脂質代謝相關基因表達量的分析發現，牦牛酥油鞘磷脂飼喂小鼠后顯著下調了組織中促炎癥因子的表達，對組織炎癥具有很好的預防作用，但鞘磷脂對抗炎癥因子的表達量無明顯的劑量對應關系，可能是由于飼喂時間較短或者樣本較少，存在誤差，后續實驗還需通過建立炎癥模型，對鞘磷脂的抗炎癥劑量進行詳細的研究；對脂質代謝相關基因的表達分析發現，鞘磷脂能上調FABP1、HMGCR和SCD1基因的表達，下調THRSP、ACC-α等基因的表達，這些與脂肪合成代謝和分解代謝相關基因表達量的變化能夠對高脂飲食引起的小鼠血清血脂水平進行調節。綜上，本研究可為今后以牦牛酥油鞘磷脂為原料的功能性食品的開發提供基礎數據。