反相高效液相色譜測定硫酸羥氯喹原料有關物質的方法學研究

黃夢芹

上海上藥中西制藥有限公司（上海 201806）

硫酸羥氯喹即（±）-2[[4-[（7-氯-4-喹啉基）氨基]苯基]-乙氨基]乙醇硫酸鹽（C18H26ClN3O·H2SO4），其化學結構式如圖1所示。

圖1 硫酸羥氯喹的化學結構

硫酸羥氯喹是喹酮類抗瘧藥，通常被作為抗風濕病的獨特藥物。其由芳香環構成，結構中氯喹的乙基被羥乙基所代替。該藥物于1944年人工合成，1950年以來，隨著抗瘧藥在系統性紅斑狼瘡及風濕性關節炎治療中的廣泛應用[1]，硫酸羥氯喹被廣泛應用于臨床治療風濕病；學者研究表明，該藥物還可用于治療原發性干燥綜合征（PSS）、痛風關節炎、皮肌炎等[2-4]。至20世紀后期，在臨床上，用硫酸羥氯喹來治療類風濕病已超過90%[5]。

美國藥典（USP）、我國藥典標準及部頒標準ChP均采用薄層色譜法（TLC）來檢測硫酸羥氯喹中的相關物質，但該方法特異性不強、靈敏度偏低，且只能進行有關物質限度檢查，不能測定出雜質含量。英國藥典（BP）雖采用高效液相色譜（HPLC）測定，但樣品前處理步驟比較復雜[6]。文獻[7]表明，通過HPLC法對硫酸羥氯喹有關物質項的方法學進行質量研究，樣品前處理步驟比較簡便，方法簡單快速且專屬性好，色譜條件簡單。

為了進一步控制上海上藥中西制藥有限公司硫酸羥氯喹原料的質量，全面探究了硫酸羥氯喹有關物質2種雜質的測定，并使用C18柱，建立了測定硫酸羥氯喹原料中有關物質的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，根據主成分自身對照法測定了2種已知雜質含量。

1 實驗部分

1.1 儀器

AL104電子天平、XPE105電子天平、S210 pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試劑

乙酸銨、硫酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，色譜純，國藥集團沃凱試劑有限公司；乙腈，色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；四氫呋喃，色譜純，默克化工技術（上海）有限公司。

1.3 標準品

實驗過程使用的標準品如表1所示。

表1 標準品信息

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Extend C18柱（4.6 mm×150 mm×5μm）；以0.05 mol/L乙酸銨水溶液（用三乙胺溶液調pH=10.5）為流動相A，以甲醇-乙腈-異丙醇（體積比為70∶20∶10）為流動相B，梯度洗脫，洗脫程序如表2所示；柱溫箱溫度為35℃；洗脫流速為0.8 mL/min；紫外檢測波長為254 nm。

表2 梯度洗脫程序

1.4.2 溶液的配制

1.4.2.1 系統適用性溶液制備

取硫酸羥氯喹原料以及雜質E，雜質F對照品適量，配制成1 mL中含硫酸羥氯喹0.5 mg，雜質E及雜質F各0.5μg的混合溶液，作為分離度溶液。

1.4.2.2 硫酸羥氯喹一級貯備液制備

精密稱定硫酸羥氯喹標準品25 mg置于50 mL容量瓶中，加稀釋劑適量使其溶解，再定容，混勻。

1.4.2.3 靈敏度溶液制備

精密量取硫酸羥氯喹一級貯備液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，混勻；再精密量取上述溶液1.0 mL置于250 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋定容，搖勻。

1.4.2.4 雜質對照品溶液的制備

分別稱取約10 mg的雜質E，雜質F置于100 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解稀釋至100 mL，作為各雜質貯備液1。移取雜質E，F貯備液1各10 mL，置于100 mL容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，混勻，作為準確度雜質對照品溶液。

1.4.2.5 硫酸羥氯喹供試品母液制備

稱取硫酸羥氯喹供試品1.0 g置于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，混勻。

1.4.2.6 供試品溶液制備

移取硫酸羥氯喹供試品母液5 mL置于100 mL容量瓶中，分別加入適量的準確度雜質對照品溶液，稀釋至刻度，混勻，作為供試液。

1.4.2.7 對照溶液制備

精密量取供試品溶液5.0 mL置于50 mL容量瓶中，用稀釋溶液稀釋至刻度；移取該溶液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀釋溶液稀釋至刻度。

1.4.2.8 測定方法

精密量取系統適用性溶液、靈敏度溶液、空白溶液、雜質E和雜質F貯備液10μL，注入液相色譜儀，系統適用性溶液中各組分的分離度不得小于1.5，靈敏度溶液峰信噪比不小于3；精密量取供試液及其稀釋的對照溶液10μL，記錄色譜圖，用自身對照法來計算供試液中雜質E，雜質F的含量。

2 結果與討論

2.1 系統適用性試驗

精密量取系統適用性溶液10μL，注入高效液相色譜儀，結果如表3所示。在有關物質色譜條件下，理論塔板數按硫酸羥氯喹計為40131，各峰之間分離度均大于1.5，說明該法色譜條件分離效果好。

表3 有關物質系統適用性試驗結果

2.2 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）試驗

精密量取5.0 mL雜質E，雜質F雜質對照品溶液，置于50 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，作為各線性混合液的雜質貯備液。再用稀釋劑稀釋成不同質量濃度的溶液，精密量取10μL，以信噪比（S/N）大于10為定量限；取定量限溶液稀釋3倍（3→10），作為檢測限。

在該色譜條件下，雜質E，雜質F和硫酸羥氯喹的定量限分別為0.0546，0.050 6和0.0509 mg/L；雜質E，雜質F檢測限分別為0.018 2和0.016 9 mg/L。各雜質的檢測限均在供試品質量濃度的0.01%以下，說明該色譜法靈敏度較高。

2.3 專屬性試驗

精密量取空白溶液10μL，注入液相色譜儀，空白稀釋劑溶液色譜圖在硫酸羥氯喹、雜質E和雜質F保留時間處無干擾峰。

2.4 線性試驗

精密稱取硫酸羥氯喹、雜質E和雜質F對照品適量，分別用水-甲醇-10%硫酸（體積比為125∶125∶1）溶液稀釋制成不同質量濃度的溶液，在有關物質項的色譜條件下，精密量取10μL，注入高效液相色譜儀，按照上述步驟進行線性回歸計算，結果如表4所示。

表4 硫酸羥氯喹及各雜質線性試驗結果

由表4可知，雜質E在0.053 5～1.070 9 mg/L（相當于供試品質量濃度的0.01%～0.20%）內，線性關系良好；硫酸羥氯喹在0.051 6～1.032 8 mg/L（相當于供試品質量濃度的0.01%～0.20%）內，線性關系良好；雜質E在0.051 8～1.036 6 mg/L（相當于供試品溶液質量濃度的0.01%～0.20%）內，線性關系良好。

2.5 準確度試驗

移取硫酸羥氯喹供試品母液5.0 mL置于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為空白溶液。移取雜質E，F貯備液1各10 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，混勻，作為準確度雜質對照品溶液。移取硫酸羥氯喹供試品母液5 mL置于100 mL容量瓶中，分別加入適量準確度雜質對照品溶液，各制成每1 mL分別含雜質0.25，0.5和0.6μg的混合溶液。每個質量濃度平行配制3份供試液，進行準確度試驗，結果表明：雜質E的平均回收率為102.04%，相對標準偏差（RSD）為5.0%；雜質F的平均回收率為94.98%，RSD為4.5%。該方法測得的硫酸羥氯喹雜質E和雜質F中，9份樣品平均回收率均在94.63%～105.10%間，RSD均符合限度，證實該方法的準確度較高，也證明了其精確性和可靠性。

2.6 精密度試驗

2.6.1 重復性試驗

供試品溶液制備同1 mL含雜質0.5μg的準確度溶液制備，平行配制6份供試液，檢測有關物質。結果表明，在6份供試液中：雜質E含量的RSD為1.8%，均值為0.10%；雜質F含量的RSD為2.2%，均值為0.10%；相對保留時間（RRT）為0.44的雜質含量的RSD為1.6%，均值為0.06%；RRT為0.50的雜質含量的RSD為2.8%，均值為0.03%；RRT為0.67的雜質含量的RSD為7.2%，均值為0.01%；RRT為1.24的雜質含量的RSD為1.8%，均值為0.03%；RRT為0.20的雜質含量的RSD為9.0%，均值為0.01%。在6份供試品溶液中，總雜質含量RSD為2.2%，絕對差值為0.02%，表明該方法重復性好。

2.6.2 中間精密度

由不同檢驗員在不同日期使用不同儀器（更換色譜柱批號），按重復性步驟進行操作。12份供試液中：雜質E含量的RSD為7.6%，均值為0.11%；雜質F含量的RSD為7.0%，均值為0.10%。12份供試品溶液總雜質含量的絕對差值為0.05%，總雜含量的RSD為3.1%，表明該方法的精密度較好。

2.7 穩定性試驗

供試品溶液制備同1 mL含雜質0.5μg的準確度溶液制備。取一份系統適用性溶液，一份供試液，在室溫下保存，分別于0，5，10，28，40，48，56及64 h取樣，取上述2種溶液各進樣1針，考察供試液穩定性。結果表明，供試液在室溫條件放置64 h之內，各時間段雜質含量與剛配制好（0 h）時含量的絕對差值范圍為0～0.01%，總雜質含量的絕對差值均為0.02%。由此可知，供試品溶液在64 h內穩定。

2.8 耐用性試驗

供試品溶液制備同1 mL含雜質0.5μg的準確度溶液制備。改變流速、柱溫以及流動相pH，進行耐用性挑戰試驗（不同序列號色譜柱在中間精密度中考察，接受標準為中間精密度標準），結果如表5所示。由表5可知，進樣流速、柱溫、流動相pH及色譜柱批號等在一定范圍內變動均不影響主成分的測定，證實該方法的耐用性好。

表5 耐用試驗性挑戰試驗參數及結果

3 結語

以0.05 mol/L乙酸銨溶液-（乙腈-甲醇-異丙醇）作為流動相進行梯度洗脫，采用C18柱或效能相當的色譜柱，建立了RP-HPLC法對硫酸羥氯喹原料有關物質的測定方法。該分析方法靈敏度較高、精密度好、耐用性良好，且簡便快速、精密穩定，專屬性好，適用于硫酸羥氯喹原料有關物質的測定。