電子煙煙液中煙堿異構體的分離及感官差異

朱瑞芝，王 凱，蔣 薇，楊 繼，司曉喜，劉志華，徐艷群，向能軍，何 沛

云南省煙草化學重點實驗室，云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明市五華區紅錦路367號 650231

電子煙為將電子煙煙液轉化為可吸入氣溶膠的系統［1］，通過氣溶膠向消費者遞送一定量的煙堿，從而使消費者獲得類似吸煙的感官感受［2-3］。煙堿是電子煙煙液的重要成分，大多數商業化的煙堿均由煙草企業的副產品提取純化而來［4-5］。煙堿分子含有一個手性中心，有兩個代謝機理和生理特性完全不同的異構體［6-8］：S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。來源于煙草的煙堿主要以S-(-)-煙堿構型存在，且其占煙堿總量的99%以上［9］。但近年來，隨著非煙草煙堿（Tobacco free nicotine,TFN）在電子煙等新型煙草制品中的應用，煙堿異構體越來越受到人們的關注［10］。文獻［11］報道對電子煙煙液中煙堿的手性分離分析方法主要有手性色譜柱-正相液相色譜-二極管陣列檢測器分析法。正相色譜體系受試劑和環境中水分影響較大，會導致色譜峰保留時間不穩定；同時由于實驗室常用反相液相色譜法，在儀器使用過程中反相色譜和正相色譜之間溶劑體系切換所需時間長，而且對儀器穩定性影響較大，不利于實驗室多種方法的使用和儀器維護。基于此，本研究中開發了手性色譜柱-反相液相色譜-二極管陣列檢測器分析法，對電子煙煙液樣品中的煙堿異構體進行分離分析，同時對2種煙堿異構體及消旋體煙堿的感官差異進行研究，旨在為電子煙的研發和管理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

20種不同煙堿質量分數的電子煙煙液樣品（市售）。

甲醇、乙腈（HPLC級，德國Merck公司）；三乙胺、甲酸銨（AR，南京化學試劑股份有限公司）;乙酸（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；乙酸銨、二乙胺（AR，廊坊鵬彩精細化工有限公司）；(R，S)-煙堿標準品、S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿標準品（＞99%，加拿大TRC公司）。

可填充式電子煙（功率7~10 W，云南中煙工業有限責任公司技術中心提供）；Agilent1290液相色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q-Intergral 5超純水儀（美國Millipore公司）；SHZ-88水浴恒溫振蕩器（金壇市醫療儀器廠）；BT125D電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius科學儀器有限公司)；KQ-700DB數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；有機相濾膜（0.22μm，上海楚定分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理及分析

準確稱取0.2 g電子煙煙液樣品，精確至0.000 1 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇溶液，密閉，放入超聲波水浴中，于常溫下超聲萃取20 min，過濾后進行液相色譜分析。儀器條件：

檢測波長：259 nm；柱溫箱：25℃；進樣量：3 μL；色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T柱（150 mm×4.6 mm，2.7μm）；流動相：V甲醇∶V乙腈=45∶55（甲醇為混合液：V甲醇∶V乙酸∶V三乙胺=100∶0.25∶0.05）；流速：1 mL/min，等度洗脫。

1.2.2 數據處理

采用Origin柱狀圖分析萃取溶劑體積對電子煙煙液中2種煙堿異構體提取效果的影響；采用Agilent OpenLAB數據分析軟件繪制標準工作曲線，獲取回歸方程和相關系數。

2 結果與討論

2.1 手性色譜柱的選擇

為了實現2種煙堿異構體在反相體系中的手性分離，考察了不同色譜柱及分離模式對煙堿異構體的分離效果，選擇與反相色譜流動相匹配的手性柱及其色譜條件，并優化了流動相的比例、添加劑的種類及濃度。考察的手性色譜柱包括Agilent公司的Chiral-T、Chiral-CD柱以及DAICEL公司的IA-3、IC-3柱共4種，在反相色譜模式（Reverse Phase Chromatography，RP）及優化的色譜條件下，發現Agilent Chiral-T柱對2種煙堿異構體的分離度較好（圖1）。因此，本實驗中采用Agilent Chiral-T柱進行后續的煙堿異構體分離。

圖1 不同手性柱對煙堿異構體的分離效果Fig.1 Separation of nicotine isomers by different chiral columns

2.2 流動相添加劑的優化

由于煙堿是二元弱堿，在水溶液中以游離態、單質子態和雙質子態等多種形態存在，用流動相洗脫時容易出現煙堿峰拖尾的現象［12］。在本研究中，考察了流動相的酸堿比例對分離效果的影響。添加劑分別選用乙酸、甲酸、二乙胺、三乙胺和乙酸銨，發現三乙胺的分離效果最好，乙酸次之，二乙胺和乙酸銨均表現較差。采用乙酸-三乙胺的緩沖體系可穩定流動相的pH，從而使煙堿以合適的狀態存在，有利于色譜峰分離。在流動相中添加一定比例的乙酸和三乙胺，具有重現性好以及準確度和靈敏度高的特點，達到了改善峰寬和減少色譜峰拖尾的效果，2種煙堿異構體的分離度達到1.9以上，如圖2所示。采用優化的方法對實際樣品進行分離分析，色譜圖見圖3。可知，實際樣品中2種煙堿異構體的分離度良好，滿足實驗需求。

圖2 外消旋煙堿標準溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard solution for racemic nicotine

圖3 典型電子煙煙液樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of a typical e-liquid sample

2.3 萃取溶劑的選擇

目前，文獻報道的對電子煙煙液中煙堿的萃取溶劑主要是甲醇和異丙醇［11,13-14］，考慮到文獻報道方法與本方法在儀器方法和溶劑體系上均存在差異，因此比較了甲醇和異丙醇作為萃取劑在本方法中的適用性，結果如圖4所示。可見，以甲醇為萃取溶液，溶劑本底低，峰形好，峰面積稍大于異丙醇。由于本方法中采用甲醇為洗脫相，綜合考慮后，選擇甲醇為萃取溶劑。

圖4 不同溶劑對電子煙煙液中2種煙堿異構體萃取效果的影響Fig.4 Effects of different solvents on extraction efficiencies of two nicotine isomers in e-liquids

2.4 萃取體積的選擇

在固定稱樣量的情況下，考察了不同萃取劑體積對電子煙煙液中2種煙堿旋光異構體萃取效果的影響，結果如圖5所示。可知，分別采用10、15、20、25、30 mL甲醇萃取電子煙煙液中的2種煙堿異構體，當萃取溶液為20 mL時所測得的2種煙堿異構體的質量分數均達到最大值。因此，采用20 mL甲醇進行電子煙煙液中2種煙堿異構體的萃取。

圖5 萃取溶劑體積對電子煙煙液中2種煙堿異構體萃取效果的影響Fig.5 Effects of extraction volume on extraction efficiencies of two nicotine isomers in e-liquids

2.5 標準工作曲線及檢測限

根據目標物的檢測濃度和靈敏性，對配制好的系列標準工作溶液進行檢測，以分析物的濃度為橫坐標，S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，獲取回歸方程和相關系數，決定系數(R2)應不小于0.99。對每個物質的最低濃度對應的標準溶液平行測定10次，分別以所得測定結果標準偏差的3倍和10倍為方法的檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，相關結果如表1所示。可知，S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿分別在25~500、0.25~10.00μg/mL濃度范圍內，線性關系良好，R2分別為0.999 6和0.999 4；2種煙堿異構體的檢出限均為0.008 mg/g，定量限均為0.027 mg/g。

表1 方法的線性范圍、回歸方程、決定系數、檢出限和定量限Tab.1 Linear concentration ranges,regression equations,linear correlation coefficients(R2),LODs and LOQs of the method

2.6 精密度和回收率

選取已知濃度的電子煙煙液樣品，考察方法的精密度和回收率。對樣品進行5次日內和日間平行測定，考察方法的精密度。結果（表2）表明，本方法S-(-)-煙堿的日內、日間RSD分別為0.89%、1.26%，R-(+)-煙堿的日內、日間RSD分別為3.98%、4.70%。按高、中、低3個加標水平對已知濃度的電子煙煙液樣品進行回收率實驗，結果見表3。可知，S-(-)-煙堿的回收率在95.87%~104.22%之間，R-(+)-煙堿的回收率在102.43%~108.85%之間。可見，本方法的精密度好，回收率高，表明方法穩定可靠，可用于電子煙煙液中煙堿異構體質量分數的測定。

表2 方法的日內及日間精密度Tab.2 Intra-and inter-day precisions of the method （mg·g-1）

表3 方法的加標回收率Tab.3 Spiked recoveries of the method （%）

2.7 樣品分析

對市售20種不同口味、不同煙堿質量分數的電子煙煙液樣品中煙堿異構體的分析結果見表4。可知，電子煙煙液中煙堿主要為S-(-)-煙堿，其質量分數范圍在2.325～22.042 mg/g之間，而R-(+)-煙堿的量極少，在0.030～0.273 mg/g之間；S-(-)-煙堿的光學純度在96.74%~100.00%之間。在收集的20種電子煙煙液中，未發現外消旋煙堿的使用，可見由于國內對煙堿來源的管控，國內市場上所銷售的電子煙煙液中的煙堿，主要來源于煙草提取物。本研究結果也可為電子煙煙液中煙堿來源的管控提供一種便捷的方法。

表4 電子煙煙液樣品測試結果Tab.4 Test results of the e-liquid samples

2.8 煙堿異構體感官評價結果

據 報 道［15］，非 煙 草 煙 堿（TFN），由Next Generations實驗室合成，Pharmanic公司注冊商標，并在幾家公司的電子煙煙液產品中得到應用。因此煙堿異構體在新型煙草制品中的可用性受到關注［10］。本實驗中對含不同濃度梯度的S-(-)-煙堿、R-(+)-煙堿以及(R，S)-煙堿的電子煙煙液感官差異性進行了評價。以V甘油∶V丙二醇=1∶1為基液，分別將不同煙堿異構體樣品配制成不同濃度的溶液，注入電子煙儲液器中進行感官評吸，評吸結果見表5。結果表明：S-(-)-煙堿、R-(+)-煙堿2種異構體及(R，S)-煙堿消旋體，在勁頭、滿足感、刺激性3項指標上的趨勢一致，均為S-(-)-煙堿＞(R，S)-煙堿＞R-(+)-煙堿，即S-(-)-煙堿的勁頭最高，滿足感最強，刺激性最大。

表5 煙堿異構體的感官評吸得分結果Tab.5 Scores of sensory evaluation of nicotine isomers

3 結論

①建立了穩定便捷的手性色譜柱-反相液相色譜-二極管陣列檢測器分離分析電子煙煙液中的S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿異構體的方法；②對20種市售電子煙煙液樣品中煙堿異構體的分析結果表明，電子煙煙液中煙堿主要為S-(-)-煙堿，其質量分數范圍在2.325～22.042 mg/g之間，S-(-)-煙堿的光學純度在96.74%~100.00%之間，未發現外消旋煙堿的使用；③對煙堿異構體感官差異性評價結果表明：S-(-)-煙堿的勁頭最高，滿足感最強，刺激性也最大；R-(+)-煙堿的勁頭最小，滿足感最低，刺激性也最小；(R，S)-煙堿的勁頭、滿足感和刺激性均介于S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿之間。