食源性致病菌檢測免疫傳感器研究進展

楊 昊， 吳有雪， 吳美嬌， 劉 濤， 李 斌， 田亞晨， 劉 程， 方水琴， 劉 箐

上海理工大學健康科學與工程學院， 上海 200093

據世衛組織報道，每年食源性疾病會導致40多萬人死亡，其中5歲兒童以下死亡病例約占三分一[1]。因此，食品安全已成為全球首要關注的公共安全衛生問題。造成人體食源性疾病的原因有很多，主要包括食品中的病毒、細菌、寄生蟲、毒素和化學物質等，其中食源性致病菌是主要因素之一。目前，食源性致病菌主要有大腸桿菌O157：H7、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等[2]。1996年，日本爆發了大腸桿菌O157：H7食品污染事件，造成6000多人感染，并導致2人死亡。2005年，西班牙發生了預煮雞沙門氏菌污染事件，導致2000多人死亡[3]。食源性致病菌污染不僅能對人體健康造成危害，還會對社會經濟帶來影響。隨著抗生素的濫用，細菌耐藥性逐漸變強，從而導致食品安全問題的加重。因此，實現食源性致病的即時檢測，對預防食源性致病菌感染，降低由食源性造成的損失至關重要。

由于傳統的食源性致病菌檢測方法具有操作繁瑣、耗時長等缺點，無法滿足即時檢測的目的[4]，因此亟需一種快速檢測技術的建立。免疫傳感器具有檢測過程簡單、便攜、特異性強、靈敏度高等優點，可彌補食源性致病菌檢測方法中的不足[5]。本文首先簡述了傳統食源性致病菌檢測方法，然后詳細分析了免疫傳感器各類技術及其在食源性致病菌檢測的應用，以期能夠為食源性致病菌檢測領域的研究人員提供參考和幫助。

1 傳統檢測技術

食源性致病傳統檢測方法主要包括分離培養與生化鑒定法、聚合酶鏈式反應以及免疫學檢測法。分離培養法由于檢測限低、可信度高、操作簡單，是檢測食源性致病菌的金標準[6]。但該方法需要進行微生物的分離培養和多種鑒定實驗，費時費力。聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)是通過檢測目標致病菌的特定核酸序列來達到檢測食源性致病菌的目的。該方法具有特異性強、靈敏度高，檢測時間短等顯著優點，但需要依賴專業的操作人員和昂貴的PCR儀器，使其無法應用在低資源地區[7]。免疫學檢測方法是一種基于抗原抗體特異性結合的方法，主要包括免疫擴散、酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、膠乳聚集實驗、免疫層析法等[8]。免疫擴散是通過抗原抗體在凝膠介質中反應產生沉淀線來實現病原體檢測的。該方法靈敏度低，操作繁瑣，在食源性檢測中應用較少[9]。ELISA是基于抗原抗體特異性反應和高效酶標記技術相結合的免疫學檢測方法。該方法雖然縮短了檢測的時間，降低了檢測成本，但靈敏度較低，且易受外界環境干擾而產生假陽性[10]。免疫層析法是通過帶有標記的抗原或抗體在硝酸纖維素膜上的檢測區域發生免疫反應后產生可視化顏色的現象來實現致病菌的檢測。該方法實現了食源性致病菌的實時便攜性檢測，將檢測時間縮短至5 min～10 min，但依賴于肉眼進行結果的判讀，檢測靈敏度不高[11]。

2 免疫傳感器技術

生物傳感器主要包括識別元件、換能器和放大元件三部分。在檢測時，目標分析物與識別元件特異性結合產生生物化學信號，再利用換能器將化學信號轉化為光、電等可測量的信號，最后通過放大元件實現信號的放大輸出，從而實現對目標分析物的高靈敏度檢測。根據識別元件的不同可以將生物傳感器分為免疫傳感器、DNA傳感器、微生物傳感器等(圖1)。免疫傳感器是基于抗原抗體特異性結合來實現致病菌檢測的，具有特異性強、檢測時間短、靈敏度高等優勢。該方法是免疫化學領域的主要發展方向，在食源性致病菌檢測中應用廣泛[12]。根據免疫傳感器轉化信號的不同，可以將其分為光學免疫傳感器和電化學免疫傳感器。

圖1 生物傳感器組成和類型

2.1 光學免疫傳感器

光學免疫傳感器是利用光學材料修飾抗原或抗體，在發生免疫反應時，通過光的散射、折射、反射、吸收將產生的化學信號轉化為光學信號的一種裝置。該方法具有靈敏度高，抗干擾能力強等優點。目前，常見的光學免疫傳感器主要包括比色免疫傳感器、熒光免疫傳感器、表面等離子共振免疫傳感器和表面增強拉曼光譜免疫傳感器等。表1總結概述了各類光學免疫傳感器在食源性致病菌檢測中的應用。

表1 不同光學免疫傳感器在食源性致病菌中的應用

2.1.1比色免疫生物傳感器

比色法是基于溶液對光的原則性吸收建立的方法。比色免疫生物傳感器通過建立抗原抗體反應與比色物質顏色變化關系，以實現定量檢測的目的，此外這種方法可以通過肉眼觀察從而判斷實驗結果，大大提升了檢測的效率。近年來，酶、金納米顆粒(Gold nanoparticle，AuNPs)和二氧化硅納米顆粒廣泛應用于比色免疫分析中，提高了檢測靈敏度[20]。

金納米棒(Gold nanorods，GNR)具有被氧化后顯示出顏色改變的特性[21]，基于此，GUO等[22]利用磁性納米粒子與鼠傷寒沙門氏菌抗體偶聯，通過旋轉式磁選機對靶標菌進行富集，然后與帶有過氧化氫酶標記的抗體偶聯形成雙抗夾心復合物催化體系中的H2O2，剩余的H2O2與辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)發生反應生成具有強氧化能力的羥基自由基來蝕刻GNR，通過檢測上清中的吸光度變化，來檢測雞肉樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。該方法檢測靈敏度為35 CFU/mL，檢測時間3 h，實現了沙門氏菌的高靈敏度檢測，但該過程需要經過過氧化氫酶催化H2O2和HRP催化H2O2蝕刻GNR兩次反應，因此檢測時間較長。基于此，VERDOODT等[13]開發了一種抗原抗體結合使AuNPs聚集發生顏色的改變的方法，來檢測金黃色葡萄球菌。該方法只需通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，使抗體與AuNPs偶聯，再加入靶標抗原即可實現金黃色葡萄球菌的檢測。檢測時間縮短至1 min，檢測靈敏度為100 CFU/mL。雖然酶和金納米粒子在免疫傳感器中的使用提高了檢測的靈敏度，但這兩種材料具有操作條件苛刻、價格昂貴、使用壽命短等缺陷，在實際應用中存在著不足[23]。有研究人員發現，有色二氧化硅納米顆粒具有合成容易、生產成本低、親水表面大等優點[24]，基于此，SHAMS等[25]利用超順磁性納米顆粒和活性藍二氧化硅納米顆粒分別標記靶標的多克隆抗體(Polyclonal antibody，PAb)和單克隆抗體(Monoclonal antibody，MAb)形成雙抗體夾心模式來檢測食品中的布魯氏菌?；钚运{二氧化硅納米顆粒被體系中的NaOH溶液蝕刻后，活性藍染料釋放出來使溶液變藍。經過磁分離操作后測量上清液的染料吸光度，可以定量檢測布魯氏菌。該方法檢測限為450 CFU/mL，實現了布魯氏菌的高靈敏度檢測，并且該傳感器在120 d內性能保持良好，具有較好的穩定性。

2.1.2熒光免疫傳感器

熒光免疫傳感器是基于熒光現象，將熒光物質標記抗原或抗體實現檢測可視化的一類裝置。目前，常用的熒光標記物有熒光染料、量子點、熒光金屬納米粒子等。這類熒光物質具有較高的光穩定性、較強的熒光信號和良好的生物相容性等優點，常作為蛋白標記材料廣泛應用于免疫傳感器中[26]。

GUO等[27]利用三種有機熒光染料(7-羥基香豆素、異硫氰酸熒光素和羅丹明)分別標記克羅諾桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌和大腸桿菌O157：H7，形成有色細菌，然后通過蛋白G將三種菌的MAb固定在96孔板底部，最后將這三種目標菌污染的牛奶樣品和三種有色細菌依次加入孔中，利用有色細菌與無熒光菌的競爭，實現了對三種菌的多重檢測，檢測限為103CFU/mL。本課題組曾利用異硫氰酸熒光染料標記大腸桿菌O157：H7和其特異性抗體，用于橫向流動免疫分析中雙標記放大信號檢測大腸桿菌O157：H7。固定在結合墊位置的熒光抗體與樣品墊上的熒光細菌結合后層析至檢測線，被檢測線上的另一株大腸桿菌O157：H7抗體所捕獲。對檢測線區域進行紫外激發光照射后,可以看到明亮的黃色條帶，該方法檢測靈敏度為104CFU/mL，檢測時間縮短至5 min～10 min[28]。此外，量子點的應用，開創了食源性致病菌檢測的新方法。DEHGHANI等[29]開發了一種氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)與石墨烯量子點(Graphene quantum dot，GQD)發生熒光共振能量轉移的方法來檢測食品樣品中空腸彎曲桿菌。GQD與抗體偶聯后，發生的免疫反應導致GO和GQD之間的距離增大，熒光共振能量轉移失敗，GQD熒光增強；若溶液中不含有空腸彎曲菌，則GQD與GO通過π-π鍵發生堆積，產生微弱的熒光現象。該傳感器的檢測限為10 CFU/mL，檢測時間為1.5 h。

2.1.3表面等離子體共振免疫傳感器

表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)是基于一定波長的光與薄金屬表面的電子相互作用后產生強烈共振的現象。其檢測原理為病原體與固定在金屬表面的抗體特異性結合后，導致金屬表面質量增加，從而引起光折射率的改變，產生可測量的信號。表面等離子體共振具有快速、無標記、高靈敏度檢測等諸多優點。近年來，通過納米粒子、生物親和分子、酶與金屬片表面的結合，增強了測量信號，提高了檢測靈敏度[30]。FARKA等[31]建立了一種HRP在SPR表面發生催化反應生成沉淀來檢測食品樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。發生免疫反應時，HRP催化4-氯-1-萘酚生成不溶性的苯并-4-氯環己二烯酮，沉淀沉積在SPR表面造成SPR信號的改變。該方法檢測限為104CFU/mL，分析時間為10 min。MASDOR等[32]開發了一種在金芯片表面生成硫醇自組裝分子膜(Self assembled monolayer，SAM)來定量檢測空腸彎曲菌的方法。空腸彎曲菌PAb固定在芯片表面用于捕獲目標菌，之后與AuNps標記的空腸彎曲菌MAb形成雙抗夾心式檢測模式?？贵w抗原的結合導致金芯片表面的光折射率發生改變，從而引起SPR信號發生改變。該方法檢出限為4×104CFU/mL。為了增加SPR傳感器表面抗體的有效固定量，TAHERI等[33]利用蛋白G的生物親和性在SPR表面定向固定抗霍亂弧菌重組外膜蛋白抗體，大大提高了霍亂弧菌重組表面抗原與PAb之間的結合率，檢測靈敏度明顯提高，達到43 CFU/mL。

2.1.4表面增強拉曼光譜免疫傳感器

拉曼光譜是指一定波長的光與物質分子相互作用后，導致光散射頻率改變而產生散射光譜的現象[34]。但這種方法產生的信號比較微弱，限制了其在檢測中的使用[35]。表面增強拉曼光譜(Surface enhancement raman spectroscopy，SERS)是將物質固定在金屬或納米粒子表面來增強拉曼散射，其增強效果通?？蛇_到107～1015倍，因此SERS可用于目標分析物單分子層面的超高靈敏度檢測[36]。CHATTOPADHYAY等[37]開發了一種乙酰乙酰氧基功能化聚合物磁性納米顆粒富集沙門氏菌，利用抗體偶聯帶有SERS標簽修飾的AuNPs來檢測食品中的大腸桿菌。之后通過對免疫復合物形成過程中產生的拉曼散射強度進行掃描，來定量沙門氏菌的濃度。該免疫傳感器實現了沙門氏菌的超高靈敏檢測，檢測靈敏度可達10 CFU/mL。近幾年，有研究人員發現中空AuNPs、花狀AuNPs等具有較高的結構均勻性和光學特性，可以結合更多的SERS標簽，有效實現信號的放大[38]。基于此特性，HWANG等[39]建立了一種拉曼報告分子標記的空心金納米球作為SERS檢測探針的橫向流動免疫分析傳感器，來檢測葡萄球菌腸毒素B。靶標抗原與帶有SERS檢測探針的抗體特異性結合，層析至檢測區，被檢測區固定的另一株特異性抗體所捕獲，發生納米金的聚集而顯色。通過對檢測區的拉曼信號進行測定，實現了在免疫層析試紙條上的便捷式定量檢測。該方法的檢測靈敏度為0.001 ng/mL，與傳統ELISA檢測方法相比，靈敏度提高了三個數量級[40]。此外，在檢測體系中引入多種SERS標簽，可實現致病菌的多重檢測。WU等[41]通過5,5′-二硫代雙和4-MBAL兩種拉曼報告分子標記AuNPs分別與單核細胞增生李斯特氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的MAb偶聯作為信號探針，開發了一種基于LFA的多重SERS免疫傳感器。該方法檢測范圍為102～107CFU/mL，檢測限為75 CFU/mL，檢測時間低至10 min。

2.2 電化學免疫傳感器

電化學免疫傳感器是通過轉換器將免疫反應中的生物信號轉換成電流、電阻、電導等可測量信號的一種裝置，具有靈敏度高、檢測時間短、體型小、成本低等優點，廣泛應用于食源性致病菌的檢測。電化學免疫傳感器在致病菌檢測中的檢測性能主要依賴于電極材料以及抗體在電極表面的固定。因此通過在傳感器中引入石墨烯、碳納米管、銦錫氧化物、紙基以及交叉型陣列微電極等多種新型材料，能有效提高病原菌檢測的靈敏度[42]。電化學免疫傳感器根據傳導信號可分為電流型、阻抗型、電導型和電化學發光四類，表2總結概述了各類電化學免疫傳感器在食源性致病菌檢測中的應用。

表2 不同電化學免疫傳感器在食源性致病菌中的應用

2.2.1電流型免疫傳感器

電流型免疫傳感器是基于抗原抗體免疫反應造成的電極表面電子轉移或者離子聚合物特性的改變，使電流信號發生改變，通過測量電信號來實現食源性致病菌的檢測。SILVA等[49]基于離子聚合物零電流電位測量技術，將抗體固定在AuNPs聚合物膜表面，實現了對沙門氏菌的檢測。體系中無靶標菌時，聚合物膜的離子通量為穩定狀態，無信號的變化；有靶標菌存在時，傳感器表面發生免疫反應阻擋離子的轉移，電流信號發生改變。該電流型免疫傳感器可在1 h內檢測低至6 Cells/mL的沙門氏菌。這種方法實現了沙門氏菌的高靈敏度檢測，但無法對沙門氏菌進行定量檢測。ROUSHANI等[50]建立了一種利用抗蛋白A雞IgY抗體作為捕獲抗體，與AuNPs偶聯后固定在玻碳電極(Glassy carbon electrode，GCE)表面來檢測食品中的金黃色葡萄球菌?？沟鞍譇雞IgY抗體能夠特異性的結合目標菌，從而阻礙電極表面電子的轉移，導致電流發生改變。該免疫傳感器的線性范圍為10～107CFU/mL，檢測限為3.3 CFU/mL，與PCR檢測方法相比，靈敏度提高了100倍[51]。HU等[52]利用HRP可以催化氧化態硫氨酸轉化為還原態硫氨酸的特性，來檢測阪崎腸桿菌。HRP的催化反應可以促進電極表面電子的轉移，當電極表面發生免疫時，阻礙了HRP的活性中心和溶液中的硫氨酸之間的催化反應，造成電極的還原峰電流降低。該傳感器檢測線性范圍為102～109CFU/mL，最低檢測限為91 CFU/mL。

2.2.2阻抗型免疫傳感器

阻抗型免疫傳感器是通過對電極溶液施加正弦直流電壓，使電極表面出現交流阻抗，當電極表面發生免疫反應時，阻抗信號發生改變，以此來實現致病菌的快速檢測。HUANG等[53]為了實現對大腸桿菌的檢測，利用戊二醛將抗體固定在牛血清白蛋白偶聯的3D-銀納米花工作電極表面，免疫反應發生時，電極表面的阻抗發生改變，以此來檢測食品中的大腸桿菌。這種3D-銀納米花結構具有較大的孔隙率、表面積和良好的導電性，有效提高了電化學檢測信號，實現了對檢測限為102CFU/mL大腸桿菌的高靈敏度檢測。雖然Ag、Au等貴金屬納米材料修飾電極，能夠提高了檢測靈敏度，但成本高，且不易合成。為了解決此問題，SOARES等[54]利用激光誘導聚酰亞胺的方法制備了多孔石墨烯作為工作電極，來高靈敏度檢測沙門氏菌。免疫反應導致電極表面的阻抗響應發生改變。該傳感器檢測限為6 CFU/mL，檢測時間為22 min，與Au、Ag納米顆粒的固定材料相比，靈敏度更高，而且降低了檢測成本。此外，隨著綠色合成新型材料方法的發展，以半胱氨酸為模板制備的新一代納米材料也被廣泛應用于免疫傳感器中[55]。PANDEY等[56]利用半胱氨酸綠色合成了石墨烯包裹的氧化銅-半胱氨酸結構(rGO-CysCu)，來作為金電極的修飾材料，通過抗體在金電極表面的固定來檢測飲用水樣品中的大腸桿菌O157：H7。由于rGO-CysCu修飾電極具有較高的比表面積和電子轉移速率常數，因此大大提高了電極的穩定性和靈敏度，檢測限低至3.8 CFU/mL。

2.2.3電化學發光免疫傳感器

2.2.4電導型免疫傳感器

電導型免疫傳感器是基于電極表面發生的免疫反應產生的化學信號通過導電聚合物的轉換作用，將化學信號轉化為可測量的電信號的一種裝置，具有檢測速度快、體型微小等優點。在檢測過程中，電極表面的電導率發生改變，以此來定量檢測目標分析物。ICHI等[61]將抗脂多糖蛋白抗體與羧基化的超順磁性納米粒子共價偶聯后固定在金交叉薄膜電極表面，當抗原抗體結合時，阻礙了電子的轉移，使電解池溶液的電導率降低。該傳感器可用于多種革蘭氏陰性菌的檢測，其中用于大腸桿菌檢測靈敏度為1 CFU/mL。HAN等[62]提出了一種基于單壁碳納米管的微流控場效應晶體管免疫傳感器，使用這種傳感器可以檢測磷酸鹽緩沖液中流動的金黃色葡萄球菌。在這個檢測體系中抗體被固定在功能化的碳納米管表面，當帶負電的細菌流經碳納米管時導致電流增大，電導率變大。該傳感器檢測時間為35 min，檢測限為150 CFU/mL。

3 總結與展望

近幾年，納米粒子等新型材料在免疫傳感器中的應用，增加了抗體表面修飾的信號探針數量，改善了抗體抗原的固定化，提高了檢測靈敏度。除了上述提到的免疫傳感器方法，還有多種新型的免疫傳感器被提出，例如PARK等[63]提出了一種等離子體共振成像免疫傳感器芯片，成功實現了腸炎沙門氏菌、產志賀毒素的大腸桿菌和單核細胞增生李斯特氏菌的多靶標檢測。該免疫傳感器經過菌液富集步驟后，靈敏度可達到1CFU/mL。而且該功能化的生物芯片可重復利用，大大降低了檢測成本。集成微流控的應用實現了食源性致病菌的高通量檢測。PARK等[64]采用環介導等溫擴增和側向流動裝置檢測的集成旋轉式微流控系統檢測水或牛奶中的多種致病菌，檢測限為50 CFU/mL。以上免疫傳感器在成本、靈敏度、特異性方面得到了很大的提高，并擺脫了對大型儀器的依賴，但免疫傳感器在實際應用中仍存在以下幾個問題，表3總結了免疫傳感器在檢測致病菌方面的優缺點。

表3 免疫傳感器各技術優缺點

(1) 靈敏性和穩定性制約著免疫傳感器的發展，提高免疫傳感器的靈敏度和穩定性一直是研究人員研究的的熱點。近期，WEI等[65]開發了一種基于ECL標簽N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾和SERS標簽羅丹明同時固定Ti3C2Tx MXene 電極材料的ECL/SERS 雙模式免疫傳感器，實現了對創傷弧菌的檢測。ECL的線性范圍為1～108CFU/mL，檢出限為1 CFU/mL；SERS的線性范圍為102～108CFU/mL，檢出限為102CFU/mL。Ti3C2Tx MXene 電極材料具有較大的表面積和傳輸電子的能力，可以使更多的SERS標簽和AuNPs負載在電極表面，極大的提高了檢測靈敏度，同時這種雙模式傳感器得到的兩組結果可以相互比較，提高結果的真實性。因此我們可以將電化學和光學技術結合起來，開發更多新型納米材料和微型電極材料，構建雙模式免疫傳感器，提高檢測靈敏度。

(2) 抗體制備比較困難。免疫傳感器主要是基于抗體的特異性識別來實現抗原的檢測，因此抗體的開發就顯得極為重要。目前，抗體的制備具有周期長，操作繁瑣，這增加了免疫傳感器的構建成本，并且篩選到特異性高的抗體極為困難。由于納米抗體具有分子量小、親和力高、能耐高溫強酸強堿等優點，提高了抗體的穩定性和特異性，縮短了制備周期。因此我們可以將納米抗體應用于免疫傳感器中，來提高傳感器的穩定性和使用時間，同時降低傳感器的構建成本。

(3) 大多數檢測樣品中含有復雜的基質，會干擾免疫傳感器的檢測結果。因此在檢測前需要對檢測樣品進行復雜的預處理，比較費時費力。另外，在讀取數據時需要借助于大型的儀器，不能實現檢測的便攜性。因此，可以將傳感器與計算機、智能手機等聯用，開發出一種操作自動化檢測系統，使傳感器向著智能化、自動化方向發展。