羊毛固醇合成酶抑制劑對KCs細胞分化和凋亡的影響

劉 莉，顧亞男，李名聰，黃依璇，張勝權

甲羥戊酸途徑是存在于所有高等真核生物和很多病毒中的一條代謝途徑。羊毛固醇合成酶[1]是甲羥戊酸途徑膽固醇(cholesterol，CH)合成支路中的關鍵中間產物，膠質瘤中的 MI-2是通過破壞CH穩態，抑制CH合成和內源性肝X受體配體的產生來介導的，從而導致CH耗竭和腫瘤細胞調亡[2-3]。

表皮即皮膚的外層，由角質形成細胞(keratinocytes，KCs)組成，該類細胞分化形成一道防護屏障，抵御外界環境傷害。Jans et al[4]表明甲羥戊酸徑中羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑(hydroxymethylglutarate monoacyl coenzyme A reductase inhibitor，PRA)、香葉基轉移酶抑制劑(geranifolyl transferase inhibitor，GGTI)刺激KCs后，能夠抑制Ca2+誘導INV表達[5]。Zhang et al[6]研究指出甲羥戊酸激酶(mevalonic，MVK)的雜合突變可導致播散型淺表性汗孔角化癥(disseminated superficial actinic porokeratosis，DSAP)，汗孔角化癥皮損的特征之一是KCs凋亡[7]，但其具體機制尚不清楚。此外，該實驗室前期研究[8]指出羊毛固醇合成酶抑制劑(lanosterol synthase inhibitor，RO)通過影響周期蛋白表達從而抑制KCs增殖，但RO對KCs分化和凋亡的影響尚未研究。因此，該研究使用了RO探討甲羥戊酸途徑異常對KCs分化和凋亡的影響并探索其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器胎牛血清、 DMEM 、MEPICF 500培養基、0.06 mol/L NaCl 、0.2 mol/L CaCl2、Coating Matrix基質、HKGS(×100)和0.25% 胰酶均購自美國Gibco 公司；Dispase購自美國Sigma公司；RIPA蛋白裂解液、青霉素-鏈霉素溶液(×100)購自上海碧云天生物公司；細胞凋亡試劑盒購自中國上海貝博生物公司；Involucrin、Loricrin、Bcl-2、Bax 及 β-actin均購自美國Abcam公司；二抗購自北京中杉金橋生物公司。貝克曼流式細胞儀CytoFlex、天能電泳儀、天能化學發光成像儀。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 皮膚原代細胞培養見參考文獻[8]。

1.2.2細胞凋亡檢測 胰酶消化收集KCs細胞，并調整細胞懸液濃度為5×104個/ml，分別接種于12孔板，培養箱貼壁培養過夜，單獨加入RO(10 μmol/L)或聯合CH(40 μmol/L)，作用時間分別為 1、2、3 d，對照組培養液中加入相同濃度的PBS。3 d后胰酶消化再次收集細胞，按照凋亡試劑盒操作指南，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。檢測數據結果用 Flowjo 10.0分析。

1.2.3凋亡相關蛋白檢測 將上述處理的KCs細胞用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA)在冰上裂解細胞提取細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后，移膜封閉，1 ∶1 000稀釋Bax 和 Bcl-2，1 ∶10 000 β-actin抗體作為一抗， 4 ℃孵育過夜。TBST漂洗，1 ∶10 000稀釋二抗，室溫孵育2 h。TBST漂洗擦干，按照化學發光試劑盒操作方法進行發光和成像。

1.2.4分化相關蛋白檢測 將RO單獨或聯合CH與KCs 共培養不同時間加入Ca2+(1.8 mmol/L)處理1d后提取KCs細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉膜和封閉后，放入1 ∶1 000稀釋的Involucrin、Loricrin和1 ∶10 000稀釋的 β-actin抗體中4 ℃孵育過夜。TBST漂洗，繼續孵育二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h。TBST漂洗擦干，按照化學發光試劑盒操作方法進行發光和成像。

2 結果

2.1 RO誘導KCs細胞凋亡當RO(10.0 μmol/L)單獨處理KCs后，細胞凋亡率隨著作用時間的增加而增加，第2、3天細胞凋亡率與第0天相比，經方差分析，組間差異有統計學意義(F=152.59，P<0.05)；而當RO 聯合CH處理 KCs 細胞后，CH部分削弱RO對KCs凋亡誘導作用，在2、3 d細胞凋亡率與RO單獨處理 KCs第2、3天細胞凋亡率相比，差異有統計學意義(t1=9.42、t2=10.98，P<0.05)。見圖 1。

2.2 細胞凋亡蛋白表達RO單獨處理KCs后，隨著作用時間的增加，抑制細胞凋亡蛋白 Bcl-2和Bax的表達；當補充CH 處理KCs后，CH能部分減弱RO對Bcl-2的表達抑制作用；Bcl-2/Bax的比值分析表明在單獨RO與KCs共培養時，Bcl-2/Bax的比值隨著共培養時間的增加而降低，而補充CH后，RO對Bcl-2/Bax 比值降低作用減弱，在處理3 d時有顯著性差異，各實驗組與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 RO單獨或聯合CH刺激KCs后對細胞凋亡的影響

2.3 細胞分化蛋白表達Western blot 結果顯示RO單獨與 KCs 細胞共培養，Ca2+處理1 d后， Ca2+誘導的分化標志蛋白Involucrin和 Loricrin 的表達下降；而補充CH到細胞共培養體系后，RO對Involucrin 及 Loricrin 的表達抑制作用未受到顯著影響。見圖 3。

3 討論

甲羥戊酸途徑作為細胞生命活動進程的基本途徑，對于維持細胞正常的生理功能具有重要意義。皮膚是機體最重要的器官之一,主要由KCs組成的表皮構成，能夠防止皮膚水分流失并且阻止體外有害物質損傷皮膚。甲羥戊酸途徑在細胞中經過一系列生命活動過程可形成甾醇類，如CH，可進一步轉化為膽汁酸、類固醇激素等。代謝產生的中間產物及終產物如法尼基焦磷酸，香葉基香葉基焦磷酸提供戊二烯基，參與細胞某些蛋白的翻譯后修飾，對細胞內相關信號轉導產生干擾，導致細胞的增殖、分化、基因表達、蛋白糖基化作用以及細胞骨架的形成等細胞生命活動發生變化。分化是細胞生命活動的必不可少的過程，角質形成細胞的分化成熟表現為從基底層向角質層的逐漸移行。有研究[9-10]表明甲羥戊酸代謝途徑相關酶的抑制劑 ALD、PRA等可抑制由 Ca2+誘導的 KCs 細胞分化標志蛋白的表達，而 CH 補充能夠促進 KCs 細胞分化相關蛋白的表達。在該研究中， RO對KCs細胞Ca2+誘導的分化標志蛋白Involucrin和Loricrin 的表達起抑制作用,而補充CH后對相關分化蛋白的表達抑制并沒有補救作用，這提示RO與ALD和PRA抑制皮膚KCs分化的分子機制不同,可能與其下游產物CH的耗盡無關。細胞凋亡對維持機體內環境穩定起重要作用，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等。Bcl-2和Bax是凋亡途徑中的兩種重要蛋白，Bcl-2/Bax的比值變化影響著細胞凋亡的進程。當其比值下降時，促進細胞凋亡，反之則抑制細胞的凋亡[11]。該研究表明RO 刺激KCs 細胞后可時間性促進 KCs 細胞的凋亡，且細胞內凋亡蛋白 Bcl-2/Bax的比值下降；而補充下游產物 CH 后，可減弱由 RO 造成的細胞凋亡作用，且CH 對Bcl-2/Bax的比值下降有補救作用，該研究結果顯示RO可能通過降低Bcl-2/Bax 的比值而誘導 KCs 細胞凋亡。因此， KCs 的分化和凋亡是一個由許多分子調節的復雜過程。該研究的結果部分解釋了甲羥戊酸途徑功能障礙所致的KCs 分化抑制和凋亡誘導機制。

圖2 Western blot 分析凋亡蛋白表達

圖3 Western blot 分析分化蛋白表達與同時段RO組比較：*P<0.05