免疫檢查點VISTA分子對膿毒癥小鼠免疫炎癥反應的調節作用

陶天柱，張國榮，楊曉明，郭 青 ，劉 珺

膿毒癥是機體對感染的免疫反應失控引起的致命性器官功能損害，是危重病患者死亡的重要原因[1]。流行病學研究[2]顯示全球每年因膿毒癥死亡的病例達到600萬，嚴重膿毒癥的病死率高達25%～30%。膿毒癥早期機體在病原微生物和代謝產物刺激下，產生大量的促炎性炎癥因子和氧自由基。隨著臟器保護和替代治療技術的不斷完善，膿毒癥患者多能度過過度炎癥反應期，而進入長期的免疫抑制狀態[3]。V區Ig抑制子(V-domain Ig suppressor of T-cell activation, VISTA)，也被稱為程序性死亡因子同源物(programmed death 1 homolog, PD-1H)，主要表達于T淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表面。既往研究[4]發現，VISTA分子在抑制淋巴細胞過度活化和維持免疫穩態的過程中發揮重要作用。該文擬通過尾靜脈注射抗VISTA抗體(MH5A)，探討在體激活VISTA信號通路對膿毒癥小鼠免疫功能的調節作用及治療價值。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥小鼠模型建立雄性8～12周齡的C57BL/6小鼠共80只，體質量20～30 g，由海軍軍醫大學實驗動物中心提供。小鼠適應性飼養1周，于術前12 h禁食，隨機數字表法分為盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)組和假手術(Sham)組。經腹部正中切口暴露盲腸，沿距離遠端1 cm處結扎，使用18G穿刺針對穿盲端，輕輕擠出少量腸道內容物，將盲腸還納腹腔后間斷縫合腹膜和皮膚，皮下注射生理鹽水1 ml。假手術組僅暴露盲腸，不給予結扎或穿孔操作。本實驗中的動物處理方法符合動物倫理學標準，經空軍特色醫學中心倫理委員會審查批準。

1.2 主要試劑別藻藍蛋白(allophycocyanin, APC)標記的抗小鼠CD4抗體， 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的抗小鼠CD8抗體，藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標記的抗小鼠VISTA抗體，抗VISTA激動型抗體(克隆號：MH5A)和同型對照抗體(克?。篐TK888)均購自美國Biolegend公司。小鼠細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β和干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)的ELISA試劑盒均購自美國BD Bioscience公司。脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)檢測試劑盒購自美國Chemicon公司。

1.3 單克隆抗體注射治療將CLP小鼠隨機分為抗體治療組(MH5A)和同型對照抗體組(Isotype)，每組8只，分別于CLP術前2 h給予治療組尾靜脈注射100 μg抗VISTA抗體，對照組100 μg同型對照抗體。

1.4 流式細胞術檢測T淋巴細胞VISTA表達變化收集CLP或Sham術后24 h的外周血和脾臟，研磨小鼠脾臟制備單細胞懸液，裂紅液處理后離心去上清液。PBS重懸制備單細胞懸液，加入APC標記的CD4抗體，FITC標記的CD8抗體和PE標記的VISTA抗體，避光孵育30 min，PBS洗滌去上清液后，上機檢測。

1.5 ELISA檢測小鼠外周血細胞因子表達收集小鼠外周血離心取上清液，按照ELISA試劑盒操作步驟逐步加樣檢測細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的表達。

1.6 小鼠腹腔和外周血細菌負荷測定收集小鼠外周血稀釋至103或105倍，制備100 μl懸液；使用2 ml無菌PBS灌洗小鼠腹腔，收集灌洗液稀釋105或107倍，制備懸液。將稀釋后的血和灌洗液均勻涂抹至瓊脂糖平板，于37℃溫箱孵育24 h后計數菌落形成單位(CFU)。

1.7 TUNEL染色檢測脾臟細胞凋亡制備小鼠脾臟石蠟切片，緩沖液孵育后，加入末端脫氧核苷酸轉移酶和dUTP地高辛染色。37℃孵育1 h后停止反應。清洗切片，然后加入抗地高辛過氧化物酶溶液。切片用DAB/H2O2染色，雙苯甲酰胺反染。高倍顯微鏡下計數10個視野中染色陽性的細胞平均數。

1.8 小鼠7 d生存期觀察將小鼠隨機分為Sham組、CLP組、CLP+抗VISTA抗體組和CLP+對照抗體組，每組12只?？筕ISTA抗體組給予抗VISTA抗體100 μg，對照抗體組給予同型對照抗體100 μg，其余組別給予100 μl生理鹽水，觀察術后7 d各組小鼠的生存期。

2 結果

2.1 膿毒癥小鼠淋巴細胞VISTA表達變化如圖1和表1所示，sham和CLP組小鼠外周血和脾臟中CD4+T細胞或CD8+T細胞均表達豐富的VISTA分子，但各組間VISTA平均熒光強度(mean fluores-cence intensity，MFI)比較差異均無統計學意義。

圖1 膿毒癥小鼠外周血和脾臟T淋巴細胞VISTA表達變化MFI：平均熒光強度

表1 膿毒癥小鼠外周血和脾臟T淋巴細胞VISTA表達變化

2.2 MH5A抗體治療可以顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率分別于術前2 h在體給予抗VISTA抗體或同型對照抗體，觀察各組小鼠的7 d生存期，結果顯示：CLP組為16.7%(2/12)，CLP+抗VISTA抗體組66.7%(8/12)，組間差異有統計學意義(P=0.01)。見圖2。

圖2 抗VISTA抗體改善膿毒癥小鼠7 d生存期與CLP組比較：*P<0.05

2.3 抗VISTA抗體抑制促炎性反應，并降低細菌負荷如表2所示，與CLP組相比，抗體治療組促炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的表達水平降低，差異有統計學意義；同時，外周血和腹腔灌洗液培養后細菌集落的數量減少，提示抗體治療組小鼠的細菌清除能力改善。

2.4 抗VISTA抗體減少膿毒癥小鼠脾臟淋巴細胞凋亡TUNEL染色顯示，CLP術后24 h小鼠脾臟中的凋亡細胞數增加(圖3)，差異有統計學意義。與對照組相比，抗VISTA抗體治療后脾臟中的細胞凋亡數量減少，差異有統計學意義(30 123 ± 6 400vs45 482 ± 8 652，P=0.03)，提示抗VISTA抗體可以抑制淋巴細胞的凋亡。

3 討論

隨著膿毒癥病理生理機制研究的不斷深入，調控免疫炎癥紊亂已經成為治療膿毒癥的新方向。既往研究[5]證實，膿毒癥時淋巴細胞的數量、功能和表型均發生顯著變化，且與患者的病情嚴重程度和預后密切相關。免疫檢查點分子是調節淋巴細胞的功能的重要靶點，阻斷程序性死亡分子(PD-1)/程序性死亡分子受體配體(PD-L1)或細胞毒性T細胞相關抗原(CTLA-4)都可以改善淋巴細胞的功能，對膿毒癥小鼠發揮保護作用[6-8]。本文通過在體給予MH5A抗體顯示，調控VISTA通路可以減少淋巴細胞的凋亡，抑制機體炎癥反應，改善細菌清除能力，從而改善膿毒癥小鼠生存期。

多項尸檢研究[9]顯示，在膿毒癥死者的諸多臟器中觀察到免疫細胞如T細胞、樹突狀細胞和B細胞的大量凋亡，且免疫細胞中的免疫檢查點分子表達上調。與其他B7家族的檢查點分子不同，VISTA在對照組小鼠淋巴細胞中表達豐富，而CLP術后24 h未見顯著的升高，提示VISTA信號通路在免疫炎癥反應的啟動階段即可發揮明顯的調節作用。

表2 抗VISTA抗體降低膿毒癥小鼠外周血細胞因子和細菌負荷

圖3 抗VISTA抗體抑制膿毒癥小鼠脾臟淋巴細胞凋亡 TUNEL染色×400a:Sham組; b:CLP組; c:CLP+抗VISTA抗體組; d:CLP+Isotype組; 與CLP組比較：*P<0.05

Wang et al[4]發現，在未活化的淋巴細胞中加入重組VISTA Ig分子片段，對淋巴細胞的凋亡沒有顯著影響。課題組在本研究中觀察到激活VISTA信號通路可以減少CLP小鼠脾臟淋巴細胞的凋亡，但在假手術組給予MH5A抗體對細胞凋亡并無顯著影響(結果未報道)，提示VISTA對淋巴細胞凋亡的調節作用與細胞自身的活化狀態可能相關。MH5A抗體減少淋巴細胞凋亡可能還受到其他因素的間接影響，如促炎性細胞因子TNF-α的分泌減少和細菌負荷的降低。

膿毒癥早期過度的炎癥反應是導致免疫細胞凋亡和重要臟器直接損害的關鍵因素。本研究觀察到MH5A抗體可以顯著降低促炎性細胞因子的產生，其可能的機制包括以下3個方面：① 淋巴細胞細胞因子分泌減少。大量研究[4，10-12]證實，VISTA是負性調控T淋巴細胞免疫反應的靶點，利用重組VISTA Ig分子片段或激活型抗VISTA抗體活化信號通路可以負性調節淋巴細胞的功能，抑制細胞因子如IL-2和IFN-γ的產生。而IL-2和IFN-γ等細胞因子在單核巨噬細胞過度活化的過程中均發揮一定作用，切斷T細胞來源細胞因子的產生可以間接抑制單核巨噬細胞的活化，降低全身的炎癥反應。②VISTA對髓樣細胞的直接作用。VISTA可以同時表達于淋巴細胞和髓樣細胞，發揮受體和配體的雙重作用，但VISTA對髓樣細胞的調節作用目前研究結論尚不一致。Bharaj et al[13]在HIV感染的患者中研究發現，單核細胞過表達VISTA后可以自發性分泌促炎性細胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β。不同的是，Han et al[14]發現，與淋巴細胞的調節作用相似，VISTA也可以負性調節中性粒細胞和漿細胞樣DC分泌細胞因子的功能。VISTA分子對髓樣細胞功能的調節作用和機制尚需進一步研究證實。③細菌負荷的降低。細菌負荷和機體炎癥反應的程度可以互為因果，當細菌負荷降低時，病原微生物和代謝產物對免疫細胞的刺激減少，細胞因子的產生隨之減少。理論上，VISTA抑制淋巴細胞的凋亡可以保護獲得性免疫反應的能力，促進細菌的清除，降低全身和局部的細菌負荷。

綜上，本研究顯示免疫檢查點VISTA分子是調節膿毒癥免疫炎癥反應的重要靶點，MH5A抗體可以阻斷淋巴細胞凋亡途徑，抑制炎癥因子，降低細菌負荷，從而對膿毒癥小鼠發揮重要保護作用。但本研究僅從在體研究著手，存在不足之處，后續研究將進一步闡明VISTA對純化的淋巴細胞亞群和單核巨噬細胞的調節作用，為膿毒癥免疫紊亂的機制研究提供借鑒，并為膿毒癥的免疫調節治療提供理論依據。