冠心病心外膜脂肪組織中KLF7促進炎癥反應及脂肪分化成熟

薛亞軍，黃文華，杜雅彥,3，周奕君，董星星，魏育濤,4

心臟周圍脂肪堆積是公認的易引起冠心病(coronary artery disease, CAD)、心房纖顫和心力衰竭等心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的危險因素[1-2]。心外膜脂肪組織(epicardial adipose tissue, EAT)與心肌組織共享冠脈血供[3-4]。巨噬細胞在CAD患者EAT組織中表現出M1極化和分泌大量炎癥因子。EAT能促進CAD發生發展，EAT有望作為診斷和治療CAD的靶標[1,5-6]。

Kruppel樣因子(Kruppel-like factors, KLFs)屬于鋅指轉錄因子家族[7]，其在基因表達和調控中發揮著不同作用[8]。其中KLF7可調節脂肪細胞的分化和脂肪細胞因子分泌[9-10]。但是，KLF7在CAD患者EAT炎癥中的作用尚未見報道。該研究通過體內及體外細胞實驗觀察KLF7對脂肪細胞分化的作用，旨在探討KLF7在CAD的發生發展中的作用，為闡明CAD發生發展的分子機制提供初步理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究納入2018年1月-2019年10月在石河子大學醫學院第一附屬醫院心胸外科行非體外循環冠狀動脈搭橋術(coronary artery bypass grafting，CABG)的30例CAD患者。其余30例行房間隔缺損修復或瓣膜置換手術而無冠狀動脈狹窄的患者作為對照組，患者資料列于表1。

1.1.1診斷標準 參照我國衛生部發布的《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的診斷標準》(2010年版)以及2011年美國心臟聯合會(American Heart Association，AHA)冠心病診療指南。

1.1.2納入標準 實驗組：① 年齡 40～75(63.8±4.2)歲 ；② 符合CAD的診斷標準需行CABG患者；③ 民族為漢族。對照組：① 年齡在40～75(66.5±7.3)歲；② 冠狀動脈造影陰性且需行瓣膜置換手術(瓣膜為退行性變)患者；③ 民族為漢族。

1.1.3排除標準 ① 合并有糖尿病或糖耐量異常者；② 其他類型心臟病，如風濕性心臟病患者；③ 患有惡性腫瘤者；④ 近期有創傷、外科手術者；⑤ 急、慢性感染者；⑥ 長期肝、腎等臟器疾病及其它內分泌疾病。

1.2 儀器與試劑人單核細胞THP-1細胞和3T3-L1前脂肪細胞均購自中國科學院細胞庫(上海)。RNA提取試劑和qRT-PCR 反應試劑盒購自TaKaRa 公司(日本)。Western blot試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1臨床資料 包括患者年齡、性別、身高、體質量、病程、大生化、心肌酶、超敏C反應蛋白、心臟彩超及頸動脈彩超等。

1.3.2樣本采集 麻醉后1 h，從左心室前壁(與患病段相鄰)收集EAT雙眼樣品(平均重量0.5～1.0 g)。將所有樣品立即保存在RNA穩定劑中，然后轉移至-80 ℃，用于后續實驗。本研究符合石河子大學醫學院一附院醫學倫理委員會程序并通過審批(編號：2014-072-01)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3.3細胞培養 在含有10%FBS(美國Gibco公司)，青霉素(100 μg/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養基(美國HyClone公司)中培養THP-1細胞及3T3-L1前脂肪細胞，在高糖培養基中培養3T3-L1前脂肪細胞，培養環境為37 ℃的含5%CO2的濕潤培養箱。將THP-1細胞以2×105個/孔細胞的密度接種在12孔板中，并使用100 μg/ml phorbol-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(美國Invitrogen公司)持續培養24 h。然后將細胞與20 ng/ml 干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)(美國Gibco公司)和10 ng/ml LPS(美國Sigma-Aldrich公司)孵育24 h以誘導M1巨噬細胞。

1.3.4qRT-PCR檢測相關因子 根據制造商的說明書，使用TRIzol(美國賽默飛世爾科技公司)提取CAD EAT，非CAD EAT和實驗細胞組的總RNA。使用NanoDrop 1000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)測量RNA的純度和濃度。使用帶有基因組脫氧核糖核酸(gDNA)(美國TaKaRa Bio公司)的PrimeS-cript RT試劑盒進行逆轉錄，每個樣品分離出500 ng總RNA。使用7500實時PCR系統(美國Applied Biosystems公司)及QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國Qiagen公司)進行定量實時PCR(qRT-PCR)。EAT中KLF7、APN、IL-6、TNF-α mRNA表達水平，M1型巨噬細胞中APN、MCP-1、IL-6和TNF-α mRNA的表達，以及3T3-L1前脂肪細胞中APN、KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA及脂肪細胞分化標志物PPARγ、C/EBPα、FABP4，表1列出了引物序列。所有實驗均重復3次。使用比較循環時間法計算靶基因轉錄物的相對量。通過比較臨界閾值方法計算每個組織和對照樣品的相對表達水平。

1.3.5Western blot檢測相關因子蛋白表達 將30～50 μg的總蛋白質在100℃下加熱10 min，使用10%凝膠上的SDS-PAGE分離，然后轉移至聚偏二氟乙烯膜上。遵循一抗通過與綴合有HRP的適當的二抗孵育并通過使用Pierce Fast.Western Blot Kit(美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測。該研究中使用的抗體是β-肌動蛋白(ZSGBBIO，CHINA)KLF7(美國Abcam公司)，檢測兩組中KLF7、NF-κB信號通路關鍵因子以及脂肪分化細胞標志因子蛋白表達水平。

1.3.6KLF7小干擾RNA(siRNA)的轉染 siRNA由Gene-Pharma(上海)設計和合成。按照說明書將KLF7 siRNA或陰性對照通過Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)轉染。24 h后通過qRT-PCR評估轉染的KLF7 siRNA的水平來驗證轉染。表1列出了本研究中使用的siRNA序列。

2 結果

2.1 兩組一般資料和生化指標兩組年齡、體質量指數(body mass index，BMI)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)以及甘油三酯(triglycerides，TG)等差異無統計學意義，但超敏C反應蛋白CAD組較non-CAD組升高，脂聯素(Adiponectin，APN)降低(P<0.05)(表2)。

2.2 KLF7在CAD患者EAT中的表達水平檢測KLF7 mRNA在實驗組和對照組EAT中的表達(P<0.001)，見圖1A。通過Western blot驗證KLF7蛋白表達(P<0.05)，見圖1B。

表1 實驗相關引物序列列表

表2 兩組一般資料和生化指標

2.3 EAT炎癥信號通路關鍵基因mRNA表達水平在EAT中，CAD組APN表達水平低于non-CAD組，IL-6、TNF-α、JNK和NF-κB mRNA表達水平高于non-CAD組(P<0.05)，見圖2。

2.4 EAT中的巨噬細胞的鑒別為了確定巨噬細胞類型在EAT炎癥過程中的重要性，使用炎性細胞標記CD68來檢測巨噬細胞的存在。CAD患者EAT中CD68的mRNA水平高于non-CAD組(圖3)。

2.5 KLF7在人類THP-1衍生的巨噬細胞中高表達并由炎癥刺激誘導課題組用特定的KLF7 siRNA(siRNA 1-2)或si-NC瞬時轉染THP-1衍生的M1型巨噬細胞。如圖4A所示，與si-NC相比，si-KLF7-1和si-KLF7-2能夠降低KLF7的表達，si-KLF7-2組最低。為了驗證KLF7 mRNA的轉染效率，測定在轉染相同量si-KLF7由THP-1衍生的M1型巨噬細胞裂解物中KLF7的蛋白表達。結果與本研究在mRNA水平上顯示的結果相同(圖4B)。LPS以時間依賴和劑量依賴的方式影響KLF7 mRNA的表達(圖4C、D)。LPS以時間依賴性和劑量依賴性方式進一步誘導KLF7的表達(圖4E)。KLF7在人類THP-1衍生的巨噬細胞中高表達，并在體外由炎性刺激誘導，這表明它可能調控這些刺激巨噬細胞激活的相關因子。

圖1 KLF7在兩組EAT中的表達

圖2 炎癥信號通路關鍵基因mRNA表達差異

圖3 EAT中巨噬細胞CD68的表達與non-CAD組比較：****P<0.000 1

圖4 KLF7在THP-1衍生的M1型巨噬細胞中的表達

2.6 KLF7促進脂肪細胞分化成熟分別將KLF7模擬物和NC(對照組)轉染到3T3-L1前脂肪細胞中，于轉染后每天檢測FLF7表達，其表達趨勢見圖5A。轉染處理24 h后檢測APN、IL-6、MCP-1 mRNA及脂肪細胞分化標志物過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)、CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸結合蛋白4(FABP4)mRNA的相對表達水平，顯示KLF7模擬物組中APN表達降低，IL-6、MCP-1、PPARγ、C/EBPα和FABP4表達升高(P<0.05)(圖5B)。

3 討論

CAD在世界范圍內發病率很高。CAD可導致心肌缺血、心肌梗塞、心力衰竭、并最終導致死亡。CAD是一種嚴重的慢性疾病，其特征是冠狀動脈進行性動脈粥樣硬化閉塞，導致心肌供需之間不匹配[11]。動脈粥樣硬化被描述為中型動脈內膜的低度炎癥狀態，可因為眾所周知的危險因素(例如高血壓、糖尿病、肥胖癥和血脂異常)而產生。EAT被認為是一種在心包內的異位脂肪[12]。EAT分泌的脂肪因子可以直接從血管周圍脂肪擴散到血管內膜，引起炎癥發生，最終發展為動脈粥樣硬化[13]。脂肪組織駐留的免疫細胞幾乎包括所有類型的免疫細胞，即巨噬細胞、B細胞、T細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞。

圖5 KLF7促進脂肪細胞分化成熟

Kruppel樣因子(Kruppel-like factors, KLFs)屬于鋅指轉錄因子家族，KLFs可調節哺乳動物組織中的多種生物過程，包括細胞增殖、分化、存活以及組織發育[14]。KLFs還控制免疫細胞的功能，例如巨噬細胞，它們參與了心血管疾病和代謝疾病的炎癥過程。本課題組前期研究發現，CAD患者EAT組織中miR-455b-3p通過下調APN的表達從而促進EAT炎癥因子釋放。本研究顯示，CAD患者EAT組織中KLF7 mRNA和蛋白表達水平高于non-CAD組，炎癥相關因子TNF-α、IL-6 JNK、NF-κB mRNA表達水平也高于non-CAD組，而具有抗炎作用的APN卻低于non-CAD組，以上結果提示炎癥狀態與KLF7的表達水平相關。本研究進一步通過體外培養誘導人類THP-1衍生的巨噬細胞，顯示LPS以時間依賴性和劑量依賴性方式誘導KLF7的表達。通過體外培養3T3-L1前脂肪細胞，發現KLF7能促進前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞。EAT在炎癥狀態下，可能通過影響KLF7的表達，進而引起脂肪組織炎癥因子轉錄激活，促進脂肪細胞分化成熟，但其具體作用機制有待進一步研究加以驗證。