伯格替尼通過抑制EGFR磷酸化增強結直腸癌細胞的輻射敏感性

胡關朔，趙國平

結直腸癌是第三大最常見的癌癥[1]，在世界范圍內，每年有超過180萬結直腸癌新增病例，88萬例與結直腸癌有關的死亡報告[2]。臨床上，手術切除被認為是結直腸癌的主要治療手段，放療被認為是手術前后有效的治療方式[3]。因此，迫切需要適當的策略來提高結直腸癌的輻射敏感性。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關，EGFR磷酸化激活下游通路，促進腫瘤細胞存活，輻射之后磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)表達顯著升高，p-EGFR通過促進DNA損傷修復，從而促進細胞存活[4-7]。抑制EGFR磷酸化可能是提高腫瘤細胞輻射敏感性的有效手段。該文以輻射作為處理腫瘤細胞的治療手段，伯格替尼作為EGFR磷酸化抑制劑，以結直腸癌LOVO細胞作為研究對象，旨在通過使用伯格替尼抑制EGFR磷酸化，增強結直腸癌細胞輻射敏感性，從而為結直腸癌治療提供可能的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與輻射處理人結腸癌細胞系LOVO購自中國科學院細胞庫，在DMEM/F12 (美國HyClone公司)培養。所有細胞系均以10%胎牛血清(以色列Biological公司)和1%青霉素/鏈霉素(上海碧云天公司)在37℃、5% CO2的環境中培養。

以伽馬射線輻射器(Biobeam GM X irradiator, 德國Leipzig公司)作為輻射源，使用高能伽馬射線照射細胞，劑量率為3.27 Gy/min，由計算機自動控制。設備每年由廠家進行維護和校準，保證輻射劑量的精度。

1.2 細胞活力測試CCK-8試劑盒測定細胞活力。在96孔板中接種細胞懸液，5 000個/孔細胞，伯格替尼(1 000 nmol/L)處理細胞。藥物治療48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱孵育4 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度(optical density, OD)值。

1.3 化學品及試劑EGFR、p-EGFR(美國CST公司), cleaved caspase-9、cleaved caspase-7、cleaved caspase-3、γ-H2AX、ACTIN(中國proteintech公司), CCK-8(合肥biosharp公司)，伯格替尼(上海MCE公司)，膜蛋白提取試劑盒(上海碧云天公司)。

1.4 免疫熒光將細胞接種于玻片上，用PBST洗滌細胞3次(每次10 min)，再于室溫下用100%甲醇固定20 min。在室溫下用 0.5% Triton X-100滲透細胞30 min，1% BSA在PBST(0.1%，TritonX-100)中在室溫封閉1 h，滴加相應兔來源的單克隆抗體(p-EGFR，1 ∶1 000)于4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次，滴加相應的熒光二抗室溫避光孵育30 min。PBST洗滌3次，細胞核用DAPI孵育3 min。PBST洗滌3次，玻片面朝下置于在玻片上，滴加含有抗熒光淬滅劑的封片劑封片，熒光顯微鏡檢測熒光。

1.5 Western blot實驗分別收集EGFR敲低、單獨輻射處理、單獨伯格替尼處理的LOVO細胞，以及輻射和伯格替尼聯合處理的LOVO細胞。用預冷的PBS洗滌2次，往細胞中加入適量RIPA裂解液(含有羅氏蛋白酶抑制劑)，冰上充分裂解，提取蛋白并進行定量。SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，轉移到5%脫脂奶粉TBST封閉液于室溫封閉1 h。孵育相應來源的單克隆抗體[鼠抗ACTIN(1 ∶1 000)，γ-H2AX(1 ∶1 000)，兔抗：EGFR(1 ∶1 000)，p-EGFR(1 ∶1 000)，cleaved caspase-9(1 ∶1 000)，cleaved caspase-7(1 ∶1 000)和cleaved caspase-3(1 ∶1 000)], 4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，相應二抗室溫孵育1 h，熒光檢測。

1.6 流式細胞分析用預冷的PBS洗滌細胞2次，將細胞重新懸浮在1×緩沖液中，細胞密度為1×105個/ml。將104個細胞轉移到5 ml的培養管中。添加5 μl FITC Annexin V和5 μl PI。輕輕渦旋細胞，并在室溫避光孵育15 min。在每管中添加400 μl緩沖液，1 h內流式細胞儀分析。

1.7 DR-GFP質粒質粒由軍事科學院王治東實驗室贈送。細胞通過兩種主要途徑修復DSBs：非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組(homologous recombination，HR)。NHEJ和HR的發生往往與過早衰老和腫瘤發生有關，因此用定量的方法來測量每個DSB修復途徑是很重要的。課題組利用已經開發的熒光報告結構DR-GFP，測量NHEJ和HR。該結構是基于一個工程GFP基因，包含一個罕見的切割I-SceI內切酶誘導DSBs的識別位點。起始結構為GFP陰性，因為GFP基因被額外的外顯子或突變滅活。 成功修復I-SceI誘導的NHEJ或HR斷裂，恢復功能性GFP基因。通過流式細胞分析術細胞測量計算的GFP陽性細胞的數量，進而提供了NHEJ或HR效率的定量測量。

1.8 構建EGFR敲低的LOVO穩轉細胞系使用三質粒系統構建慢病毒顆粒(pLKO.1，psPAX2和pMD2.G)，psPAX2和pMD2.G是輔助包裝質粒。目標序列為 5′-CCCGTCGCTATCAAGGAATTA-3′，構建的穩轉細胞系使用含嘌呤霉素(1.5%)的完全培養基培養。

2 結果

2.1 輻射誘導EGFR磷酸化水平升高通過Western blot方法檢測EGFR和p-EGFR的表達水平。使用4 Gy的輻射劑量，在不同的時間點對EGFR和p-EGFR的表達水平進行檢測，結果顯示輻射處理細胞24 h后p-EGFR的含量到達最高值(圖1A)，差異有統計學意義(F=26.335，P<0.01)，用不同劑量(0～8 Gy)輻射處理LOVO細胞，24 h后對LOVO細胞的EGFR和p-EGFR的表達水平進行檢測。隨著輻射劑量的升高，EGFR的磷酸化水平升高(圖1B)，差異有統計學意義(F=32.115，P<0.01)。

2.2 輻射誘導細胞膜上EGFR磷酸化水平升高不同劑量(0～8Gy)輻射處理LOVO細胞，24 h后提取LOVO細胞的膜蛋白并對EGFR磷酸化水平進行檢測，Western blot結果顯示，隨著輻射劑量的增加，細胞膜上EGFR的磷酸化水平增高(圖2A)，差異有統計學意義(F=43.332，P<0.01)。通過免疫熒光檢測磷酸化EGFR的定位，4 Gy輻射處理，24 h后對LOVO細胞進行熒光檢測，結果與Western blot結果一致，輻射處理之后細胞膜上EGFR磷酸化水平增高(圖2B)。綜上結果，EGFR是通過自身磷酸化響應輻射。

2.3 伯格替尼呈劑量依賴性抑制EGFR磷酸化水平采用不同濃度的伯格替尼(0、10、100、500、1 000、3 000 nmol/L)處理細胞48 h后檢測細胞活力，結果顯示隨著伯格替尼濃度的升高，LOVO細胞活力被抑制(圖3A)，差異有統計學意義(F=112.365，P<0.01)。Western blot分析結果顯示，EGFR的磷酸化水平隨著藥物濃度的增加而降低(圖3B)，差異有統計學意義(F=132.336，P<0.01)。

圖1 輻照誘導EGFR磷酸化水平升高

圖2 輻照誘導細胞膜上EGFR磷酸化水平升高

圖3 伯格替尼呈劑量依賴性抑制EGFR磷酸化水平

2.4 伯格替尼處理結直腸癌細胞LOVO可以抑制非同源末端連接課題組構建了EGFR敲低的LOVO細胞系，Western blot檢測敲低效果，在EGFR敲低的細胞系中，EGFR和p-EGFR的表達顯著降低(圖4A)，差異有統計學意義(F=21.331，P<0.01)。EGFR通過參與非同源末端連接促進DNA損傷修復，使用DR-GFP系統進行檢驗，該系統的原理如圖所示(圖4B)I-Sce切割AD區域產生非同源末端，如果細胞內存在非同源末端連接，則斷裂區域可被修復，報告基因GFP表達，發出綠光。使用DR-GFP質粒系統檢測細胞非同源末端連接水平，結果顯示在敲低EGFR的LOVO細胞中非同源末端連接被抑制，伯格替尼處理之后，非同源末端連接被抑制(圖4C)，差異有統計學意義(F=36.851，P<0.01)。

2.5 伯格替尼處理可以增強結直腸癌LOVO細胞的輻射敏感性濃度為1 000 nmol/L的伯格替尼處理細胞24 h之后進行4 Gy輻射處理，輻射之后24 h進行Western blot檢測，結果顯示γ-H2AX、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7和 cleaved caspase-9表達升高(圖5A)，差異有統計學意義(P<0.01)。Annexinv FITC/PI 雙標記法檢測結果顯示細胞總凋亡率分別為(6.7±2.3)%、(29.1±3.1)%、(8.2±2.2)%、(33.3±2.5)% (圖5B)，差異有統計學意義(F=21.674，P<0.01)。

圖4 伯格替尼處理結直腸癌細胞LOVO可以抑制非同源末端連接

圖5 伯格替尼處理可以增強結直腸癌LOVO的輻射敏感性

3 討論

結直腸癌是威脅人類健康的一種重大疾病，放療是治療結直腸癌的一種有效手段，但細胞內損傷修復機制的激活會使結直腸癌細胞對放療產生抵抗[8]。EGFR信號通路的激活是產生輻射抵抗的關鍵因素，EGFR對調節細胞生長、增殖和分化起著重要作用，并且與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關[9]。因此探究EGFR信號通路在損傷修復中的作用對結直腸的放療至關重要。

EGFR活化后可以激活ERK和AKT通路促進細胞存活，并且以磷酸化形式轉位入核參與DNA損傷修復，通過促進DNA損傷修復減少細胞凋亡[10]，這可能是癌細胞產生輻射抗性的主要原因。本研究顯示，輻射之后結直腸癌細胞中EGFR的磷酸化水平升高，本實驗使用DR-GFP質粒驗證EGFR主要通過參與非同源末端連接修復導致輻射抵抗，與之前的報道[11]一致。因此抑制EGFR的磷酸化可能是提高結直腸癌細胞輻射敏感性的有效手段。

伯格替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，于2016年5月被食品和藥物管理局(FDA)批準上市，可以有效抑制AKT陽性，三突變的EGFR癌細胞，并在非小細胞肺癌中得到證實[12]。本實驗在結直腸癌細胞驗證了伯格替尼對EGFR磷酸化的抑制作用，伯格替尼呈劑量依賴性的抑制EGFR磷酸化。使用伯格替尼處理細胞后，結直腸癌細胞非同源末端重組修復途徑被顯著抑制。

細胞凋亡是輻射誘導細胞死亡的主要方式[13]，cleaved caspase-9通過激活下游效應蛋白caspase-3和caspase-7產生cleaved caspase-3, cleaved caspase-7進而促進細胞凋亡[14]。本研究顯示伯格替尼聯合輻射處理從而觸發細胞凋亡通路，最終誘導線粒體依賴的內在凋亡，線粒體依賴的內源性凋亡相關蛋白cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, and cleaved caspase-9表達顯著升高，從而增強結直腸癌細胞的放射增敏作用。

綜上所述，伯格替尼通過抑制EGFR的磷酸化導致細胞的非同源末端鏈接修復被抑制，加劇輻射引起的DNA損傷，導致細胞凋亡增加。本實驗首次將伯格替尼與癌癥放射治療相結合，這些數據可能為臨床上結直腸癌治療提供支持。