Supervilin通過Wnt/β-catenin通路調控斑馬魚胚胎集中延伸運動

胡麗珠，趙成剛，范俊啟，楊浩然，張尚榮，陳學冉，方志友

Svil蛋白是Villin/Gelsolin蛋白超家族的一員。目前，哺乳動物中已鑒定出5種亞型[1]。研究[2-5]發現，Svil的主要功能是調節微絲骨架與膜的相互作用，調控細胞存活、增殖、分裂、分化，以及偽足的形成等。然而，Svil在胚胎發育中的作用尚不清楚。

在胚胎發育的早期階段，細胞分裂和遷移是最重要的兩大事件。其中，集中延伸運動(convergence and extension movement， C&E)是原腸期的一個重要遷移事件[6-7]。Wnt/β-catenin通路在C&E中起著重要作用，其靶基因主要包括bozozok(boz)、chordin(chrd)、dickkopf1 (dkk1)、squint(sqt)，Wnt/β-catenin通路異常會導致胚胎發育異常[8-9]。該實驗鑒定出斑馬魚中存在的兩個Svil亞型，其中，Svila與人類Svil1同源性較高，但Svila在斑馬魚胚胎發育過程中的作用尚不清楚。該文旨在探究Svila對斑馬魚胚胎發育的影響以及對原腸胚期C&E的調控機制。

1 材料與方法

1.1 Svil氨基酸序列同源分析使用Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)軟件，鑒定斑馬魚的兩種Svil亞型，Svila[NP 001030338.2]和Svilb[XP 021323763.1]，與人類的4種Svil1[NP 003165.2]、Svil2[NP 068506.2]、Svil3[NP 001310528.1]、Svil4[NP 001310529.1]，進行氨基酸序列比對，分析種屬間同源性。

1.2 斑馬魚培養和Morpholinos注射將斑馬魚(Danio rerio) AB株置于28.5°C的標準實驗室條件下培養[10-11]。次日清晨產下斑馬魚卵，收集、分類。根據斑馬魚Svil序列，分別針對翻譯起始點和外顯子6與內含子7之間的剪接序列設計反義morpholinos (MO)，序列如下：CAATTCGCTCCTTCCTGTTCATGTC (MOATG，針對Svila的起始翻譯位點)；ATGAAGAGAAGAGCACCCGTGTCT (MOsb，針對Svila外顯子6與內含子7之間的剪接序列)；以及對照 MO：ATcAAcAGAAcACTCACgCcTGTC (Con MO, 隨機序列) 。將8 ng MO 注射到斑馬魚胚胎的1～2細胞期，以敲低斑馬魚胚胎Svila的表達。

1.3 RT-PCR使用TRIzol提取斑馬魚胚胎背側組織總RNA，以獲得的RNA為模板，使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TransGen )進行逆轉錄，并獲得cDNA。設計SVILa上下游引物，以獲得的cDNA為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)，將反應后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得目的基因條帶。Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因RT-PCR步驟同上，檢測下游靶蛋白mRNA水平，各下游基因引物如表1所示。

表1 基因引物

1.4 原位雜交設計地高辛(Digoxin)標記的cDNA反義探針。利用正、反向引物，通過反轉錄PCR擴增基因片段，將擴增得到的片段克隆到pCS2+載體(美國Invitrogen公司)中，采用NotI線性化，Sp6 RNA聚合酶轉錄獲得地高辛標記的反義探針。60℃變性，56℃退火。將胚胎固定，在緩沖液中與探針進行雜交反應。洗滌、封閉，與抗熒光素堿性磷酸酯酶結合物保溫1 h，再次洗滌，置于暗處顯色4～24 h，并于光學顯微鏡下觀察結果。

1.5 Western blotWestern blot檢測β-catenin的核定位情況。利用細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒(P0027，上海碧云天生物技術公司)，分別收集胞質和胞核中的總蛋白[12]。加入SDS混合均勻，100℃煮樣10 min；SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移到NC膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min；加入一抗(β-catenin，1：1 000；美國CST公司， #8480)，4℃過夜孵育；PBS洗3次，每次5 min，加入HRG標記的IgG二抗(1：5 000；美國CST公司)室溫孵育40 min，洗膜；用ECL化學發光進行顯色，組蛋白Histon3和β-tubulin分別作為細胞核和細胞質的內參對照。

2 結果

2.1 斑馬魚Svil與人源Svil同源性分析斑馬魚含有兩種Svil亞型，分別為Svila和Svilb，人類有五種Svil亞型，分別為Svil1、Svil2、Svil3、Svil4和Svil5。利用Clustal Omega在線工具進行氨基酸序列比對分析，發現它們在進化上具有相關性(圖1)。使用DNAman軟件分析顯示斑馬魚Svila和人類Svil1在序列上具有56.06%的相似性，尤其是斑馬魚Svilaaa270～427與人類Svil1 aa265～411。然而，Svilb和人類Svil1具有32.70%的相似性(圖1)，這表明斑馬魚Svila是人類中Svil1的同源蛋白。

2.2Svila在斑馬魚胚胎發育過程中的表達模式分析使用RT-PCR分別檢測256細胞期、胚盾期、尾芽期、體節期、24 hpf期、36 hpf期、48 hpf期的Svila表達情況，顯示Svila為母源性表達，且表達量隨著早期胚胎發育的進行呈上升趨勢(圖2A)。利用原位雜交技術檢測斑馬魚胚胎的30%外包期、胚盾期、75%外包期、18 hpf期和36 hpf期Svila的表達，結果顯示在斑馬魚胚胎發育的早期，Svila在整個胚層均有表達，而在胚胎發育后期，Svila主要集中在頭部和體節處表達(圖2B)。這些結果提示Svila可能調控斑馬魚的早期胚胎發育。

2.3 斑馬魚Svila敲低胚胎表型分析為了探索Svila在斑馬魚胚胎發育過程中的功能，分別注射了MOsb(針對SvilamRNA剪切)和MOATG(針對Svila起始翻譯位點)敲低斑馬魚中Svila的表達。與注射對照MO(Con MO)的胚胎相比，注射MOsb的斑馬魚胚胎在48 hpf階段出現了明顯的體軸彎曲。對照組標準差為29±1，敲低組標準差為24±6，每組樣本總數均為30 (圖3B)；注射MOATG的斑馬魚胚胎在48 hpf階段也出現了明顯的體軸彎曲，對照組標準差為48±2，敲低組標準差為37±13，每組樣本總數均為50 (圖3C)。暗示Svila基因的敲低可能會導致斑馬魚胚胎早期原腸胚運動受阻。

2.4 敲低Svila抑制斑馬魚胚胎集中延伸運動在脊椎動物胚胎發育的早期，集中延伸運動和背腹側(dorsab-ventral， DV)軸的形成是最重要的兩個事件。為了探究Svila是否參與了這兩大事件，課題組通過檢測30%外包期斑馬魚胚胎腹側標志物Gata2、Eve1和背側標志物Chordin的表達情況探究Svila對背腹側軸形成的影響。與對照組相比，注射MOsb的胚胎DV軸形成沒有發生明顯異常。對照組3個基因標準差分別為15±0、15±0、14±1；敲低組3個基因標準差分別為13±2、13±2、12±3(樣本總數均為15)。但是，敲低Svila組胚胎頭部和尾部之間的夾角顯著大于對照組，對照組標準差為15±0，敲低組標準差為14±1(每組樣本總數均為15)。這表明Svila的敲低抑制了斑馬魚胚胎的集中延伸運動。見圖4。

圖1 斑馬魚Svil(Svila和Svilb)與人類4種Svil1(Svil, Svil2, Svil3和Svil4)氨基酸序列比對結果

圖2 斑馬魚Svila早期胚胎中表達模式

圖3 敲低Svila斑馬魚胚胎發育至48 hpf表型統計分析

圖4 敲低Svila斑馬魚早期胚胎背腹軸的形成及集中延伸運動的影響

2.5Svila可能是通過Wnt/β-catenin通路調控斑馬魚胚胎發育為了檢測Svila是否通過影響Wnt/β-catenin通路調控斑馬魚胚胎發育，進行核質分離實驗。分別收集胞質蛋白和胞核蛋白，隨后使用Western blot實驗分析。結果顯示，與對照組相比，Svila敲低后細胞核中β-catenin含量明顯降低(圖5) (P=0.000 6、0.000 2，F=12.42、7.785)，差異有統計學意義。在細胞質內，敲低Svila組與對照組相比，β-catenin表達也下調(P=0.004 6、0.000 3，F=792.9、345)，差異有統計學意義。組間分析結果顯示對照組之間P值為1，無明顯差異；注射MOsb組P=0.000 4，F=233.1，差異有統計學意義；注射MOATG組P<0.000 1，F=161.9，差異有統計學意義。同時，RT-PCR結果也顯示Svila敲低組中Wnt/β-catenin信號通路的靶蛋白boz、dkk1和sqt的表達均發生下調(圖5C)，boz組P=0.001 2，0.015 0；dkk1組P=0.000 2、0.001 3；sqt組P=0.001 3、0.005 0，chrd組P=0.393 3、0.285 4。綜上所述，Svila主要通過Wnt/β-catenin信號通路調控斑馬魚胚胎的集中延伸運動。

圖5 敲低Svila將抑制Wnt/β-catenin信號通路

3 討論

Svil作為細胞微絲骨架結合蛋白，通過與肌動蛋白和肌球蛋白相互作用調節細胞骨架動力學，通過影響其他蛋白的定位和分布調控細胞內多種活動[13]。例如，Svil調控偽足小體的形成[5]，調控細胞存活、細胞分裂、細胞遷移等[3-4, 14]。在胚胎發育過程中，細胞分裂、分化和遷移是在不同階段以不同比例發生的重要事件。在原腸胚期，細胞的正確定位和各個組織的正常發育離不開細胞遷移。

Svil是Gelsolin蛋白家族的一員[1]。據報道，這個家族的其他成員在胚胎發育的特定階段發揮著不同的作用。Svil在細胞水平上的功能研究的較多，但其在胚胎發育中的作用尚不清楚。本研究結果表明，Svila敲低抑制了斑馬魚胚胎的集中延伸運動，Svila表達的下調會影響β-catenin在細胞核上的定位，導致β-catenin的靶基因boz、dkk1、sqt等表達異常。綜上所述，Svila的敲低降低了細胞遷移能力，從而阻斷了斑馬魚原腸胚期的集中延伸運動，其作用機制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來實現的。