TAK-733對人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞生物學行為影響的研究

鄭 朦，魏 楓，邵 國，王曉艷，程 冉，張 苑

甲狀腺癌(thyroid cancer，TC)是內分泌系統最為常見的惡性腫瘤，其中，人甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)占所有TC的70%～80%，是最常見的類型[1]。目前國際上公認的PTC常規治療手段為“手術+131I+促甲狀腺激素(TSH)抑制治療”[2]，大多數患者預后良好，但仍有1/3的患者出現復發[3]。已知PTC的發生、發展與某些信號通路的活性改變存在密切聯系。其中Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的過度激活是其中最為常見的遺傳學變異，與細胞的增殖、凋亡和遷移等生物學行為密切相關[4]。近年來隨著分子生物學研究的不斷深入，特異靶向信號通路關鍵分子的抑制劑成為新藥研發的重點[5]。(R)-3-(2,3-二羥丙基)-6-氟-5-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-8-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733)是一種高效選擇性的非ATP競爭性MEK 1/2激酶變構抑制劑，于2011年被首次合成。de la Puente et al[6]研究表明TAK-733在多發性骨髓瘤中表現出抗腫瘤活性，其可抑制多發性骨髓瘤U266細胞增殖，誘導細胞凋亡,并且促進細胞發生G1期阻滯。該研究以人甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary carcinoma,TPC)-1細胞為研究對象，通過體外細胞初步探討TAK-733對PTC的影響,為PTC的藥物治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞購自上海復旦細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 TAK-733購自美國MCE公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)、青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)和MTT粉末購自美國Sigma公司；碘化丙啶(PI)和細胞凋亡試劑盒Annexin V-FITC購自大連美侖生物技術有限公司；RNA酶(RNase A)購自北京天根生物科技公司

1.1.3實驗儀器 3111型CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；ELX-800全自動酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；FACSCantoTMⅡ流式細胞儀(美國BD 公司)；TE2000-U倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 TPC-1細胞用含10% FBS，1%青鏈霉素混合液的RPMI 1640完全培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無菌培養箱中培養。

1.2.2實驗分組 將人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞分為實驗組和對照組，各實驗組的藥物濃度梯度分別為2.5、5、10 μmol/L，對照組加入普通培養基。

1.2.3溶液配制 按照產品說明書寫明的方法使用DMSO將TAK-733粉末完全溶解，配制成終濃度為20 mmol/L的儲存液。實驗過程中用RPMI 1640培養基將其稀釋成終濃度為2.5、5、10 μmol/L的工作液，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.4MTT比色分析法檢測細胞增殖抑制率 取處于對數生長期的TPC-1細胞，以3×104個/ml 接種于96孔板中，每孔加入100 μl細胞培養液。培養過夜后實驗分組同1.2.2,每組設6個復孔。藥物干預24、48、72 h后，向各孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，繼續培養4 h，棄去培養基加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，使紫色結晶充分溶解。將酶標儀波長設為490 nm，檢測各孔吸光度值(OD值)，計算細胞的增殖抑制率，抑制率=(OD對照組-OD實驗組)/OD對照組×100%。獨立重復實驗3次。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期 將TPC-1細胞以1×106個/皿密度接種于 60 mm培養皿，細胞貼壁后實驗分組同1.2.2，分別于24、48 h后用胰蛋白酶消化收集細胞，1 200 r/min離心5 min后用提前預冷的PBS洗2次，收集細胞沉淀于75%冷乙醇中固定過夜，24 h后1 200 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS洗2次，PBS重懸細胞，加入RNase A，37 ℃水浴30 min，加入PI染料，室溫下染色30 min后應用流式細胞儀分析488 nm處激發波長熒光強度。獨立重復實驗3次。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞的接種培養及分組同1.2.5。藥物干預24、48 h后收集各組細胞，1 200 r/min離心5 min,預冷PBS洗滌2遍,1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1×Binding Buffer 500 μl重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻,室溫避光孵育10～15 min，然后以流式細胞儀上機檢測分析。獨立重復實驗3次。

1.2.7劃痕愈合試驗檢測細胞遷移能力 取處于對數生長期的TPC-1細胞，消化離心后將細胞按5×105個/ml的密度接種至6 孔板，每孔2 ml細胞懸液。待細胞貼壁后，用200 μl槍頭于培養孔正中處垂直劃線，PBS 緩沖液清3次，實驗分組同1.2.2項。熒光倒置顯微鏡下分別拍照記錄0 h和24 h的劃痕區域面積; 遷移率(%)=(1-24 h劃痕區域面積/0 h劃痕區域面積)×100%。獨立重復實驗3次。

2 結果

2.1 不同濃度TAK-733對TPC-1細胞增殖的影響MTT實驗顯示，比較3個濃度實驗組與對照組的細胞增殖抑制率,差異均有統計學意義 (P<0.05)。當處理時間一定時，隨著TAK-733的濃度增加，TPC-1細胞的增殖抑制率逐漸增高(F=336.822、671.322、1 498.396,P<0.05)；且相同濃度的TAK-733在不同的作用時間點，隨著作用時間的不斷延長，TPC-1細胞的增殖抑制率也逐漸增高(F=86.547、296.955、296.222,P<0.05)，TAK-733對TPC-1細胞生長的抑制作用呈時間和劑量依賴性。見表1。

表1 不同濃度TAK-733對TPC-1細胞增殖抑制率的影響

2.2 不同濃度TAK-733 對 TPC-1細胞周期的影響流式細胞術檢測TAK-733實驗組和對照組細胞周期，結果顯示相比于對照組，隨著TAK-733處理濃度增加，G1/G0期細胞比例逐漸增多(F=58.536、179.347,P<0.05)，S期(F=34.894、76.293,P<0.05)和G2/M期(F=24.192、96.688,P<0.05)細胞比例相對減少，差異有統計學意義。而當處理濃度一定時，隨著時間的延長，G1/G0期細胞比例亦逐漸增多(t=-10.447、-12.209、-8.839,P<0.05)，S期(t=8.003、9.682、10.342，P<0.05)和G2/M期(t=6.112、10.220、3.349，P<0.05)細胞比例逐漸減少，差異有統計學意義。說明細胞發生G1/G0阻滯，此時TPC-1細胞的生長停滯，且這種抑制作用隨著作用濃度的增加和時間的延長而逐漸加強。見表2及圖1、2。

表2 不同濃度TAK-733作用不同時間對TPC-1細胞周期的影響

圖1 不同濃度TAK-733對TPC-1細胞作用不同時間細胞周期的分布圖

圖2 不同濃度TAK-733對TPC-1細胞作用不同時間細胞周期的百分比

2.3 不同濃度TAK-733 對TPC-1細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，各實驗組凋亡率均增高，處理時間一定時，隨著TAK-733濃度的增加，凋亡率逐漸增加，差異有統計學意義(F=59.929、94.542,P<0.05)。并且相同濃度的TAK-733作用48 h后的凋亡率高于24 h，差異有統計學意義(t=-4.888、-4.962、-4.275，P<0.05)。見圖3、4。

2.4 不同濃度TAK-733 對TPC-1細胞遷移的影響不同濃度的TAK-733作用于TPC-1細胞后，TPC-1細胞的遷移能力不同，實驗組的劃痕愈合率均小于對照組，差異有統計學意義 (F=37.086,P<0.05)，且隨著TAK-733濃度的增加，劃痕愈合率亦逐漸降低。見圖5、6。

3 討論

作為最常見的內分泌癌，TC約占全身惡性腫瘤的1%[7]。近年來TC的發病率呈現明顯的上升趨勢，其中以PTC情況最為突出。盡管PTC常規治療后總體預后良好，5年生存率可達到98%[8]，但出現復發和轉移的部分患者仍然值得關注。為了降低術后復發的風險、改善患者的生存狀況，從分子生物學層面深入了解惡性腫瘤的相關致病機制已經成為當前研究的熱點。近年來，靶向藥物在惡性腫瘤的中晚期治療中的成功應用被廣泛認可，為廣大患者帶來了福音與希望。因此，靶向藥物的開發與利用是當前腫瘤治療的潮流所向。

圖3 不同濃度TAK-733作用不同時間的TPC-1細胞凋亡率的分布圖

圖4 不同濃度TAK-733作用不同時間對TPC-1細胞凋亡率的影響

Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的過度激活被認為在多種惡性腫瘤的發生發展中起到重要作用?，F有研究[9-11]已證實，在PTC中亦存在Ras/Raf/MEK/ERK信號通路過度激活。該信號通路的激活在于Raf、MEK、ERK依次發生磷酸化[12]。磷酸化的ERK進一步影響其下游重要的信號分子，從而調控細胞的增殖、分化、遷移等重要的生理活動。在整個通路中，ERK是MEK下游的唯一底物，這無疑表明了MEK在通路中至關重要的地位。近年來，關于針對MEK抑制劑的研發得到了廣泛關注。TAK-733作為一種新型的MEK 1/2抑制劑，可選擇性結合并抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號通路上的關鍵信號分子MEK 1/2的活性，從而阻止了依賴MEK 1/2的效應蛋白和轉錄因子的激活，尤其對MEK 1/2下游靶點ERK 1/2的磷酸化有明顯的抑制作用[13]。多項研究證實,TAK-733在多種惡性腫瘤中可發揮抗腫瘤作用。von Euw et al[14]體外細胞研究提示TAK-733干預后黑色素瘤細胞增殖受到抑制，細胞發生G1期阻滯。Baranski et al[15]通過實驗表明TAK-733作用于骨肉瘤細胞后，可引起MOS和U2OS兩種細胞的凋亡蛋白Caspase 3/7顯著增加。

圖5 不同濃度TAK-733處理TPC-1細胞24 h的劃痕分布

圖6 不同濃度TAK-733對TPC-1細胞遷移的影響

MTT實驗結果顯示，不同濃度TAK-733處理TPC-1細胞24、48、72 h后，實驗組細胞增殖抑制率均高于對照組，且低、中、高劑量組細胞增殖抑制率依次增高,均隨處理時間的延長而增高，這與Micel et al[13]對黑色素瘤細胞的研究中顯示TAK-733可抑制細胞的增殖結果類似。因此，可推斷TAK-733作用于人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞，MAPK/ERK通路的的活化程度被抑制后細胞的增殖能力減弱。

為對TAK-733抑制TPC-1細胞增殖的相關作用機制進行更深一步的探索，該研究采用了流式細胞術對細胞周期進行檢測分析。結果顯示，與對照組相比，以不同濃度TAK-733分別處理TPC-1細胞24、48 h后，TPC-1細胞的G1/G0期細胞比例均上升，而S期和G2/M期細胞比例則相對降低。隨著TAK-733濃度的逐漸增加和處理時間的延長，G1/G0期細胞比例逐漸增高，S期和G2/M期細胞比例逐漸降低。提示TAK-733可阻滯細胞周期，使TPC-1細胞發生G1/G0期停滯，細胞分裂不能繼續往下進行，從而抑制癌細胞的增殖。

該研究還采用Annexin V-FITC/PI雙染法對細胞凋亡進行了檢測。以不同濃度TAK-733分別處理TPC-1細胞24、48 h。與對照組相比，不同濃度的TAK-733干預后細胞的凋亡率均增高，且低、中、高劑量組細胞凋亡率依次增高,各組凋亡率均隨處理時間的延長而增高。進一步證實TAK-733可促進TPC-1細胞的凋亡。

此外，該研究還通過劃痕愈合實驗初步研究腫瘤細胞的遷移能力,通過計算細胞實驗組與對照組的劃痕愈合率來判斷細胞遷移能力的強弱。實驗中觀察到與對照組相比，低、中、高濃度的TAK-733干預TPC-1細胞24 h后細胞的劃痕愈合率均降低，且隨著TAK-733濃度的逐漸增加，劃痕愈合率逐漸降低。提示TAK-733在PTC的發展中可抑制TPC-1細胞的遷移，從而發揮強大的抗腫瘤作用。

綜上所述，TAK-733能通過將TPC-1細胞阻滯于G1/G0期而抑制細胞的增殖和遷移, 促進癌細胞凋亡。該研究為PTC的靶向治療提供了新的思路。