右美托咪定對心肌缺血再灌注所致腦損傷的影響

吳科帆，張愛寧，季燁龍，張 藝，江 夢，夏中元

心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)是治療心肌梗死的主要方法，同時也是加重心肌損傷的機制之一。雖然它可以提供心肌有氧代謝所必需的氧氣和營養物質，但血流的重建和恢復可以對心肌產生更嚴重的打擊，稱為缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)[1]。研究[2]表明IRI可導致細胞內離子堆積、線粒體膜損傷、活性氧形成、一氧化氮代謝紊亂、內皮功能障礙、血小板聚集、免疫激活、細胞凋亡和自噬等多種病理生理過程。大腦作為人體生命中樞器官，雖有血腦屏障的保護，仍易由于體內血液再分布而遭受侵襲，導致IRI后的繼發性腦損傷[3]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種高選擇性的α2-腎上腺素能受體激動劑，對心臟、腎臟等器官的缺血再灌注損傷有保護作用。已有研究[4-6]證實Dex可通過抑制內質網應激和炎癥反應等途徑減輕糖尿病大鼠腦損傷。該研究擬觀察右美托咪定預處理對心肌缺血再灌注所致腦損傷的影響，并探究其與全身炎癥反應及內質網應激的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器SD大鼠購自北京維通利華實驗技術有限公司。右美托咪定購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(批號：14030332)。CCAAT-增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancer-bindingproteinhomologousprotein，Chop)、免疫球蛋白結合蛋白(bindingimmunoglobulinprotein，Bip)一抗購自美國Abcam公司，磷酸化真核生物起始因子2(phosphorylated-αsubunit of eukaryotic initiation factor 2，p-eif-2α)、磷酸化蛋白激酶RNA樣內質網激酶(phosphorylated proteinkinase RNA-likeendoplasmicreticulumkinase，p-perk)一抗購自美國CST公司，熒光二抗購自美國LI-COR公司。DW-2000型小動物呼吸機購自上海嘉鵬科技有限公司，BX50型光學顯微鏡購自日本Olympus公司，ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀購自美國LI-COR公司。

1.2 實驗分組與處理SPF級健康雄性SD大鼠24只，體質量200～220 g，6～8周齡，采用隨機數字表法分為3組，每組8只：假手術組(S組)、心肌缺血再灌注組(IR組)、心肌缺血再灌注+右美托咪定組(IR+Dex組)。于標準SPF級環境進行適應性飼養1周，術前禁食12 h。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉并固定，同時進行心電監測。S組只穿線，不結扎LAD。IR+DEX組于再灌注開始時給予IR+Dex組靜脈注射右美托咪定25 μg/kg，S組和IR組靜脈注射等容量0.9%氯化鈉溶液。將大鼠氣管切開行氣管插管術，連接小動物呼吸機進行機械通氣。開胸暴露大鼠心臟，用7-0帶線縫針結扎冠狀動脈左前降支(LAD)30 min，肉眼觀察心尖部變白，室壁運動減弱，同時心電監測出現明顯ST段背向上抬高，認為心肌缺血再灌注模型造模成功。松開線結可見心電圖ST段回落，心尖部恢復紅潤，表明再灌注成功，再灌注120 min后即刻經頸動脈采集血樣，斷頭處死大鼠取腦組織。

1.3 觀察指標以及檢測方法

1.3.1HE染色觀察大鼠腦組織病理結果 再灌注120 min后取腦組織，石蠟包埋后于切片機切片，置于4%多聚甲醛液固定24 h，HE染色后于光鏡下觀察病理結果。

1.3.2ELISA法檢測血清炎性因子IL-6、IL-8、IL-10 再灌注120 min后即刻經頸動脈采集血樣，于4 ℃下2 000 r/min離心15 min，離心半徑8.6 cm，取上清液，使用ELISA試劑盒測定血清IL-6、IL-8和IL-10水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3.3Western blot法測定大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達水平 取大鼠海馬組織，置于冰上加入RIPA裂解液裂解30 min，冰浴電動勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，離心半徑8.6 cm，取上清液于-20 ℃凍存。采用BCA法測定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液并混勻煮沸10 min，行PAGE凝膠電泳，后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入Chop一抗(稀釋度1 ∶1 000)、Bip一抗(稀釋度1 ∶1 000)、p-eif-2α一抗(稀釋度1 ∶1 000)和p-perk一抗(稀釋度1 ∶1 000)，4 ℃下搖床孵育過夜。TBST洗滌3次， 10 min/次，加入熒光二抗(稀釋度1 ∶10 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，10 min/次。紅外成像顯影儀掃描分析熒光蛋白條帶，測定各目的蛋白條帶灰度值。用GAPDH作為內參，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 心肌缺血再灌注后腦組織病理切片觀察光鏡下，S組可見神經元清晰排列，胞質豐富，核圓形，堿染呈藍色，結構較為清晰，未見明顯異常。IR組神經元病理損傷較重，形態不規則，胞質分布不均，有空泡，核固縮、溶解或消失，細胞結構被破壞，核染色不均勻，呈淡紅色。IR+Dex組中，神經元損傷減輕，大多數胞膜完整，核仁清晰可見。見圖1。

圖1 三組大鼠海馬組織病理學結果 HE ×40

2.2 ELISA檢測心肌缺血再灌注后血清炎性因子與S組比較，IR組和IR+Dex組血清炎性因子IL-6、IL-8表達均增加(P<0.05)，IL-10的表達減少(P<0.05)。與IR組比較，IR+Dex組IL-6、IL-8表達有所下調(P<0.05)，而IL-10的表達增加(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清炎性因子IL-6、IL-8和IL-10水平的比較

2.3 心肌缺血再灌注后大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達與S組比較，IR組和IR+Dex組大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk蛋白表達水平均上調(P<0.05)。與IR組比較，進行了右美托咪定預處理后的心肌缺血再灌注后的大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達有所下調(P<0.05)。見表2、圖2。

3 討論

該研究參照文獻[7]制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，即于氣管插管后結扎LAD 30 min，解除結扎后再灌注120 min。結果顯示，與S組比較，IR組大鼠腦組織中神經元出現病理損傷，細胞結構遭到破壞，提示心肌缺血再灌注誘發了大鼠腦損傷。該研究參照文獻[8]于再灌注開始時給予IR+Dex組25 μg/kg右美托咪定,S組和IR組注射等容量0.9%氧化鈉溶液。結果顯示，與IR組比較，IR+Dex組腦組織病理學損傷減輕，細胞鏡下無明顯損傷，提示右美托咪定預處理減輕了心肌缺血再灌注所致的大鼠腦損傷。

圖2 3組大鼠海馬組織Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的Western blot表達條帶

表2 3組大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk/GADPH表達的比較

再灌注引發的炎癥反應是心肌再灌注缺血損傷的重要環節。在炎癥應答機制中，許多細胞因子如IL-6、IL-8等被釋放[9]，而抗炎因子IL-10被大量消耗[10]。ELISA結果顯示，與S組比較，IR組和IR+Dex組IL-6、IL-8表達增加，IL-10表達減少；與IR組比較，IR+Dex組IL-6、IL-8表達下調，而IL-10表達增加。提示心肌缺血再灌注引發的炎癥反應使血液中炎性介質通過機體內的血液再分布進入腦組織并導致相應損傷，而右美托咪定預處理可通過抑制全身炎癥反應減輕腦組織損傷。

內質網應激是指細胞內質網內穩態失衡導致細胞生理功能發生改變的一種病理反應，是由于各種病理和生理事件導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質的積累加速的狀態[11]。蛋白激酶RNA樣內質網激酶PERK是位于內質網膜上的一種I型跨膜蛋白，屬于真核生物起始因子2上游激酶家族中的一種。內質網應激早期，通過Bip免疫球蛋白結合蛋白Bip在上游激活PERK信號通路抑制蛋白質的合成，對細胞起保護作用、促進細胞生存。隨著內質網應激時間的延長，PERK通過誘導Chop的表達而促進細胞凋亡。PERK信號途徑在中樞神經系統損傷、缺血再灌注損傷及代謝異常等病理過程中發揮著重要的作用[12-13]。內質網應激作為介導腦缺血眾多反應的復雜機制，與缺血后神經元細胞死亡有關[14]。心肌發生缺血再灌注時，心肌的缺血低氧繼發了腦組織的缺血低氧，神經元出現能量代謝障礙誘發內質網應激，再灌注后腦組織血流恢復，血液中產生的各種離子、介質加重內質網應激[15]。Western blot結果顯示，與S組比較，IR組和IR+Dex組大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk蛋白表達上調；與IR組比較，IR+Dex組海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達下調，提示右美托咪定預處理可能通過抑制內質網應激減輕大鼠心肌缺血再灌注所致腦損傷。

綜上所述，右美托咪定預處理可減輕心肌缺血再灌注所致的腦損傷，其機制可能與減輕全身炎癥反應、抑制內質網應激有關。