肺腺癌中Ki-67表達與EGFR基因突變的相關性 及其在預后中的價值

潘 誠，李志華，徐文正，陳 亮

肺癌是我國發病及死亡人數最多的惡性腫瘤。其中，肺腺癌是肺癌主要病理亞型之一[1]。盡管薄層CT的普及使得更多早期肺癌病例得以發現，然而，我國肺癌患者總體5年生存率仍不足30%[2]。Ki-67由MKI67基因編碼，其表達量的高低能夠反映腫瘤細胞增殖能力。研究[3-4]表明，Ki-67表達與腫瘤大小、淋巴結轉移以及肺癌患者預后相關。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變是肺癌最常見的基因突變之一[5]。既往已有數篇研究圍繞Ki-67表達與EGFR突變的相關性展開。然而，研究結果并不一致，存在樣本量低、分析簡單、未進一步分析Ki-67蛋白聯合EGFR突變在肺腺癌預后中的價值等不足。因此，該研究回顧性分析673例肺腺癌患者資料，探索Ki-67表達與EGFR基因突變的相關性，并揭示其在肺腺癌預后中的價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性篩選2014年1月-2020年4月于本院接受手術治療的肺癌患者。主要納入標準如下：①經組織病理學確診的原發肺腺癌；②浸潤性肺腺癌；③單發肺癌；④有明確的Ki-67蛋白表達及EGFR基因突變檢測結果。

1.2 Ki-67蛋白表達及EGFR基因突變檢測采用免疫組織化學檢測肺腺癌組織中Ki-67蛋白表達(Ki-67抗體，ab92742，上海Abcam公司)。根據試劑盒說明書進行實驗操作，采用DAB、蘇木精進行染色。由經驗豐富的病理科醫師進行閱片，每張切片選取5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞(細胞核呈棕色顆粒)百分比。采用ADx-ARMS法或者PCR-Sanger法檢測EGFR 18-21外顯子突變情況。

1.3 統計學處理分別采用卡方檢驗、Student’st檢驗(或方差分析)比較分類變量、連續變量組間分布差異。采用斯皮爾曼等級相關(Spearman’s rho)評價Ki-67蛋白表達與EGFR基因突變相關性分析；采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析比較Ki-67表達、EGFR基因突變對肺腺癌患者預后的影響。所有統計分析均基于R (v3.6.0)及GraphPad Prism (v6.01)完成，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象臨床病理特征本研究共納入673例浸潤性肺腺癌病例。其中，男性222例(32.99%)，女性451例(67.01%)。患者平均年齡(59.82±10.90)歲，平均腫瘤大小(19.24±9.94)mm。有76例(11.29%)患者出現淋巴結轉移。研究對象具體臨床病理特征見表1。

表1 研究對象基本特征

2.2 Ki-67表達與臨床病理特征的相關性如表1所示，肺腺癌患者平均Ki-67表達為21.37±20.43(表達中位數15，四分位區間IQR: 6～30)既往對Ki-67表達高低分組標準并不統一，本研究分別以10和25為界對Ki-67表達進行分組：Ki-67 ≤ 10vsKi-67 > 10；Ki-67<25vsKi-67 ≥ 25。如表2所示，相較于女性(18.84±18.17)、非吸煙患者(19.62±19.02)，男性(26.51±23.61)、吸煙患者(29.89±24.60)Ki-67表達增高(P<0.001)。隨著腫瘤大小增加，Ki-67表達逐漸升高(P<0.001)。并且，淋巴結轉移樣本中Ki-67表達高于未發生淋巴結轉移患者(42.14±22.35vs18.73±18.59,P<0.001)。

2.3 EGFR基因突變與臨床病理特征的相關性673例肺腺癌組織中，共有462例(68.65%)檢測出EGFR突變。其中，外顯子21突變234例(50.65%)，外顯子19突變181例(39.18%)。如表3所示，相較于男性(突變率55.86%)、吸煙患者(突變率46.09%)，EGFR突變在女性(突變率74.94%)、非吸煙肺腺癌患者(突變率73.30%)中更常見 (P<0.001)。EGFR突變與腫瘤大小、淋巴結轉移負相關(P<0.05)。在發生淋巴結轉移的樣本中EGFR突變率為56.58%，低于淋巴結陰性患者中的70.18%(P=0.023)。

2.4 Ki-67表達與EGFR基因突變的相關性如表2及表4所示，EGFR突變患者Ki-67表達低于EGFR野生型患者(18.82±17.75vs26.97±24.45,P<0.001)。Ki-67表達≥25的樣本，EGFR突變率為57.0% (122/214)，低于Ki-67<25樣本的74.1%(340/459)。同樣，EGFR突變患者Ki-67表達>10的占比為50.9%，低于EGFR野生型患者(57.9%,P<0.001，表4)。發生19號外顯子突變的樣本(21.40±20.69)，其Ki-67表達略高于攜帶21號(17.31±15.42)或者其他外顯子突變(16.37±15.34)的樣本(P=0.041)。斯皮爾曼等級相關檢驗顯示，Ki-67表達與EGFR基因突變存在較弱的負相關關聯(rho=-0.129,P<0.001)。

2.5 Ki-67表達與EGFR突變在肺腺癌患者預后中的意義673例患者中，共有623例術后時間超過1年。中位隨訪時間為29.1月。隨訪期間，有15例患者死亡，43例發生腫瘤復發或轉移。考慮到死亡病例有限，本實驗采用無病生存期DFS(Disease-Free Survival)作為主要結局指標。如圖1a所示，Ki-67>10的樣本，其預后差于Ki-67≤10的樣本；并且，隨著Ki-67表達增高，效應值呈增大趨勢。發生EGFR基因突變的樣本，其預后較EGFR野生型患者更好(圖1b)。聯合Ki-67表達與EGFR基因突變可見：與Ki-67表達≤10并且攜帶EGFR突變的患者相比，Ki-67 > 10并且EGFR野生型的患者預后更差，且HR值達4.46(圖1c)

表2 Ki-67表達與肺腺癌患者臨床病理特征的相關性

表3 EGFR基因突變與臨床病理特征的相關性[n(%)]

3 討論

Ki-67表達及EGFR基因突變在肺腺癌進展及預后中發揮重要作用。然而，是否Ki-67表達與EGFR基因突變存在相關性，既往研究結論并不統一。通過回顧性分析673例肺腺癌患者臨床病理資料，發現Ki-67表達與EGFR基因突變呈負相關，二者在肺腺癌預后中可能發揮聯合作用。

此前研究表明,肺癌預后蛋白標志物與EGFR突變相關[6-7]。徐佳佳 等[8]在120例肺腺癌組織中檢測Ki-67蛋白表達與EGFR突變情況，發現EGFR基因突變與Ki-67蛋白表達正相關；這一結果與孫宇 等[9]、張煜坤 等[10]發現一致。然而，韓義明 等[11]在291例NSCLC樣本中發現Ki-67蛋白表達與EGFR突變無關，這一結果與金澄宇 等[12]、何鋒 等[13]報道一致。值得注意的是，韓義明 等[11]發現EGFR基因突變率在Ki-67陰性組為59.0%，在Ki-67 陽性組為46.5%，P值為0.083，邊緣陽性；類似地，金澄宇 等[12]在172例肺腺癌樣本中發現EGFR在Ki-67陽性組突變率為36.8%，低于Ki-67陰性組的43.6%；而何峰 等[13]在140例肺腺癌中發現Ki-67表達與EGFR基因突變相關系數為-0.102，但P值大于0.05。由此可見，既往研究已經提示Ki-67表達可能與EGFR基因突變存在負相關關聯，但由于樣本量限制，差異未達統計學標準。此外，分析方法不同、Ki-67高低表達(陽性/陰性)劃分標準不一等皆可能對研究結果產生影響。

表4 Ki-67表達與EGFR基因突變的相關性[n(%)]

圖1 Ki-67表達與EGFR基因突變在肺腺癌患者預后中的價值

既往研究[4]表明，相較于鱗狀細胞癌、大細胞癌等其他NSCLC病理亞型，肺腺癌中Ki-67表達更低。并且，浸潤性肺腺癌Ki-67表達較微浸潤腺癌、原位腺癌更高[14]。為了排除病理亞型及浸潤深度對Ki-67表達的影響，本研究針對浸潤性肺腺癌樣本進行分析，顯示Ki-67表達與EGFR基因突變負相關，在男性、吸煙患者中更高，與腫瘤大小、淋巴結轉移正相關，這一結果與既往多項研究結果一致[4]。與Ki-67特征相反的是，EGFR突變率在女性、非吸煙肺腺癌患者中更高；且與腫瘤大小、淋巴結轉移負相關。上述結果也從側面提示：肺腺癌中，Ki-67表達與EGFR基因突變可能負相關。

生存分析結果表明，與Ki-67低表達肺腺癌患者相比，Ki-67高表達患者預后更差。而相較于EGFR野生型患者，發生EGFR突變的患者預后更好。分析Ki-67表達與EGFR基因突變顯示：與Ki-67表達≤10并且攜帶EGFR突變的患者相比，Ki-67 > 10并且EGFR野生型的患者預后更差，HR值達4.46，提示臨床應該重視這部分患者的預后。然而，肺腺癌中Ki-67表達與EGFR基因突變相關的潛在生物學機制尚有待闡明。

肺腺癌中，Ki-67表達與EGFR基因突變存在負相關關聯。與Ki-67低表達并且發生EGFR突變的肺腺癌患者相比，Ki-67高表達并且EGFR野生型患者預后較差。Ki-67表達與EGFR基因突變在肺腺癌預后中可能發揮聯合作用。