基于生物信息學(xué)篩選乙型肝炎差異表達(dá)基因及其在預(yù)測肝癌預(yù)后中的作用〔1〕

羅立才

(高州市人民醫(yī)院，廣東 高州 525200)

近年來乙型肝炎病毒(HBV)感染在發(fā)展中國家逐年激增，已受到各國政府重視。隨著近年來積極推廣擴(kuò)大乙型肝炎(以下簡稱乙肝)疫苗接種計(jì)劃的實(shí)施，乙肝發(fā)病率已有所下降。但據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國仍有約1億人受到肝病影響，主要是HBV[1]。調(diào)查顯示[2]，慢性HBV感染占病毒相關(guān)肝癌(HCC)病例的80%，與未感染人群相比，HBV感染者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高15～20 倍。在基因?qū)用妫芯縃BV相關(guān)HCC發(fā)生的關(guān)鍵途徑并尋找能夠防治HCC的潛在靶標(biāo)迫在眉睫。近年來基因芯片技術(shù)在生命科學(xué)中日益受到重視，研究成果亦層出不窮。基因芯片數(shù)據(jù)庫的頻繁更新為我們研究HBV在個(gè)體基因表達(dá)差異提供強(qiáng)大的研究基礎(chǔ)。本研究主要通過基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(GEO)獲取基因芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用多種生物數(shù)據(jù)庫篩選HBV感染肝細(xì)胞的差異表達(dá)基因，分析這些基因在預(yù)測肝癌預(yù)后中的作用，為臨床醫(yī)師評估HCC患者預(yù)后提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究分析的乙型病毒性肝炎相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)芯片從美國國立生物技術(shù)信息中心GEO數(shù)據(jù)庫中下載，編號GSE118295。實(shí)驗(yàn)平臺為GPL570，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，該數(shù)據(jù)包含6 例樣本，其中HBV感染陰性原代肝細(xì)胞3 例，HBV感染陽性原代肝細(xì)胞3 例。

1.2 方法

1.2.1 評估基因芯片質(zhì)量

登錄GEO數(shù)據(jù)庫，下載編號GSE118295基因數(shù)據(jù)。本研究利用Rx64 3.6.1軟件對芯片質(zhì)量進(jìn)行繪圖分析。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件并調(diào)用RMA法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算基因表達(dá)量；確定數(shù)據(jù)的Gene symbol，對數(shù)據(jù)信息用K最近鄰(KNN)分類算法填充缺失值；啟動(dòng)R軟件調(diào)用R語言LIMMA包對數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分析，通過Bayes檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法得到差異基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：LogFC(fold change)>1，adj.P.Val<0.05。差異基因數(shù)據(jù)用R軟件繪圖進(jìn)行展示。

1.2.3 差異基因的生物學(xué)分析

運(yùn)用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)(DAVID)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，導(dǎo)入差異基因后選擇功能注釋、細(xì)胞組分、分子功能、生物途徑、KEGG通路進(jìn)行分析。

1.2.4 差異基因編碼蛋白的相互作用分析

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI network)主要應(yīng)用于研究疾病分子的相互作用機(jī)制。目前字符串(STRING)數(shù)據(jù)庫是世界上最大的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，常用作研究蛋白互作關(guān)系。本次研究通過STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/cgi/input.pl)分析、預(yù)測蛋白互作關(guān)系，篩選條件為minimum required interaction score>0.9，Cytoscape篩選PPI網(wǎng)絡(luò)排前10名的核心差異表達(dá)基因。

1.2.5 驗(yàn)證差異基因及生存分析

登錄基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)庫-GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，http：//gepia.cancer-pku.cn/)，鍵入篩選出10 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，驗(yàn)證其在人體的正常組織及肝癌組織的差異表達(dá)，最后進(jìn)行生存分析，篩選可預(yù)測HCC預(yù)后的靶標(biāo)基因。

2 結(jié) 果

2.1 基因芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量評價(jià)

控制基因芯片的質(zhì)量有利于保存數(shù)據(jù)的真實(shí)性和完整性，對后續(xù)分析非常重要。本研究芯片質(zhì)量控制由R軟件實(shí)施，主要通過繪制相對標(biāo)準(zhǔn)差圖(NUSE)、RNA降解圖判定。結(jié)果顯示芯片質(zhì)量可靠，數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差接近，NUSE值在1附近(見圖1)。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中如發(fā)生RNA降解，則定量結(jié)果不可控，數(shù)據(jù)誤差較大。本次研究繪制的RNA降解圖(RNA degradation plot)顯示RNA未見明顯降解(見圖2)。

圖1 相對標(biāo)準(zhǔn)差圖(NUSE)

圖2 RNA降解圖

2.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析

經(jīng)R軟件處理原始數(shù)據(jù)，對比正常肝細(xì)胞組及感染HBV肝細(xì)胞組。本次研究得到1 041 個(gè)差異基因，其中表達(dá)上調(diào)323 個(gè)，表達(dá)下調(diào)718 個(gè)，對差異基因進(jìn)行聚類分析(見圖3，圖4)。

圖3 差異表達(dá)基因熱圖

adj.P.Val為校正后P值，LogFC為兩組間表達(dá)量的比值，對其取以2為底的對數(shù)值。根據(jù)LogFC(fold change)>1，adj.P.Val<0.05對差異表達(dá)基因進(jìn)行分類

2.3 差異基因的基因本體富集分析及京都基因和基因組百科全書通路分析

經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫行基因本體(GO)富集分析顯示差異基因主要分布。第一，細(xì)胞組分：細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、胞外外泌體；第二，生物途徑：環(huán)氧化酶P450通路；第三，分子功能：受體結(jié)合(見圖5)。京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析顯示，差異基因主要參與補(bǔ)體及凝血級聯(lián)反應(yīng)、糖酵解/糖異生、視黃醇代謝、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、碳代謝、代謝途徑、初級膽汁酸生物合成、癌癥中的蛋白聚糖、膽汁分泌等信號通路(見圖6)。

extracellular space為細(xì)胞外間隙，extracellular region為胞外區(qū)，extracellular exosome為胞外外泌體，epoxygenase P450 pathway為P450通路，receptor binding為受體結(jié)合

圖6 KEGG通路分析

2.4 差異基因編碼蛋白的相互作用分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫對1 041 個(gè)差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(見圖7)。Cytoscape軟complement and cogulation cascades為補(bǔ)體和凝血級聯(lián)，Glycolysis/Gluconeogenesis為糖酵解/糖異生，Retinol metabolism為視黃醇代謝，PPAR signaling pathway為PPAR信號通路，Carbon metabolism為碳代謝，Biosynthesis of antibiotics為生物合成的抗生素，Metabolic pathways為代謝途徑，Primary bile acid biosynthesis為初級膽汁酸生物合成，Proteoglycans in cancer為癌癥中的蛋白聚糖，Bile secretion為膽汁分泌件篩選蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果中排前10名的核心基因見圖8，分別為激肽原1(KNG1)、α-2-HS-糖蛋白(AHSG)、凝血因子ⅴ(F5)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、趨化因子C-X-C基序配體1(CXCL1)、載脂蛋白A2(APOA2)、表皮生長因子(EGF)、載脂蛋白E(APOE)、肌糖蛋白C(TNC)、多功能蛋白聚糖(VCAN)。

圖7 STRING數(shù)據(jù)庫對1 041 個(gè)差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖

圖8 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果中篩選排前10 名的核心基因

2.5 差異基因篩選后驗(yàn)證及生存分析

登錄GEPIA數(shù)據(jù)庫鍵入10 個(gè)核心差異基因，分析結(jié)果顯示該10個(gè)核心基因在消化道腫瘤中表達(dá)量存在差異(見圖9)，其中APOA2在肝癌表達(dá)最高。通過快速單基因搜索，結(jié)果顯示APOA2，APOE，KNG1，AHSG，F(xiàn)5和TF在肝臟腫瘤中高表達(dá)，CXCL1在食道、結(jié)腸腫瘤中高表達(dá)，EGF在腎臟腫瘤中高表達(dá)，TNC在腦腫瘤中高表達(dá)，VCAN在腦、胰腺腫瘤中高表達(dá)。選取在肝臟腫瘤中高表達(dá)的6 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)量分析(見圖10)。生存分析結(jié)果顯示：KNG1高表達(dá)與肝癌預(yù)后密切相關(guān)，表現(xiàn)為高表達(dá)組5 年生存率更優(yōu)(見圖11)。

LIHC為肝細(xì)胞肝癌，CHOL為膽管癌，COAD為結(jié)腸癌，EACA為食管癌，PAAD為胰腺癌，READ為直腸癌，STAD為胃癌

X軸：T-腫瘤，N-正常組織；Y軸：基因表達(dá)量，參數(shù)：[log2(TPM+1)]

藍(lán)實(shí)線：低表達(dá)KNG1組；藍(lán)虛線：低表達(dá)組95%置信區(qū)間；紅實(shí)線：高表達(dá)KNG1組；紅虛線：高表達(dá)組95%置信區(qū)間。TPM：每百萬條reads的轉(zhuǎn)錄本；Logrank p： logrank檢驗(yàn)；HR：風(fēng)險(xiǎn)比；P(HR)：HR的檢驗(yàn)P值

3 討 論

患者感染HBV后主要風(fēng)險(xiǎn)為肝纖維化、肝硬化，隨著疾病進(jìn)展，肝代償功能失調(diào)，最終引發(fā)HCC。目前臨床已對HCC的致病機(jī)制取得了一定共識，認(rèn)為病毒復(fù)制本身并不直接產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而宿主免疫系統(tǒng)對感染肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)是最終導(dǎo)致免疫介導(dǎo)肝臟損害的關(guān)鍵。亞太地區(qū)經(jīng)擴(kuò)大HBV疫苗接種措施，已有效降低了肝癌發(fā)病率，但仍約有1 億人受到肝病影響。HBV感染仍是導(dǎo)致亞太地區(qū)慢性肝損傷和HCC的主要因素[3]。面對極為龐大的患病基數(shù)，我國每年乙肝病毒相關(guān)肝癌患者死亡案例仍居高不下，給患病家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)、心理負(fù)擔(dān)，因此從基因?qū)用鎸ふ野袠?biāo)對于防治HCC顯得尤為重要。

基因芯片于20世紀(jì)80年代中期上市，其測序原理是通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定以獲得一組完全互補(bǔ)的探針序列，據(jù)此可重組出靶核酸序列，目前在生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。生物信息學(xué)則從核酸和蛋白質(zhì)序列出發(fā)，分析序列中表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能的生物信息。近年來不斷有科研人員利用基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(GEO)、生物信息數(shù)據(jù)庫(DAVID)、基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(GEPIA)、蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(STRING)等生命科學(xué)的頂尖數(shù)據(jù)庫發(fā)表了一些高質(zhì)量的研究成果[4-7]。

本次研究共得到1 041 個(gè)差異基因，其中表達(dá)上調(diào)323個(gè)，表達(dá)下調(diào)718個(gè)，GO富集分析顯示差異基因主要分布于細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、胞外外泌體等細(xì)胞組分，而生物途徑則與環(huán)氧化酶P450通路相關(guān)，在分子功能上影響受體結(jié)合。環(huán)氧化酶P450通路在肝癌中出現(xiàn)基因富集現(xiàn)象，這與Ding等[8]研究的在肝癌患者中環(huán)氧化酶P450顯著下調(diào)結(jié)果一致。在外泌體領(lǐng)域，有研究人員報(bào)道[9]腫瘤細(xì)胞可分泌外泌體與鄰近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞產(chǎn)生通訊，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。KEGG通路分析顯示本次研究的差異基因涉及多種信號通路，其中初級膽汁酸生物合成在肝癌中的作用已在腸道菌群介導(dǎo)的膽汁酸代謝通過NKT細(xì)胞調(diào)控肝癌的研究中得到證實(shí)[10]。PPARγ信號通路在肝臟疾病中的作用則研究得較為深入，研究顯示上調(diào)PPARγ通路可防治肝纖維化[11]。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示KNG1和APOA2等在肝癌高表達(dá)。有學(xué)者[12-13]通過蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組織化學(xué)將KNG1鑒定為大腸癌早期階段的潛在標(biāo)志物。目前KNG1的研究主要集中于結(jié)直腸癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤[14]、慢性阻塞性肺疾病[15]、靜脈血栓形成[16]、血管性水腫[17]、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變[18]等疾病，也有報(bào)道在慢性丙型肝炎病毒伴發(fā)肝癌患者中KNG1升高[19-20]，但目前KNG1是否能作為一個(gè)預(yù)測肝癌預(yù)后的基因靶標(biāo)鮮有報(bào)道。因此我們決定利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對此進(jìn)行探索，設(shè)定LogrankP<0.05為排除抽樣誤差的標(biāo)準(zhǔn)，分析結(jié)果顯示HCC患者KNG1高表達(dá)組在5 年生存率對比中更占優(yōu)勢，提示KNG1具有預(yù)測HCC預(yù)后的潛力。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)探索感染乙肝病毒肝細(xì)胞差異表達(dá)基因在預(yù)測肝癌預(yù)后中的作用，結(jié)果顯示KNG1有望成為指導(dǎo)預(yù)測HCC患者預(yù)后的基因靶標(biāo)，但由于GEPIA數(shù)據(jù)庫中沒有對HCC進(jìn)行細(xì)分，因此無法直接分析KNG1在乙肝相關(guān)肝癌這一特定病種中的作用，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)技術(shù)在不同病因HCC中的作用機(jī)制將會(huì)為臨床提供更準(zhǔn)確的早期診治及預(yù)后分析依據(jù)。