推拿退熱六法對大腸桿菌內毒素致熱幼兔外周環氧合酶2、前列腺素E2表達的影響

張英琦 劉志鳳 于天源 焦誼 王厚融 徐亞靜 官乾 劉迪

發熱是兒童疾病最常見的癥狀之一，也是兒童入院的第二大常見原因[1]。小兒推拿治療發熱歷史悠久，可追溯至隋唐時期，如《厘正按摩要術》：“小兒發熱，有表里虛實之異……分陰陽，二百遍。推三關，一百遍……”，相關推拿手法一直沿用至今。小兒推拿通過體表干預激發體內的調節系統，患兒多不抗拒，舒適度高，臨床效果良好。本課題組綜合分析明清至現代小兒推拿專著及臨床資料，最終選用穴位清晰、作用明確、應用廣泛、便于操作的退熱六法(開天門、推坎宮、揉太陽、揉耳后高骨、清天河水、推脊)作為干預方法進行研究。本研究采用大腸桿菌內毒素(lipopolysaccharides，LPS)注射方法制備幼兔細菌發熱模型，旨在觀察推拿退熱六法對內毒素誘導發熱幼兔的退熱作用，探討其作用機制，為進一步揭示臨床小兒推拿退熱的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡清潔級新西蘭雄性幼兔，體質量(2±0.5) kg，體溫(39±0.5)℃，購于北京隆安實驗動物養殖中心，動物生產許可證編號：SCXK(京)2019-0006。單籠飼養，飼料由北京中醫藥大學實驗動物中心提供。購入后置于室溫20～25℃、相對濕度為40%～60%的飼育室內，適應性飼養3日后，篩選基礎體溫均一的幼兔共24 只。本實驗所有操作經過北京中醫藥大學IACUC的批準(BUCM-4-2020083102-3013)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 藥品及試劑

脂多糖(美國Sigma公司，生產批號：0000081276)、生理鹽水(石家莊四藥有限公司，生產批號：2012141904)、BSA標準品(北京索萊寶科技有限公司，生產批號：20200817)、彩虹 245 廣譜蛋白Marker(北京索萊寶科技有限公司，生產批號：1223C021)、三氯乙醛(上海麥克林生化科技有限公司，生產批號：C10323759)、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，生產批號：20200903)、10×TBST (北京索萊寶科技有限公司，生產批號：20210311)、兔源COX-2抗體(北京博奧森生物技術有限公司，生產批號：AI06116399)、PGE2 ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，生產批號：20210101-72205A)。

1.3 主要實驗儀器

信息化生物信號采集與處理系統(成都泰盟科技有限公司)、溫度探頭(成都泰盟科技有限公司)、電子天平[美國雙杰兄弟(集團)有限公司]、電泳儀(美國 BIO-RAD 公司)、Mini-P-2 電泳槽( 美國BIO-RAD公司)、 MultiSkan3酶標儀(美國 Thermo公司)、水平脫色搖床(北京六一公司)、Fresco 低溫冷凍離心機(美國Thermo公司)。

1.4 動物分組與造模

采用隨機數字表法將24只幼兔隨機分為3 組，即鹽水對照組、模型組和退熱六法組，每組8只。鹽水對照組經耳緣靜脈予以1 mL/kg無熱源生理鹽水注射。模型組、退熱六法組均采用LPS注射方法制備發熱幼兔模型，藥物用量、給藥方式參考文獻[2]及課題前期研究[3]制定：用生理鹽水將LPS稀釋至0.5 μg/mL，并按1 mL/kg劑量經幼兔耳緣靜脈注射給藥。以注射造模后1小時內開始發熱，肛溫升高0.6℃以上為造模成功。

1.5 干預方法

鹽水對照組、模型組、退熱六法組所有動物推拿手法操作部位于實驗前一天剃毛。造模成功后，退熱六法組以室溫清水為介質，按照如下步驟進行手法操作：①退熱六法第一法：開天門(兔兩眉骨內側中點至神庭穴[4])直推200次，操作2分鐘[5]；②退熱六法第二法：推坎宮(兔內眼角，上下眼瞼交界處直上至眶上突外端[2])直推200次，操作2分鐘[4]；③退熱六法第三法：揉太陽(兔外眼角后上方顳窩中[2])揉200次，操作2分鐘[4]；④退熱六法第四法：揉耳后高骨(兔寰椎翼前緣直上方凹陷處[2])揉24次掐3下，操作2分鐘[4]；⑤退熱六法第五法：清天河水(兔腕橫紋至肘橫紋[2])500次，操作5分鐘[6]；⑥退熱六法第六法：推脊(兔背中線上，第7頸椎與第1胸椎棘突間至尾根[2])300次，操作5分鐘[4]。在相同時段內模型組、鹽水對照組幼兔在已剃毛部位涂抹與退熱六法組等量的室溫清水，并抓握，但不進行推拿手法干預。

操作者均取得執業醫師資格證并接受統一培訓，以保證操作手法、刺激量等相同。直推時，操作者食、中二指并攏，余三指握拳，用力要均勻、持久、輕柔，在表皮操作，不能帶動皮下組織，以皮膚不發紅為度。操作者肩、肘、腕關節放松，靠肘關節的屈伸活動來實現。揉法操作時操作者手指不可離開皮膚表面，以前臂帶動手腕做環形而有節律的運動。操作時，操作者手指蘸水要干濕得易，不可過干或過濕。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 體溫變化值 使用BL-420N生物信號采集系統于造模后每20分鐘連續監測肛溫至造模后180分鐘，即干預后120分鐘。

1.6.2 血常規檢測 分別于干預前、干預后120分鐘于兔耳緣靜脈采血0.5 mL，置于含 EDTA抗凝管中，以五分類血液分析儀檢測白細胞、中性粒細胞百分比。

1.6.3 血、肝、肺組織取材 干預后120分鐘，幼兔腹腔注射水合氯醛后處死。開腹，下腔靜脈取血5 mL，使用低溫離心機4℃，3 000 r/min離心15分鐘，取上清液。取肝、肺組織置于液氮罐中冷凍，后轉移至-80℃冰箱中保存備用。

1.6.4 血、肝、肺組織前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)表達 使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)對外周血、肝、肺PGE2濃度進行檢測，具體過程如下：標準品孔加不同濃度標準品50 μL；樣本孔加樣本稀釋液40 μL，待測樣品10 μL，后每孔加入酶標試劑100 μL，37℃孵育60分鐘，再用洗滌液洗滌5次，拍干。隨后在各反應孔中加入顯色劑A50 μL，顯色劑B50 μL，振蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘，最后加入終止液50 μL終止反應。隨后將反應孔板置于酶標儀中讀取數據，波長設置450 nm。檢測操作過程全部按照試劑盒說明書進行。

1.6.5 肝、肺組織環氧合酶2(cyclooxygenase，COX-2)表達 每份樣本組織加入預冷的RIPA裂解液1 mL充分研磨，12 000 r/min 低溫離心15分鐘后取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣本蛋白濃度后，確定蛋白上樣量，加入5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。目標蛋白上樣后電泳，先恒定電壓60 V電泳20分鐘，后恒定電壓80 V電泳90分鐘。轉膜時操作條件為恒定電壓100 V轉移70分鐘。加入10%脫脂牛奶封閉2小時后，將PVDF膜按蛋白分子量剪開。1×TBST每10分鐘洗1次，共洗3次。分別加入一抗COX-2抗體(1∶1 000)及一抗GADPH 抗體(1∶1 000)，搖床上室溫孵育1小時后4℃冰箱過夜。洗膜：1×TBST每10分鐘洗1次，共洗3次。經二抗HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠IgG(1∶10 000)室溫搖床孵育1小時。1×TBST每10分鐘洗1次，共洗5次。然后使用ECL試劑盒曝光顯影，條帶曝光完畢后，PVDF膜自然晾干后封存。應用Image J分析軟件計算目標條帶積分光密度值。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 各組幼兔各時段體溫的變化值

造模后幼兔體溫明顯升高，與鹽水對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。研究過程中大部分動物出現明顯的精神萎靡，頭面、耳廓明顯發燙，甚至出現粗大喘息、腹瀉等癥狀，提示造模成功。模型組與退熱六法組在干預前體溫差異無統計學意義(P>0.05)。鹽水對照組體溫無明顯波動，模型組體溫維持較高水平。推拿退熱六法干預可降低幼兔的體溫。與模型組比較，在退熱六法干預后各監測時間點，體溫增長幅度均低于模型組，在干預后20分鐘、80分鐘、100分鐘、120分鐘差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 各組幼兔白細胞、中性粒細胞變化

干預前，即造模后60分鐘，模型組、退熱六法組白細胞計數、中細粒細胞百分比顯著低于鹽水對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示細菌感染模型造模成功。模型組與退熱六法組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明兩組在干預前無差別，具有可比性。干預后120分鐘，模型組、退熱六法組白細胞仍顯著低于鹽水對照組(P<0.05)，模型組與退熱六法組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組、退熱六法組中性粒細胞百分比與鹽水對照組差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組相比，退熱六法組中性粒細胞明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組幼兔干預前、干預后120分鐘白細胞、中性粒細胞計數變化

2.3 各組幼兔血、肝、肺組織PGE2表達量比較

干預后120分鐘，與鹽水對照組相比，模型組血、肝、肺組織PGE2表達量顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。退熱六法組血PGE2較鹽水對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，肝、肺組織PGE2較鹽水對照組差異顯著(P<0.05)。退熱六法組較模型組，血、肝、肺組織PGE2表達量均降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組幼兔血、肝、肺PGE2表達量比較

2.4 各組幼兔肝、肺組織中COX-2蛋白表達水平比較

模型建立后，模型組幼兔肝、肺組織COX-2蛋白表達增加，與鹽水對照組相比具有統計學差異(P<0.05)。推拿干預后120分鐘，與模型組比較，退熱六法組肝、肺組織COX-2表達水平顯著下降(P<0.05)。見表4、圖1、圖2。

表1 各組幼兔干預前、干預后120分鐘各時間點體溫變化值

表4 各組幼兔肝、肺COX-2表達量比較

注：Y 鹽水對照組；M 模型組；T 退熱六法組。

注：Y 鹽水對照組；M 模型組；T 退熱六法組。

3 討論

發熱由外源性致熱原進入機體刺激單核細胞、巨噬細胞等產生內生致熱原，繼而作用于體溫調節中樞影響體溫調定點所致。神經細胞進一步引發交感神經系統興奮，促進機體局部或者全身的發熱反應[7]。

本課題組通過對古今文獻進行研究，總結出“退熱六法”(開天門、推坎宮、揉太陽、揉耳后高骨、清天河水、推脊)作為實驗干預手段[8]。這些穴位位置明確，療效顯著，刺激量相對固定。其中頭面部四大手法(開天門、推坎宮、揉太陽、揉耳后高骨)是具有代表性的退熱手法。孫重三先生的《兒科推拿療法簡編》將頭面部四大手法列為所有手法之首，用于治療感冒、頭痛、急慢驚風等兒科常見病。“天河水”是小兒推拿特定穴之一，清天河水，性微涼，清熱而不傷陰，虛熱、實熱皆可用，是使用頻率最高的退熱手法[9]。督脈為陽脈之海，脊柱穴位于督脈之上，推脊能夠調節陽氣，瀉一身之火。在小兒退熱手法基礎上加上推脊能更有效地控制小兒發熱，并且操作方便，簡便易行[10]。

血常規中的白細胞和中細粒細胞值是判斷血液細菌感染的主要指標[11]。劉曉紅等[12]通過實驗發現，兔在感染發熱期會出現精神怠倦、顫抖、身體蜷縮、白細胞數降低，之后隨著體溫的升高進入高峰期，白細胞數漸漸上升，中性粒細胞數增多。本實驗觀察到模型組、退熱六法組耳緣靜脈注射LPS后血白細胞、中性粒細胞顯著降低。退熱六法組在干預后，中性粒細胞受到明顯下調，提示退熱六法的解熱作用與調節外周中性粒細胞有關。白細胞計數與文獻有差異，可能與檢測的時間點有關，仍需進一步研究。

前列腺素(prostaglandin，PG)是體溫調節的重要介質，在體溫調節研究中占有重要地位[13]。PGE2是內源性熱原介導的外周免疫反應與中樞神經系統體溫調節之間的連接紐帶，是多種致熱原誘導體溫升高的中樞共同通路。環氧合酶(cyclooxygenase，COX)是合成前列腺素的關鍵限速酶[14]，COX-2在整個炎癥的發生、消退修復過程中可見大量持續的表達[15]，選擇性阻斷COX-2可完全消除發熱反應[16]。Kupffer細胞是機體內最大的巨噬細胞群，在發熱的啟動過程和終止過程中起到重要的作用。肝巨噬細胞也被認為是外周致熱原性細胞因子的主要細胞來源[17]。在LPS誘導的發熱過程中，COX-2在肝和肺部的巨噬細胞中大量表達[18]。本實驗觀察到經LPS靜脈注射刺激，可明顯誘導幼兔血、肝、肺組織中PGE2含量增加，肝、肺組織COX-2表達水平的明顯增高。經退熱六法干預后，這些組織的PGE2、COX-2表達量均下降，提示退熱六法的解熱作用與降低外周PGE2的含量以及COX-2的表達有關。

本研究實驗結果顯示，推拿退熱六法能明顯抑制發熱幼兔的體溫上升，下調血中性粒細胞百分比，降低外周血、肝、肺PGE2水平，抑制肝、肺組織中COX-2的表達，其機制值得進一步深入研究，以闡明推拿手法治療小兒發熱的起效途徑，為研究推拿退熱機制提供科學依據，為臨床治療發熱類疾病提供參考。