碘乙酸鈉大鼠骨關節炎模型骨微結構研究

鮑哲明 單青 李晨 陳孟莉*

1.中國人民解放軍總醫院，北京 100089 2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第960醫院骨科，山東 濟南 250031

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種由年齡、創傷、炎癥等多種因素相互作用引起的關節軟骨退行性改變，軟骨損傷是OA的重要表現，OA的病理、生理改變不止是軟骨的損傷修復，同時也存在關節軟骨下骨的結構改變，在OA的形成和發展病理過程中相互促進、相互影響[1]。大量研究[2]證明軟骨下骨結構和生物力學改變與軟骨退變存在一定的相關性。

動物模型是研究骨關節炎病理機制和治療的常用方法之一，主要分為藥物誘導、關節制動、手術誘導和自發性OA、轉基因動物模型等[3]。碘乙酸鈉(monosodium Iodoacetate, MIA)作為一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶抑制劑，能夠抑制軟骨細胞代謝，引起軟骨細胞凋亡，導致軟骨細胞外基質降解。MIA誘導的大鼠OA模型會出現關節軟骨的破壞，軟骨下骨結構損傷、炎癥反應和關節疼痛等改變[4]。

本研究采用大鼠膝關節腔中注射MIA的方法建立大鼠OA模型，并通過Micro-CT以及組織切片等途徑來觀察關節軟骨及軟骨下骨微結構的改變，探討MIA造模后不同時段OA模型的病理改變以及OA不同階段軟骨下骨微結構的變化特點，進一步明確軟骨改變對軟骨下骨微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：選取SPF級8周齡雄性Wistar大鼠36只，體重為240～260 g，許可證號SCXK(京)2019-0010，飼養于中國人民解放軍總醫院醫學實驗動物中心。所有大鼠基礎飼料喂養，能夠自由活動、攝食和飲水。本研究經中國人民解放軍總醫院實驗動物倫理委員會批準，編號為SQ2020127。

1.1.2實驗試劑及器材：碘乙酸鈉(阿拉丁，中國)，4 %多聚甲醛溶液(Servicebio，中國)，10 % EDTA溶液(Servicebio，中國)，甲苯胺藍染液(Servicebio，中國)，番紅固綠染液(Servicebio，中國)；微量進樣器(50 μL，上海安亭，中國)，小動物Micro-CT(Quantum GX，PerkinElmer，美國)，光學顯微鏡(Eclipse E100，尼康，日本)，電子天平(XS105DU，Mettler Toledo，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理方法：將36只Wistar大鼠編號，使用隨機數字法分成3組，每組12只，分別為空白對照組(Sham組)、OA造模2周組(OA-2W組)、OA造模4周組(OA-4W組)。配置60 g/L 濃度MIA的0.9 %生理鹽水溶液。將大鼠腹腔注射45 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉進行麻醉。OA造模組采用微量進樣器抽取配好的碘乙酸鈉溶液50 μL，于右膝關節髕骨下中間偏外側關節間隙斜45 °穿刺后推入MIA溶液，同法Sham組右膝關節注射等量生理鹽水溶液。所有大鼠飼養在相同的鼠籠內并自由活動4周，Sham組和OA-4W組自飼養的第1周開始注射，造模4周；OA-2W組自飼養的第3周時注射，造模2周。

1.2.2標本取材處理：所有大鼠飼養4周后，采用過量麻醉后頸椎脫臼法處死。固定消毒后，縱行切開大鼠右膝關節皮膚、皮下組織，暴露膝關節腔。骨剪離斷右側包含脛骨上端約2 cm的膝關節骨頭，去除附著的軟組織、肌肉組織等，隨即放置于4 %多聚甲醛溶液固定48 h備用。

1.2.3Micro CT掃描與分析將取下固定的膝關節脛骨豎直平放入樣品槽內，使標本縱軸垂直于射線。掃描參數：電流114 mA，電壓70 kV，視野25 mm，體素尺寸50 μm，曝光時間14 min。將掃描結果導入Analyze 12.0軟件進行骨微結構的定量分析，選取脛骨平臺下50層厚度為感興趣區域(region of interest，ROI)，測量結果包括松質骨的骨礦物質密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁連接密度(connectivity density, Conn.D)，將掃描后的圖像導入Mimics Research 21.0進行三維圖像重建，獲得脛骨平臺圖像。

1.2.4組織學評價：將脛骨近端標本放入4 %多聚甲醛溶液中固定48 h后，放入10 % EDTA脫鈣液脫鈣約4周，梯度脫水，浸蠟包埋，所有樣本取冠狀位縱切，厚度4～5 μm。分別進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、甲苯胺藍染色、番紅固綠染色。通過顯微鏡觀察切片并拍照，OA組織學評價采用OOCHAS(osteoarthritis cartilage histopathology assessment system)評分方法[5]，由雙盲的獨立第三者計數評分，每個標本取三張連續切片觀察計分。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Micro-CT掃描圖像結果

三維重建圖像可見(圖1)，Sham組關節面光滑平整;OA-2W組關節面粗糙，可見局部軟骨缺損，部分區域有潰瘍形成，關節周緣少許骨贅形成;OA-4W組可見關節表面軟骨大量缺損，關節面極度粗糙，軟骨下骨質裸露，關節周緣大量骨贅形成。

冠狀剖面圖像可見(圖2)，Sham組軟骨下骨小梁結構均勻，排列整齊有序;OA-2W組骨小梁稀疏，出現鏤空現象，且骨小梁變薄，骨小梁連接減少，部分骨小梁結構排列紊亂;OA-4W組骨小梁稀疏程度更加嚴重，骨小梁間出現大量缺損，部分骨小梁連接中斷，網狀結構消失。

圖1 大鼠膝關節脛骨端Micro-CT三維重建圖像Fig.1 Micro-CT 3D reconstruction image of knee tibia in rats

圖2 大鼠膝關節脛骨端Micro-CT冠狀剖面圖像Fig.2 Micro-CT coronal section image of knee tibia in rats

2.2 軟骨下骨微結構參數

2.2.1骨密度與骨量：與Sham組相比，MIA造模后脛骨軟骨下出現了骨密度下降、骨量降低的情況，且隨著造模時間增加而逐漸加重。Sham組軟骨下松質骨BMD平均為(1 367.97±37.43)mg/cc，OA-2W組軟骨下松質骨BMD平均為(1 330.66±38.99)mg/cc(t=2.060，P=0.047 6)。而OA-4W組BMD下降至(1 285.5±47.08)mg/cc(t=5.143，P<0.000 1)。Sham組BV/TV平均為(38.22±3.284)%，OA-2W組相比下降至(30.72±5.122)%(t=4.563，P<0.000 1)，OA-4W組持續下降至(25.81±2.608)%(t=8.068，P<0.000 1)。見圖3。

2.2.2骨小梁結構：與Sham組相比，MIA造模后軟骨下骨小梁結構出現稀疏改變，骨小梁變薄，軟骨下骨質疏松進一步加重。Sham組Tb.Th平均為(0.191 2±0.029 3)mm，OA-2W組下降至(0.175 0±0.019 4)mm(t=1.074，P=0.291 8)，OA-4W組下降至(0.141 4±0.029 9)mm(t=4.595，P<0.000 1)。Sham組Tb.Sp平均為(0.428 8±0.071 0)mm，OA-2W組升高至(0.475 0±0.090 3)mm(t=1.249，P=0.222 0)，OA-4W組升高至(0.530 7±0.089 3)mm(t=2.945，P=0.006 4)。Sham組Conn.D平均為(57.94±8.050)mm-3，OA-2W組下降至(52.39±8.781)mm-3(t=1.727，P=0.096 0)，OA-4W組下降至(45.48±10.14)mm-3(t=3.368，P=0.002 4)，見圖3。

2.2.3組織切片染色及評分：通過顯微鏡下觀察HE染色切片、甲苯胺藍染色切片和番紅固綠染色切片可見(圖4)，Sham組關節表面平整，軟骨細胞排列整齊。細胞及軟骨基質染色正常，沒有減退現象；OA-2W組軟骨表面粗糙出現裂隙，軟骨表層變薄，軟骨細胞形態不規則，呈團簇樣聚集，軟骨表面纖維化，深層軟骨細胞出現肥大，空泡狀改變，表層軟骨失染，部分軟骨染色減退；OA造模4周后可見軟骨表面大面積潰瘍缺損，部分軟骨下骨質裸露，軟骨表面覆蓋大量的纖維素，軟骨細胞數量減少，細胞排列紊亂，局灶性細胞壞死，僅存少數淡染區域甚至全部失染。軟骨組織切片OOCHAS評分，Sham組平均為0(0,1)分，OA-2W組平均為12(9.75,15)分，較Sham組相比差異有統計學意義(P=0.004 7)，OA-4W組平均為24(20,24)分，較Sham組相比差異有統計學意義(P<0.000 1)。見圖5。

圖3 大鼠脛骨軟骨下骨微結構參數Fig.3 Subchondral bone microstructural parameters of knee tibial in rats注：OA-2W組、OA-4W組與空白組之間分別進行比較，nsP≥0.05，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。

圖4 大鼠膝關節脛骨軟骨面HE染色切片、甲苯胺藍染色切片和番紅固綠染色切片Fig.4 HE staining section, toluidine blue staining section and Safranin-Fast Green Staining section of knee tibial cartilage surface in rats注：SBP：軟骨下骨板；AC：關節軟骨；比例尺：100 μm。

圖5 大鼠膝關節脛骨軟骨組織OOCHAS評分Fig.5 OOCHAS score of knee tibial cartilage in rats注：OA-2W組、OA-4W組與空白組之間分別進行比較，**P<0.01，****P<0.000 1。

3 討論

骨關節炎動物模型是研究骨關節炎病理機制和治療方法的重要途徑。OA模型通常分為自發性模型和繼發性模型。繼發性模型主要包括侵入性模型和非侵入性模型，是目前最為常用的造模方式[6]。侵入性模型包括手術誘導和化學誘導兩種方式。手術誘導的優點是可重復性好，造模時間短，文獻報道[7]用于研究的時間長，材料方法獲取方便，對于技術要求低。缺點是與人類自然發生的退變性OA的變化特點相似性較差，存在感染的風險，由于造模速度快，對于慢性病理特點的研究效果較差；化學誘導方法無需手術，能夠減少潛在的感染風險，相對于手術造模侵入性更小。MIA作為一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶抑制劑，是目前最常用的化學造模方法。Morais等[8]在關節腔內注射MIA后發現，OA模型表現出軟骨細胞的變性和凋亡，能夠造成軟骨損傷，與人體骨關節炎癥狀十分相似。很多學者使用MIA造模后，對于造模時間與OA嚴重程度的關系，沒有一個準確的判斷，這就給使用動物模型研究疾病帶來了很大的不確定性和困難。既往學者報道[9-10]隨著注射MIA濃度劑量增加，OA的嚴重程度會逐漸加重，局部關節注射1.5～3 mg MIA造模1周后即可產生明顯的OA改變。本研究在使用3 mg MIA膝關節注射2周后發現，大鼠的膝關節軟骨表面出現了局部軟骨缺損，軟骨表面不規則，屬于OA疾病中期的病理表現。而在造模4周后可見關節表面軟骨大量缺損，軟骨下骨質裸露，關節周緣大量骨贅形成，屬于晚期的OA程度。

軟骨下骨對表面的關節軟骨起到重要的減震功能，可以通過重塑在關節活動期間不斷適應機械環境的變化，衰減約30 %的關節負荷[11]。既往研究[12]表明，OA發病過程中的各種原因可能會導致軟骨下骨吸收和骨重塑，進而引起關節軟骨應力改變導致退行性變加重。因此研究OA發生時軟骨下骨的骨微結構改變，有助于我們更好的了解骨關節炎疾病的病理進展特點。

許多研究[13]發現人體非膝骨性關節炎軟骨下骨密度與軟骨厚度間存在正相關性，即軟骨越薄，軟骨下骨密度越低。在手術誘導OA造模的研究中，有學者[14]發現早期關節軟骨下骨及骨小梁厚度降低，骨吸收增加導致骨密度下降，晚期雖然會有軟骨下骨骨形成增加，骨贅形成，但其下方的松質骨丟失嚴重，骨小梁進一步變薄[15]。Siebelt等[16]注射木瓜蛋白酶造模后也發現隨著時間推移，軟骨下骨板會變薄，出現孔隙率增高，骨小梁丟失，骨量降低等表現。本研究通過使用MIA對大鼠進行OA造模發現，隨著造模時間延長，OA程度逐漸加重，軟骨下骨會出現骨質疏松，骨密度下降，松質骨會呈現骨小梁變薄，骨分離度增加，骨小梁連接密度下降的情況，并且這種情況會隨著OA嚴重程度加重而逐漸加重。在造模4周后達到OA的晚期階段，并沒有出現很多文章中報道的OA軟骨下骨密度增高的情況[17]。

結合以往的動物實驗和人體的相關研究結果，筆者推測在OA早期，骨吸收活躍，新生骨組織礦化率低，會出現軟骨下骨密度降低，骨小梁變薄，造成骨小梁間隙增大，導致軟骨下骨板結構出現破壞。在人體的OA發展過程中，早期軟骨下骨小梁連接密度的下降會造成軟骨下骨在緩沖軟骨受到的應力方面能力下降。但隨著人體OA的進展，膝關節軟骨磨損加重，關節會逐漸通過代償出現關節畸形，促使軟骨下負重能力發生改變，為了提供更多的載荷以承載緩沖關節承受的沖擊，軟骨下骨發生代償性致密改變，造成了晚期部分區域骨密度增高的現象[18]。關節腔內注射MIA等藥物引起的軟骨損傷退變，由于造模時間短，病情進展快，不會出現人類自然病情發展過程中由于承受膝關節應力負荷而導致軟骨下骨代償性骨密度增加的情況。本研究對動物進行OA造模的時候，短期內就可以模擬OA從輕度到重度的病理改變過程，軟骨下骨呈現的骨密度下降、骨質疏松改變，可能是關節內炎性破壞本身造成的直接結果。

本研究采用的是藥物注射形成關節內炎性反應、破壞關節軟骨來模擬OA的形成，相比于手術造模等其他方法，可能和人體創傷形成的OA存在一定的區別。另外，在造模的過程中，由于空白組注射后干預4周，沒有設立同OA造模2周組對比的空白注射2周組，并且組之間可能存在個體及活動能力的差異，給實驗結果帶來偏倚。

通過對大鼠膝關節注射MIA進行OA造模，發現在MIA造模2周時達到OA中期階段，造模4周時為OA晚期階段，這為將來更好的應用動物OA模型形成了理論依據。同時通過對軟骨下骨的骨微結構分析發現，OA會造成軟骨下骨密度減低、骨小梁稀疏等骨質疏松表現，并且隨著OA病情進展，這種情況會逐漸加重。