培哚普利對糖皮質激素誘導的MSCs凋亡及成骨分化的影響

朱治同 李澤平 董立明

遵義醫科大學附屬醫院骨一科，貴州 遵義 563000

糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)是目前多種慢性疾病及自身免疫性疾病如類風濕關節炎、炎性腸病、慢阻肺等的首選藥，數據[1-2]顯示，全球約1%～2%患者長期接受GCs治療，大劑量或長期低劑量使用GCs易導致繼發性骨質疏松等嚴重副作用。雖然骨質疏松癥已得到臨床上的廣泛認知，但對其干預性治療措施仍需做深入研究。研究[3]表明，GCs促使成骨活動受抑制是導致骨質疏松的原因之一。培哚普利屬于血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)，可降低心臟負荷，延緩心血管重塑等，研究[4-5]證實，其可以增加骨量或骨密度，治療骨質疏松及降低骨折風險。正常生理狀態下，骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)可分化為成骨細胞，使得成骨與骨吸收代謝處于穩態[6]。但目前有關培哚普利治療骨質疏松癥的具體作用機制研究鮮有報道，因此本研究擬探討培哚普利對GCs誘導的MSCs凋亡及成骨分化的影響，并分析相關機制，以期為GCs誘導骨質疏松癥的預防及治療提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質干細胞株MSCs(貨號BNCC100385)購自北京北納創聯生物技術研究院；DMEM-F12培養基(貨號GNM-12500-S)、間充質干細胞-成骨誘導分化培養基(貨號7531)購自上海中喬新舟生物科技有限公司；3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑藍(MTT)(批號：1120-02-1)均購自美國sigma公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(貨號556547)均購自上海谷研實業有限公司；反轉錄試劑盒(RP1105-100 T)、AceQqPCR SYBR Green Mix(ALH185)、Trizol Reagent核酸分離試劑(YT526)購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteiny aspartate specific protease3，cleaved Caspase-3，貨號AF488))、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2，貨號BYFG-70R-36053)、兔抗人Bcl-2相關蛋白(Bcl-2-associated X Protein，Bax，貨號FNab00811)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP，貨號ab83259)、Ⅰ型膠原(type Ⅰcollagen，CollagenⅠ，貨號BYFG-70R-1081)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN，貨號BYFG-70R-9882)、Notch通路受體(Jagged 1，JAG1，貨號BM4565)、(Jagged 2，JAG2，貨號BM4565)、跨膜受體蛋白1(Notch1，貨號BM4565)、跨膜受體蛋白2(Notch2，貨號BYFG-70R-30786)、下游靶基因(hairy and enhancer of split1，Hes1，貨號BM4565)、HRP標記山羊抗兔二抗(貨號GB23303)抗體均購自東莞市潤博生物科技有限公司；CO2培養箱(型號NHD DYE1738)購自日本sanyo公司；Elx800酶標儀(型號HSG9832)購自美國Thermo公司；熒光定量PCR儀(型號C1000)購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養：復蘇MSCs細胞，培養于含10 %滅活FBS的DMEM-F12培養基中，于37 ℃、5 % CO2、95 % O2的培養箱中進行傳代培養，待對數生長期時用于后續實驗。

1.2.2細胞分組及處理：取1.2.1對數生長期的MSCs細胞重懸并接種于24孔板(2.5×105個/孔)。將細胞分為5組(均設6個復孔)：(1)空白對照組：只含MSCs細胞用無血清培養基處理48 h；(2)DEX組：加入含106mol/L DEX溶液[7]的無血清培養基處理48 h；(3)培哚普利低、中、高劑量組：加入含106mol/L DEX溶液的無血清培養基，分別與含0.01、0.1、1.0 μmol/L培哚普利[8]溶液共同孵育，繼續培養48 h后，進行后續實驗。

1.2.3MTT法檢測MSCs增殖能力：取1.2.2各組MSCs重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)，各孔加20 μL MTT(5 g/L)，繼續培養4 h；各孔加DMSO(150 μL)振蕩5 min，混勻。570 nm處測定各孔細胞光密度(optic density，OD)，每組設置6個復孔，取平均值。計算細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%。實驗重復3次。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率：取1.2.2各組MSCs重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)，每組設置6個復孔。用預冷的PBS緩沖液清洗細胞，離心棄上清后用0.2 mL PBS將細胞沉淀混勻，70 %的冷乙醇4 ℃固定24 h以上。離心棄上清，PBS清洗，加5 μL PI+5 μL AnnexinV‐FITC混勻，4 ℃避光染色30 min、稀釋，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.5成骨誘導分化：取1.2.2各組MSCs重懸并接種至24孔板(2.5×105個/孔)，每組設置6個復孔，培養細胞約80 %左右融合時更換成骨誘導培養液(含50 μmol/L左旋抗壞血酸+10 mmol/L β甘油磷酸鹽+DMEM-F12培養基)，15 d后進行茜素紅染色，顯微鏡下觀察成骨分化效果。

1.2.6實時熒光定量PCR法檢測凋亡、成骨分化及Notch通路相關基因水平：TRIzol法提取1.2.2各組培養48 h的MSCs總RNA并測定濃度。以RNA為模板、PrimeScript RT reagent試劑盒說明書為操作標準進行逆轉錄合成cDNA。體系20 μL：ULtraSYBR mixture(10 μL)、模板cDNA(2.0 μL)、上下游引物(各2.0 μL)、去離子純化水(4.0 μL)；條件(40個循環)：93 ℃ 30 s、93 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s。引物序列詳見表1，由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設計并合成。采用2-ΔΔCt方法計算各基因mRNA水平相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7蛋白免疫印跡法檢測凋亡、成骨分化相關蛋白及Notch通路蛋白表達情況：收集1.2.2各組MSCs，加入RIPA裂解液提取總蛋白并檢測濃度及純度，取20 μg蛋白上樣于12 % SDS-PAGE進行分離，將各蛋白轉至PVDF膜，放入脫脂奶粉(5 %)溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗凋亡相關蛋白(Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3)、成骨分化相關蛋白(ALP、CollagenⅠ、OPN)、Notch通路蛋白(JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1)，內參β-actin，稀釋比均為(1∶500)作為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗，加入HRP標記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，顯影、定影、成像，半定量分析各蛋白含量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 培哚普利對MSCs增殖的影響

與空白對照組[(12.33±1.85)%]比較，DEX組[(43.87±6.58)%]MSCs增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低[(35.37±5.31)%]、中[(25.62±3.85)%]、高[(17.96±2.69)%]劑量組MSCs增殖抑制率顯著降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。

2.2 培哚普利對MSCs凋亡的影響

與空白對照組[(15.27±2.33)%]比較，DEX組[(40.22±6.03)%]MSCs凋亡率顯著升高(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低[(33.40±5.01)%]、中[(25.05±3.75)%]、高[(19.12±2.87)%]劑量組MSCs凋亡率顯著均顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見圖1。

2.3 培哚普利對MSCs成骨分化的影響

茜素紅染色結果顯示，MSCs可誘導分化為成骨細胞，部分細胞呈聚集態生長，形成鈣結節。與空白對照組比較，DEX組深紅色鈣化結節顯著減少；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組深紅色鈣化結節顯著增多。詳見圖2。

2.4 培哚普利對MSCs成骨分化相關基因及其蛋白表達的影響

與空白對照組比較，DEX組MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白表達顯著升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見圖3、表2、表3。

圖1 培哚普利對MSCs凋亡的影響Fig.1 Effect of Perindopril on MSCs apoptosis

圖2 培哚普利對MSCs成骨分化的影響(比例尺：100 μm)Fig.2 Effects of Perindopril on osteogenic differentiation of MSCs (scale: 100 μm)

圖3 培哚普利對MSCs成骨分化相關蛋白表達的影響Fig.3 The effect of Perindopril on the expression of Osteogenic differentiation-related proteins in MSCs

2.5 培哚普利對MSCs凋亡相關基因及其蛋白表達的影響

與空白對照組比較，DEX組MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3 mRNA及其蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3 mRNA及其蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。詳見圖4及表4和表5。

表2 成骨分化相關基因表達情況比較

表3 成骨分化相關蛋白表達情況比較

圖4 培哚普利對MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3、Bax表達的影響Fig.4 Effect of Puli on expression of Bcl-2, cleaved-caspase-3 and Bax in MSCs cells

表4 培哚普利對MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3、Bax mRNA表達的影響

表5 培哚普利對MSCs Bcl-2、cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達的影響

2.6培哚普利對MSCs JAG1/Notch通路相關基因及其蛋白表達的影響

與空白對照組比較，DEX組MSCs JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1 mRNA及其蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1 mRNA及其蛋白表達顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見圖5、表6、表7。

圖5 培哚普利對MSCs JAG1/Notch通路相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of Puli on the expression of jag1notch pathway related proteins in MSCs

表6 培哚普利對MSCs JAG1/Notch通路相關基因表達的影響Table 6 Effects of Puli on the expression of JAG1/Notch related genes in

3 討論

正常狀態下，成骨與骨吸收處于動態平衡，當骨代謝失衡時則導致骨吸收大于骨形成，成骨受抑制[9]。MSCs是一種具有分化潛能的細胞，在不同誘導條件下能夠分化為成骨細胞、成軟骨細胞等，研究[10]表明，其分化為成骨細胞的能力減弱是骨質疏松的發病原因之一。因此通過促進MSCs向成骨細胞分化以防治骨質疏松癥仍是臨床研究者研究熱點之一。培哚普利是ACEI類抗高血壓藥物，研究[11]證實，其能夠預防骨質中骨鈣、骨磷及骨鎂等重要成分的丟失，預防骨質疏松癥。然而有關培哚普利預

表7 培哚普利對MSCs JAG1/Notch通路相關蛋白表達的影響Table 7 Effects of Perindopril on the expression of Jag1/notch pathway-related proteins in

防骨質疏松癥的相關機制尚未明確。研究[12]表明，GCs誘導產生的骨骼系統疾病是繼發性骨質疏松癥的原因之一，因此本研究探討了培哚普利對GCs類藥物DEX誘導的MSCs凋亡及成骨分化的影響，并分析相關機制。

DEX屬于GCs類，是臨床常用抗炎及免疫抑制類藥物，長期大量使用會引發多種代謝副作用如胰島素抵抗、肌肉萎縮等[13]。潘吉銘等[14]的研究顯示，DEX可抑制成骨細胞增殖，誘導細胞凋亡。Bcl-2、Bax是人體最主要細胞凋亡相關基因，分別發揮抑凋亡、促凋亡作用[15]。cleaved-caspase-3可將細胞阻滯在G2/M期，促進細胞凋亡[16]。本研究以106mol/L DEX為造膜劑建立細胞模型，顯示與空白對照組比較，DEX組MSCs增殖抑制率、凋亡率顯著升高。與既往研究結果一致，說明DEX可抑制MSCs增殖，誘導其凋亡。薛青等[17]的研究顯示，培哚普利可明顯上調絕經后骨質疏松伴高血壓患者的骨密度并下調硬骨蛋白，改善骨質疏松癥。薛青等[17]的另一項體外實驗研究顯示，培哚普利對體外培養的小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1增殖及分化具有促進作用。本研究結果顯示，與DEX組比較，培哚普利低、中、高劑量組MSCs增殖抑制率、凋亡率均顯著降低，呈劑量依賴性。說明培哚普利可能減弱DEX對MSCs增殖的抑制作用及對凋亡的促進作用。骨質疏松癥的發病原因之一是MSCs成骨分化能力減弱。ALP是衡量成骨細胞分化程度的重要指標，CollagenⅠ、OPN是成骨分化成熟過程的特異性標志物[18]。姜濤等[19]的研究顯示，牛膝甾酮能夠促進骨質疏松乳鼠成骨分化。本研究結果顯示，DEX環境下MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白表達均顯著降低，當加入不同劑量培哚普利藥物處理后，MSCs中ALP、CollagenⅠ、OPN mRNA及其蛋白蛋白表達均顯著升高，且呈劑量依賴性。說明培哚普利可能減弱GCs對MSCs成骨分化的抑制作用。

Notch信號通路包括Notch受體如Notch1/2及功能性Notch配體如JAG1/2，JAG1/2可識別Notch1/2并分別與二者結合，使得Notch1、Notch2經兩次酶切過程形成活性形式，轉移至胞核，調控下游靶基因Hes1、Hey1的轉錄及表達從而參與細胞一系列生物學過程[20]。研究[21]證實，Notch信號通路活化能夠促進成骨細胞分化。馬玉等[22]的研究顯示，與空白對照組比較，腫瘤壞死因子(TNF-α)組牙周干細胞骨向分化能力明顯減弱，且JAG1、Notch2蛋白表達水平顯著降低，提示TNF-α可能通過抑制Notch信號通路活化抑制牙周干細胞骨向分化。本研究顯示，當加入不同劑量培哚普利藥物處理后，MSCs中JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Hes1、Hey1 mRNA及其蛋白蛋白水平較DEX組顯著升高，呈劑量依賴性。說明培哚普利可能拮抗DEX抑制Notch通路活化。

綜上所述，培哚普利可抑制DEX誘導的MSCs凋亡，促進成骨分化，可能是通過促進Notch信號通路實現的，可為預防及治療骨質疏松癥提供一定的參考。但細胞凋亡機制較為復雜，具體調控機制仍需開展進一步的深入探討。