小葉中國(guó)蕨中一種ent-貝殼杉烷型二萜化合物分離與結(jié)構(gòu)表征

湯麗萍　姜天菊　戴錫玲　張欣　姜燦　王妮娜　黃國(guó)正　曹建國(guó)

摘? 要： 采用硅膠柱色譜法和重結(jié)晶法分離小葉中國(guó)蕨（）乙酸乙酯相粗組分.從該植物中分離出一種化合物（-kaurane-2β，16，18-triol），并通過1D和2D核磁共振譜、高分辨率質(zhì)譜和單晶X射線衍射方法表征了該化合物的結(jié)構(gòu). 這是從小葉中國(guó)蕨中首次分離出來的一種新穎的-貝殼杉烷型二萜化合物.

關(guān)鍵詞： -貝殼杉烷二萜化合物; 小葉中國(guó)蕨（）; 單晶X射線

中圖分類號(hào)：? R 284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A??? 文章編號(hào)： 1000-5137（2022）01-0032-07

Separation and structural characterization of an -kaurane diterpenoid from

TANG Liping， JIANG Tianju， DAI Xiling， ZHANG Xin， JIANG Can，WANG Nina， HUANG Guozheng， CAO Jianguo

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China; 2.School of Chemistry andChemical Engineering， Anhui University of Technology， Ma’anshan 243002， Anhui， China）

In this study， the crude fraction of ethyl acetate phase of was separated by silica gel column chromatography and recrystallization method. The results showed that a compound， i.e.， kaurane2β， 16α， 18α-triol was isolated from the plant and established by means of 1D and 2D NMR， MS， and single-crystal Xray methods. It is a novel kaurane diterpene that was isolated from for the first time.

kaurane diterpene; ; single-crystal X-ray

0  引 言

粉背蕨屬（）原屬于中國(guó)蕨科（Sinopteridaceae），按照最新的蕨類植物分類系統(tǒng)（PPG），它們被歸類于鳳尾蕨科（Pteridaceae）.該屬植物常旱生，植株矮小，孢子囊群著生于葉片邊緣.粉背蕨屬的許多種類的葉片下表面有淡黃、白或硫磺色的粉狀物.本屬植物中一些種類具有藥用價(jià)值，在中國(guó)民間作為草藥使用，如銀粉背蕨（）在畬族、蒙古族等少數(shù)民族中被用來治療月經(jīng)不調(diào)、腹痛、結(jié)核病和出血等.

小葉中國(guó)蕨（）是中國(guó)特有的一種蕨類植物，僅分布于中國(guó)西南及華北少部分地區(qū)，生長(zhǎng)于海拔500～3 200 m的林下及灌叢石灰?guī)r縫、鈣質(zhì)石縫中.盡管還沒有關(guān)于小葉中國(guó)蕨的藥用記錄，但因其與銀粉背蕨在形態(tài)上極為相似，藥材商在收購(gòu)藥材時(shí)，常把小葉中國(guó)蕨當(dāng)作銀粉背蕨一并收購(gòu)，造成市售藥材的混用和誤用.目前，對(duì)小葉中國(guó)蕨的研究大多集中在形態(tài)和分布上，對(duì)其化學(xué)成分的研究尚未深入.考慮到這兩種植物可能有不同的次生代謝產(chǎn)物，因而具有不同的藥用功效，因此本課題組研究了其化學(xué)成分，從小葉中國(guó)蕨中分離到了2種新型二萜，以及部分已知萜類和黃酮類化合物，這與銀粉背蕨次生代謝產(chǎn)物有一定的差異.此后，又從該植物全株中首次分離出一種新穎的-貝殼杉烷型二萜，通過1D和2D核磁共振（NMR）譜、高分辨率質(zhì)譜（HRMS）和單晶X射線衍射法對(duì)該化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)上的表征，并確認(rèn)該化合物為-kaurane-2β，16α，18α-triol.本研究進(jìn)一步豐富了小葉中國(guó)蕨天然產(chǎn)物種類，對(duì)開發(fā)和利用小葉中國(guó)蕨具有一定的價(jià)值.

1? 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用小葉中國(guó)蕨購(gòu)自云南省，樣品經(jīng)上海師范大學(xué)曹建國(guó)教授鑒定為小葉中國(guó)蕨.憑證標(biāo)本（XY20180601）保存于上海師范大學(xué)奉賢校區(qū)植物園植物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室.干燥全草經(jīng)篩選后剪段，粉碎機(jī)粉碎備用.

實(shí)驗(yàn)試劑：石油醚（PE，分析純）、乙醇（EtOH，分析純）、乙酸乙酯（EtOAc，分析純）、二氯甲烷（CHCl，分析純）、甲醇（MeOH，分析純），上海潤(rùn)捷化學(xué)有限公司;硅膠（G60F-254），青島海洋化工股份有限公司;Sephadex LH-20凝膠（分析純），上海潤(rùn)捷化學(xué)有限公司;薄層層析硅膠板，煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司.

儀器設(shè)備：落地式連續(xù)粉碎機(jī)（DFY-500），上海鼎廣儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-D（Ⅲ）），上海科升儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100），日本EYELA;低溫冷卻水循環(huán)泵（CCA-20），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A），上海海向儀器設(shè)備廠;純水儀（Master-S30），上海和泰儀器有限公司;紫外分析儀（ZF-1），上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司;電子天平（FA1204B），上海天美天平儀器有限公司.

核磁共振譜使用Bruker 600 MHz光譜儀（Bruker，瑞士）測(cè)定.晶體結(jié)構(gòu)采用Bruker D8 Venture衍射儀石墨單色儀CuKα輻射（=0.154 178 nm）測(cè)定.熔點(diǎn)采用X-4微熔點(diǎn)儀（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）測(cè)定.采用AB SCIEX Elite四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀獲得高分辨率質(zhì)譜（電噴霧正模式，ESI）.

實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小葉中國(guó)蕨粗提物提取與分離

小葉中國(guó)蕨干燥全草8.8 kg，粉碎后用90%（體積分?jǐn)?shù)）EtOH約100 L，分4次室溫回旋提取，回收溶劑得總浸膏（450 g），加水使之懸浮，依次使用PE、EtOAc、CHCl、正丁醇（n-BuOH）各萃取3次，得四部分粗提物，質(zhì)量分別為110，90，5，30 g.

1.2.2 -貝殼杉烷二萜化合物提取與分離

乙酸乙酯相浸膏經(jīng)過200～300目（45～75 μm）硅膠柱層析分離，洗脫劑梯度為（PE）∶（EtOAc）=1∶2～0∶1，得到49個(gè)組分.第30組分再使用中壓制備色譜以（CHCl）∶（MeOH）=1∶0～0∶1梯度洗脫后共獲得了48個(gè)亞組分，隨后第35～42亞組分試管壁上有顆粒狀固體析出，合并后利用丙酮洗劑，得到80 mg的淡黃色粉末.

1.2.3 目標(biāo)化合物純化與單晶培養(yǎng)

上述淡黃色粉末經(jīng)薄層色譜和核磁共振譜分析顯示還存在少量的雜質(zhì).隨后取30 mg該粉末，利用硅膠柱色譜，以體積比（CHCl）∶（MeOH）=10∶1對(duì)其進(jìn)行反復(fù)洗脫，得到8.2 mg的白色粉末，即純的化合物.取少量純品，加熱溶解于少量的CHCl/MeOH混合溶劑，然后靜置于室內(nèi)避光處，待溶劑緩慢揮發(fā)，析出少量的無(wú)色針狀晶體.

2? 結(jié)果與分析

解譜分析過程

化合物為白色粉末，析出無(wú)色針狀晶體;難溶于二氯甲烷、氯仿，可溶于二甲基亞砜（DMSO）、MeOH;254 nm下無(wú)熒光，顯色劑為香草醛-硫酸烤硅膠板，呈紫色點(diǎn).根據(jù)HR-ESI-MS（ 322.248 3[M+H]，calcd 323.248 1）和C NMR數(shù)據(jù)顯示其分子式為CHO. 3 500～2 700 cm的紅外吸收帶表明存在3個(gè)羥基.H，C NMR和Dept光譜顯示存在3個(gè)甲基，分別為1.57（s，H-17），1.31（s，H-19）和 1.16 （s，H-20），9個(gè)亞甲基[包括一個(gè)含氧碳（ 65.3，C-18）]，4個(gè)次甲基[包括一個(gè)含氧碳（ 64.1，C-2）]和4個(gè)季碳.

H NMR譜表明， 1.16～1.57被確定為典型甲基信號(hào)，并且根據(jù)異核單量子相關(guān)（HSQC）譜（圖1）中的相關(guān)性來分配H-17（ 1.57）/C-17（ 25.5），H-19（ 1.31）/C-19（ 28.8）和H-20（ 1.16）/C-20（ 20.2）3個(gè)甲基的位置.首先通過H-17的異核多量子相關(guān)（HMBC）（圖2）可確定H-17的3個(gè)C關(guān)聯(lián)信號(hào)分別為 49.7，59.0和78.1，由于季碳處于C譜最低場(chǎng)，推出C-16（ 78.1），再根據(jù)HSQC譜可觀察到 49.7對(duì)應(yīng)一個(gè)H信號(hào)， 59.0對(duì)應(yīng)2個(gè)H信號(hào)，則可以推出次甲基C-13（ 49.7）和亞甲基C-15（ 59.0），最后根據(jù)HSQC譜，推出H-13[ 2.17（1H，m）]和H-15[ 1.69～1.64（1H，m），1.96（1H，t，=11.7 Hz）].結(jié)合HMBC，由H-15的 1.64～1.69可看出一個(gè)未知C4信號(hào)為 45.8.同理，由 1.96可觀察到另一個(gè)C信號(hào)為_C 57.7.繼續(xù)通過兩個(gè)C信號(hào)各自對(duì)應(yīng)的HSQC譜，可推出一個(gè)為次甲基，一個(gè)為季碳，并結(jié)合H-15遠(yuǎn)程相關(guān)C信號(hào)可推斷出次甲基C-9（ 57.7）、季碳C-8（ 45.8）和亞甲基C-7（ 43.4）.根據(jù)HSQC確定了H-9[ 1.14～1.05（1H）]和H-7[ 1.56～1.40（1H，m），1.72（1H，dd，=11.5，8.1 Hz）]，隨后通過H-5的HMBC相關(guān)性歸屬了C-6（ 21.2），由HSQC確定H-6[1.56～1.40（1H，m），1.72（1H，dd，=11.5，8.1 Hz）].同樣，根據(jù)甲基H-20的HMBC相關(guān)性可判斷出季碳C-10（ 41.5）、次甲基C-5（ 57.0）和亞甲基C-1（ 51.1），以及較遠(yuǎn)亞甲基信號(hào)C-11（ 19.0）.隨后結(jié)合HSQC相關(guān)性確定了H-5[ 1.14～1.05（1H）]，H-1[ 1.14～1.05（1H），2.56（1H，d，=11.7 Hz）]和H-11[ 1.64～1.59（1H，m），1.69～1.64（1H，m）].結(jié)合低場(chǎng)C-9（ 1.14～1.05; 57.7）的HMBC相關(guān)性，可以判斷出C-12（ 27.6）/H-12[ 1.64～1.59（2H，m）].根據(jù)含氧碳次甲基C-2（ 64.1）的HSQC相關(guān)性可確定H-2[ 4.41（1H，tt，=11.3，4.2 Hz）]，再根據(jù)H-2的HMBC相關(guān)性可歸類亞甲基C-3（ 46.6）和最后一個(gè)季碳C-4（ 41.5），隨之H-3[ 1.37（1H，t，=12.1 Hz），2.92（1H，d，=12.7 Hz）]也被確定.同理，最后一個(gè)亞甲基C-14也得到歸屬，即為H-14[ 1.96（1H，dd，=11.2，4.5 Hz），2.05（1H，dd，=11.2，4.5 Hz）].

結(jié)合1D NMR和2D NMR譜相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，化合物中的-貝殼杉烷型二萜骨架的歸屬也得到相應(yīng)的驗(yàn)證.此外，從CHCl中獲得了適合X射線晶體學(xué)分析的無(wú)色針狀晶體，該化合物詳細(xì)單晶數(shù)據(jù)存放于劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心，編號(hào)20210750（圖3），并確定了完整的結(jié)構(gòu)和絕對(duì)構(gòu)型（2，4，5，8，9，10，13，16）.化合物被確定為（2，4，4，6，8，9，11，11）-4-（hydroxymethyl）-4，8，11b-trimethyltetradecahydro-6a，9-methanocyclohepta[]naphthalene-2，8-diol，即-kaurane-2β，16α，18α-triol（圖4）.通過無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)（DEPT），化學(xué)位移相關(guān)（COSY），HSQC和HMBC譜確定H和¹³C NMR信號(hào)分配，如表1所示.

單晶衍射分析

單晶X射線衍射分析結(jié)果證實(shí)了化合物的分子結(jié)構(gòu).該化合物屬于三斜晶系，結(jié)晶位于空間群，并且每個(gè)晶格中僅包含一個(gè)晶體學(xué)獨(dú)立的有機(jī)物分子.如圖3所示，在化合物的分子結(jié)構(gòu)中，3個(gè)環(huán)己基和1個(gè)環(huán)戊基通過肩并肩的形式連接，形成其骨架結(jié)構(gòu).其中，所有的環(huán)己基均采用較為穩(wěn)定的椅式構(gòu)型.此外，在化合物的晶體結(jié)構(gòu)中，兩種不同的分子間C―H…O氫鍵弱作用（C―H…O：距離為2.80×10 m，角度為125.03°;C―H…O：距離為3.04×10 m，角度為154.98°）使其二維結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)格狀.并進(jìn)一步堆積成三維孔道結(jié)構(gòu)，而且在孔道中包裹著大量的水分子.

3? 討 論

通過分離技術(shù)及譜圖分析，從小葉中國(guó)蕨全草乙酸乙酯相粗提物中首次分離得到了一個(gè)不常見的二萜三醇化合物.通過文獻(xiàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)化合物的結(jié)構(gòu)與-2α，16-18-trihydroxy-kauran結(jié)構(gòu)相似，區(qū)別在于該化合物18號(hào)位甲氧基碳信號(hào)為S型，并且也和-kaur-16（17）-en-2β，6β，19-triol骨架相似，區(qū)別為該化合物在6號(hào)位無(wú)羥基、16號(hào)位是甲基和羥基結(jié)構(gòu)，這些相似化合物的信息為化合物的結(jié)構(gòu)確定及核磁共振譜歸屬提供了重要的幫助，但仍無(wú)法確定化合物的明確結(jié)構(gòu).后將該化合物白色粉末在CHCl/MeOH的混合溶劑中培養(yǎng)成無(wú)色針狀晶體，并通過單晶X射線數(shù)據(jù)確定了其絕對(duì)構(gòu)型，即為-kaurane-2β，16α，18α-triol.該結(jié)構(gòu)與YAN等分離出的2β，16α，19-trihydroxy--kaurane是一致的.但是本研究的H，C NMR數(shù)據(jù)與其他報(bào)道的還有部分的差異，這可能是由于測(cè)量核磁共振譜時(shí)所用的氘代溶劑不同所引起的.另外，他們可能錯(cuò)誤地把18位的羥基歸到19位上.

通過本課題組對(duì)小葉中國(guó)蕨植物的研究，共獲得了不同類型的二萜化合物，如鳥巢烷型二萜（即金粉蕨醇B和14-oxy-7，20-dihydroxycyath-12，18-diene）、-海松烷型二萜（-8（14），15-pimaradiene-2β，19-diol）和-貝殼杉烷型二萜（-kaurane-2β，16α，18α-triol和aleuritopsis B）等.其中金粉蕨醇B、aleuritopsis B和-8（14），15-pimaradiene-2β，19-diol這3個(gè)二萜類化合物質(zhì)量較大，可能為小葉中國(guó)蕨中的特征性二萜化合物.而銀粉背蕨中分離得到的二萜主要為半日花烷型二萜（粉背蕨酸）和-貝殼杉烷型二萜，即aleuritopsis A和aleuritopsis B.這表明小葉中國(guó)蕨與銀粉背蕨化學(xué)成分存在不同，故不能混用.同時(shí)，本文作者正進(jìn)一步開展了這些二萜化合物相關(guān)活性實(shí)驗(yàn)，并對(duì)結(jié)構(gòu)特征與活性效果的關(guān)系做了進(jìn)一步闡述.

蕨類植物又被稱為羊齒植物，在植物系統(tǒng)中介于苔蘚植物和種子植物之間.作為植物界的重要組成部分，蕨類植物不僅有食用、觀賞、指示植物和修復(fù)環(huán)境等作用，在民間也常作藥用.藥用蕨類植物大多數(shù)以全草或根莖入藥，且大多都含有黃酮類、萜類、酚酸、甾體和生物堿等活性成分.如槲蕨屬（）的許多植物常被稱為“骨碎補(bǔ)”被廣泛使用，其有效成分具有強(qiáng)筋健骨、降血脂、鎮(zhèn)痛等作用.因此，對(duì)藥用蕨類植物的研究具有意義重大.

前人研究發(fā)現(xiàn)，銀粉背蕨中主要天然產(chǎn)物為半日花烷型二萜和-貝殼杉烷型二萜類化合物.CHI等歸納總結(jié)了穿心蓮植物中的有效成分半日花烷型二萜內(nèi)酯化合物具有顯著的抗炎、抗腫瘤和抗血栓等多種藥理活性.ZHANG等詳細(xì)闡述了近年來新發(fā)現(xiàn)與合成的-貝殼杉烷型二萜化合物的細(xì)胞毒活性作用，可以看出該類化合物在抗腫瘤活性方面已呈現(xiàn)出相當(dāng)?shù)臐摿Γ@也佐證了粉背蕨屬大多數(shù)植物可以入藥.

4? 結(jié) 論

小葉中國(guó)蕨是我國(guó)特有的一種粉背蕨屬蕨類植物，目前，對(duì)其化學(xué)成分的研究尚未深入.本課題組系統(tǒng)地分離了小葉中國(guó)蕨全株植物，并在本研究中分離得到了一種-貝殼杉烷型二萜化合物.通過單晶X射線方法確定了其絕對(duì)構(gòu)型，明確其為-kaurane-2β，16α，18α-triol.通過小葉中國(guó)蕨與銀粉背蕨的化學(xué)成分對(duì)比，確定了這兩種植物化學(xué)成分不同，而不能作為民間的通經(jīng)草（銀粉背蕨）藥材混用.該研究充分體現(xiàn)了小葉中國(guó)蕨植物化學(xué)研究的必要性，也為小葉中國(guó)蕨及其他粉背蕨屬蕨類植物的深入研究提供了理論與數(shù)據(jù)參考.

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（責(zé)任編輯：顧浩然，郁慧）

收稿日期： 2021-09-01

基金項(xiàng)目： 上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心支持項(xiàng)目（17DZ2252700）

作者簡(jiǎn)介： 湯麗萍（1996—），女，碩士研究生，主要從事植物化學(xué)方面的研究. E-mail： 1286531918@qq.com

* 通信作者： 黃國(guó)正（1979—），男，副教授，主要從事天然藥物化學(xué)和有機(jī)合成方法學(xué)方面的研究. E-mail： guozheng.huang@yahoo.com;曹建國(guó)（1968—），男，教授，主要從事植物生物學(xué)和植物資源學(xué)方面的研究. E-mail： cao101@shnu.edu.cn

引用格式： 湯麗萍， 姜天菊， 戴錫玲， 等. 小葉中國(guó)蕨中一種-貝殼杉烷型二萜化合物分離與結(jié)構(gòu)表征 [J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，51（1）：32?38.

?TANG L P， JIANG T J， DAI X L， et al. Separation and structural characterization of an?-kaurane diterpenoid from??[J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：32?38.