福建云霄地方茶樹品種資源生化成分特征分析與評價

陳瀟敏，趙 峰，金 珊，吳文晞，王鵬杰，葉乃興*

(1 福建農林大學 園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福州 350002；2 福建中醫藥大學 藥學院，福州 350122；3 福建恒正檢測技術有限公司，福州 350100)

茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]種質資源是茶樹品種選育和茶樹生物學基礎研究的原始材料，也是茶樹種質創新、生產利用的物質基礎[1]，兒茶素、生物堿、茶氨酸等成分優異茶樹資源的挖掘、篩選是茶樹育種的重要目標[2]。云霄位于福建東南部，屬亞熱帶海洋性季風氣候，地形多丘陵、低山，地貌多花崗巖露巖，具有悠久的茶葉種植和制作歷史[3]，該地區野生茶樹資源豐富，主要分布于云霄縣火田鎮白石村大帽山、小帽山、小尖山及周邊山地，總面積在100 hm2以上[4-6]。特別是近年在該地區發現了野生禿房茶樹群體種，相關的形態學調查也表明，該地區野生茶樹體高大，葉色、葉片大小、花果等性狀各異，且茶樹分布規律，屬有性系群體[7-8]。

兒茶素、嘌呤生物堿、氨基酸組分是茶樹品種鮮葉中的最主要的生化成分，其組分構成及含量決定了茶葉品質的優劣以及適制性，從而決定了茶樹資源的開發利用價值，兒茶素、生物堿、茶氨酸等生化成分特異茶樹品種是今后茶樹育種的主要目標之一[9]。近年來在茶樹生化成分特異資源的篩選、評價鑒定已取得顯著進展[10-11]，但是高含量的表沒食子兒茶素-3-O-甲基-沒食子酸酯(EGCG3″Me)、苦茶堿等特異茶樹種質資源尚待進一步挖掘。本課題組對采集自福建省云霄縣地方茶樹資源聚集度較高的南烏山、梁山和小帽山，3個區域內共23份云霄縣地方茶樹資源的兒茶素、嘌呤生物堿和氨基酸組分進行了分析，旨在挖掘出優特異茶樹種質資源，為茶樹品種創新和特異資源的創新利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料于2021年3月采集福建省云霄縣23份茶樹品種資源的一芽二葉鮮葉,參試茶樣信息見表1。采用液氮固樣，以干冰保存并轉運至福建農林大學茶學福建省高校重點實驗室，冷凍干燥后粉碎過60目篩。

表1 23份云霄地方茶樹品種資源信息

1.1.2 儀器與設備UltiMate 3000 高效液相色譜儀(美國，賽默飛世爾科技公司)，C18反相色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)(中國，廣州菲羅門公司)；NexeraX2 LC-30A高效液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)，串聯Sciex 4500 Q-Trap質譜儀(美國，Sciex公司)；C18反相色譜柱(2.6 μm，2.1×100 mm)(中國，廣州菲羅門公司)；AB204-N分析天平(美國，梅特勒公司)；超純水系統(中國，Medium Touch，上海和泰儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 兒茶素組分測定方法采用高效液相色譜法，參照王麗麗等[12]方法稍作修改，具體步驟如下：

色譜條件：流動相A為0.2%甲酸-水溶液(v∶v)，流動相B為甲醇；流速，1.00 mL/min；柱溫，40 ℃；進樣量，10 μL。梯度洗脫條件，0～2 min，88% A；2～10 min，88%～75% A；10～15 min，75%～73% A；15～25 min，73%～68% A；25～30 min，68% A；30～32 min, 68%～88% A。前處理方法：分別稱取0.200 g樣品，分別加入30 mL甲醇，渦旋，超聲提取30 min，冷卻后于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機相微孔濾膜。

1.2.2 嘌呤生物堿組分測定方法參照陳瀟敏等[13]，采用液質聯用方法測定。

1.2.3 氨基酸組分測定方法按照Zhou等[14]，采用AQC衍生液質聯用法測定。

1.3 標準品與試劑

9種兒茶素標品：表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methylgallate)，EGCG3″Me]、兒茶素(catechin, C)、表兒茶素(epicatechin, EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallicacid, EGCG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)、沒食子兒茶素(gallocatechin, GC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate, GCG)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate, CG)；4種嘌呤生物堿標品：咖啡堿(caffeine, CAF)、可可堿(theobromine, TB)、苦茶堿(theacrine, TC)、茶堿(theophylline, TP)；33種氨基酸標品：丙氨酸(alanine, Ala)、α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid, α-ABA)、β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid, β-ABA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)、精氨酸(arginine, Arg)、天冬氨酸(aspartic acid, Asp)、瓜氨酸(citrulline, Cit)、羥脯氨酸(hydroxyproline, Hy-pro)、胱氨酸[cystine,(Cys)2]、組氨酸(histidine, His)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、羥賴氨酸(hydroxylysine, Hy-Lys)、異亮氨酸(isoleucine, Ile)、亮氨酸(leucine, Leu)、賴氨酸(lysine Lys)、蛋氨酸(methionine, Met)、1-甲基-L-組氨酸(1-methyl-L-histidine, 1-M-His)、3-甲基-L-組氨酸(3-methyl-L-histidine, 3-M-His)、鳥氨酸(ornithine, Orn)、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)、脯氨酸(proline, Pro)、肌氨酸(sarcosine, Sar)、絲氨酸(serine, Ser)、蘇氨酸(threonine, Thr)、色氨酸(tryptophan, Trp)、酪氨酸(tyrosine, Tyr)、纈氨酸(valine, Val)、天冬酰胺(asparagine, Asp)、半胱氨酸(L-cysteine, Cys)、茶氨酸(theanine, Thea)、谷氨酰胺(glutamine, Gln)、谷氨酸(glutamic acid, Glu)、甘氨酸(glycine, Gly)，均購于源葉生物科技有限公司(中國，上海)，純度均大于98%。色譜純甲醇(中國，安譜實驗科技股份有限公司)；色譜純乙腈(中國，上海默克化工技術有限公司)，色譜純甲酸(中國，國藥集團化學試劑有限公司)。甲酸銨(中國，安譜實驗科技股份有限公司)。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 云霄地方茶樹品種資源兒茶素組分分析

本研究測定了9種主要兒茶素，即EGC、C、EGCG、EC、EGCG3″Me、ECG、GC、GCG和CG，其中GC、GCG和CG在23份資源中均未檢測(圖1)；其余的6種兒茶素組分在23份茶樹種質中的平均含量分別為16.00、1.86、104.55、4.64、14.23和19.17 mg·g-1(表2)。23份茶樹品種資源中，兒茶素總量在73.54～260.31 mg·g-1，其中，EGCG的含量最高，EC和C在不同品種資源中含量均較低。另外，在23份云霄地方茶樹品種資源中均檢測到EGCG3″Me，其最大值為33.65 mg·g-1，均值大于10 mg·g-1，說明云霄地方茶樹群體蘊含豐富的EGCG3″Me資源。由表2還可知，23份茶樹品種資源中，兒茶素各組分含量及總量等7個指標的變異系數在31.46%～109.75%，變異范圍較大，其中C含量的變異系數最大。遺傳多樣性指數(H′)在1.27～1.99，其中EGC、EC的遺傳多樣性指數較高。

表2 23份云霄地方茶樹品種資源兒茶素含量的分布特征和變異情況

23份云霄地方茶樹品種資源的兒茶素指數(CI)如圖2所示。前人研究報道福建地區的兒茶素指數較低，而云南地區的兒茶素指數較高，可能是因為福建茶樹資源EGCG含量較高，從而導致CI值低。從圖中可以看出，該地區的茶樹資源CI值均低于0.5，最高為L02(0.26)，這一結果與前人研究相一致。

2.2 云霄地方茶樹品種資源嘌呤生物堿組分分析

在23份茶樹品種資源中，均未檢測出茶堿，部分茶樹品種資源中含有可可堿和苦茶堿(圖3)。咖啡堿、苦茶堿、可可堿及嘌呤生物堿總量的分布范圍分別在14.59～46.45、0.00～33.50、0.00～1.69和15.28～70.42 mg·g-1，平均含量分別為32.58、7.63、0.73和40.95 mg·g-1(表3)。咖啡堿和嘌呤生物堿總量的變異系數均小于30%，而苦茶堿的變異系數最大，為161.16%。各組分的遺傳多樣性指數(H′)為1.15～2.07，其中可可堿和總量均大于2.00，說明其具有較高的多樣性。

表3 23份云霄地方茶樹品種資源嘌呤生物堿含量的分布特征和變異情況

在栽培茶樹品種中，嘌呤生物堿的分布模式主要是以咖啡堿為主，含有少量的可可堿和微量的茶堿。苦茶堿僅在部分苦茶中含有。本研究的23份云霄地方茶樹品種資源中，南烏山及小帽山地區僅有4份資源檢出苦茶堿，且含量均低于10 mg·g-1(X01除外)，而在梁山地區的茶樹品種資源(L01～L06)均檢測出苦茶堿，且含量均高于10 mg·g-1(L05除外)。L06和L07的苦茶堿含量高于其咖啡堿含量，其嘌呤生物堿模式異于普通茶樹，可作為苦茶堿形成機理研究及特異資源育種材料(圖4)。

2.3 云霄地方茶樹品種資源游離氨基酸構成分析

茶氨酸(Thea)是茶樹鮮葉中的主要氨基酸，其與谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)均為鮮味氨基酸。在23份茶樹種質中，這3種物質的平均值分別為12.74、1.55和0.66 mg·g-1，變異系數均大于66%。丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和蘇氨酸(Thr)為甜味氨基酸，在23份茶樹品種資源中平均值分別為0.45、0.20和0.35 mg·g-1。苦味氨基酸如酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)和異亮氨酸(Ile)含量較高，除了異亮氨酸(Ile)，其余3個組分含量平均值均超過了0.3 mg·g-1。不同氨基酸組分變異系數差異較大，其中天冬酰胺(Asn)、甘氨酸(Gly)、β-氨基丁酸(β-ABA)、谷氨酰胺(Gln)和精氨酸(Arg)的變異系數均超過了100%。可見，云霄地方茶樹品種資源的氨基酸組分存在豐富變異(表4)。

表4 23份云霄地方茶樹品種資源氨基酸含量的分布特征和變異情況

2.4 不同區域云霄地方茶樹品種資源滋味物質成分分析

為探究云霄不同區域茶樹品種資源之間的差異物質，我們以6種兒茶素組分、3種嘌呤生物堿及20種氨基酸為指標，進行單因素方差分析，篩選獲得影響不同區域云霄地方茶樹品種資源滋味物質的差異物質。結果如圖5所示，29種物質在3個類群中有16種物質含量存在極顯著差異，如EGC、EC、EGCG3″Me、苦茶堿(TC)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)，而EGCG、咖啡堿(CAF)、茶氨酸(Thea)等13種物質含量在3個類群中無顯著差異。以各類群的EGCG3″Me、苦茶堿(TC)、酪氨酸(Tyr)及丙氨酸(Ala)含量數據繪制箱型圖(圖6)可知，小帽山茶樹資源的EGCG3″Me及酪氨酸(Tyr)含量極顯著高于其他2個類群，而梁山茶樹資源的苦茶堿(TC)及纈氨酸(Val)含量極顯著高于其他2個類群，南烏山茶樹資源的4種物質含量均為最低。

偏最小二乘法判別分析(PLS-DA,partial least squares discriminant analysis)是一種常用來處理分類和判別問題的方法，能夠較為直觀地區分組間差異。對不同生長區域云霄地方茶樹品種資源的主要滋味成分進行sPLS-DA分析，以貢獻率最高的兩個主成分為橫縱坐標軸繪制各類群的得分圖(圖7)。從圖中可以看出，云霄不同區域的茶樹品種資源在滋味成分上具有較大差異。梁山和小帽山地區的茶樹資源沒有完全分開，而南烏山地區的茶樹資源與其他兩個區域完全分開。該結果說明，梁山和小帽山地區的茶樹資源品質構成較為相近，而南烏山地區與前二者間存在較為明顯的差異。

以23份云霄地方茶樹品種資源的29種物質含量繪制聚類熱圖(圖8)，從圖中可以看出不同區域的云霄地方茶樹品種資源在生化成分上都具有各自的特點。如圖中區域1為南烏山茶樹資源高含量的生化成分，主要是氨基酸組分，如丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)。區域2展示了梁山較高含量的組分，如天冬酰胺(Asn)、賴氨酸(Lys)等氨基酸組分，除此之外，梁山茶樹資源還具有高含量的苦茶堿(TC)。區域3為小帽山茶樹資源的高含量組分，主要是兒茶素組分，如EGC、EGCG、EGCG3″Me、ECG等，除此之外，咖啡堿(CAF)在該類群也具有較高的含量。

2.5 云霄地方茶樹優異資源的篩選

根據生化成分測定結果，參照王新超等[16]的茶樹優異資源篩選指標，從23份云霄地方茶樹品種資源中篩選出一批生化成分特異的品種資源(表5)，包括5份高兒茶素茶樹資源，2份高EGCG茶樹資源、6份高EGCG3″Me茶樹資源、2份高嘌呤生物堿茶樹資源、2份高苦茶堿資源和1份高茶氨酸茶樹資源。

表5 云霄地方茶樹優異資源的篩選

3 討 論

3.1 云霄地方茶樹品種資源總體生化成分特征

云霄地方茶樹品種資源中兒茶素組分均以EGCG、ECG和EGC為高含量組分,其中EGCG含量最高，這與前人的研究結果一致[12,16]。研究表明，中國茶樹種質具有豐富的多樣性，但中國茶樹種質的整體兒茶素指數(CI)較低，除云南茶樹資源的CI大于0.5，其他地區的茶樹種質資源的CI值均不足0.5[17]。本研究結果顯示，云霄地方茶樹品種資源的CI值也較低，最大值僅為0.26。EGCG3″Me(表沒食子兒茶素-3-O-甲基-沒食子酸酯)是茶葉中一種天然被修飾的兒茶素物質，相較于EGCG,它的抗過敏和消炎等藥理作用更強，尤其是花粉過敏反應的抑制效果極佳[18-20],但是目前中國發現天然含有EGCG3″Me的茶樹并不多[21-23]，而在云霄地方茶樹群體中均檢測到了EGCG3″Me，且部分資源含量較高，如小帽山3號(X03)含量高達33.65 mg·g-1。這也為茶樹中甲基化兒茶素的積累及分子研究提供了試驗材料。

云霄地方茶樹品種資源中嘌呤生物堿組分含量及構成與普通茶樹相一致，以咖啡堿為主要嘌呤生物堿，含有少量的可可堿，均未檢測到茶堿。而在部分資源中檢測到了苦茶堿，其中梁山1號(L01)和梁山6號(L06)苦茶堿含量大于30 mg·g-1。迄今為止，含有苦茶堿的野生茶樹資源研究集中于福建、廣東、貴州、云南、江西等地區[23-28]，福建高苦茶堿茶樹種質資源豐富，‘梁山1號’和‘梁山6號’的發現，可為高苦茶堿茶樹品種培育及開發利用提供茶樹資源材料。

云霄地方茶樹品種資源中氨基酸組分種類豐富，不同滋味的氨基酸種類均有檢出。氨基酸組分是茶葉滋味和香氣形成的重要前體物質，其組分的多樣性為云霄高香優質茶葉產品的加工制作奠定了物質基礎。該群體中的梁山6號(L06)屬于高茶氨酸特異資源。

3.2 不同區域的云霄地方茶樹種質資源生化成分特點

魏沙沙等[29]對自然分布的尤溪4個區域(赤墓村、光明村、丘山村、赤墓村非保護區)37份苦茶單株進行主要滋味物質檢測，結果表明4個區域均有各自特征，其中赤墓村苦茶苦味程度較高，酯型兒茶素以及可可堿含量較高；光明村苦茶苦味最低，丘山村苦茶的賴氨酸等含量較高，赤墓村非保護區群體的鮮味氨基酸如天冬氨酸含量更高。本研究發現云霄南烏山、梁山、小帽山3個區域的茶樹資源也具有明顯的區域特點。梁山茶樹資源均含有苦茶堿(TC)，且部分茶樹資源含量較高，如‘梁山1號’(L01)和‘梁山6號’(L06)，苦茶堿含量均超過30 mg·g-1。小帽山茶樹資源兒茶素組分較為特異，ECGC和EGCG3″Me含量較高。高EGCG3″Me含量的茶樹種質資源的分布具有一定的區域性特征。研究發現廣東和福建兩省含有EGCG3″Me的茶樹種質資源較多，高于云南等地[30]。南烏山茶樹資源表現為某些氨基酸組分如丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)含量較高。區域特色的形成與區域間的地理位置、環境差異密切相關，具體形成機理仍需進一步研究。茶樹資源的區域特色性為當地茶葉資源利用及加工提供了一定的理論基礎。

致謝：本研究實驗樣品采集承蒙云霄縣茶葉科學研究會王彩云、方德音、蔡捷英、王金煥等各位老師，漳州仙隱峰茶葉有限公司張木山董事長、福建省顧恒生態農業發展有限公司張英豪董事長的大力支持，特此致謝！