生龍接骨膠囊對SD大鼠骨折愈合過程中BMP-2及BMP-7表達的影響*

丁 超 占海思 萬春虎 梁 詈 朱浩亮 熊名副△

由于交通事故、意外跌倒等原因，全球每周有數萬計骨折的發生，每年骨折的治療費用高達數十億美元[1]。促進骨折部位的愈合、緩解疼痛是目前骨折治療的主要方法。資料表明[2]，中醫藥在治療骨折方面優勢明顯，很多中藥能有效促進骨折的愈合，加快骨折患者的恢復[3，4]。生龍接骨膠囊是南昌市洪都中醫院的一個院內制劑，近年來應用與骨折的治療中療效確切，可有效促進骨痂生長和骨折的愈合、提升骨密度，利于患者轉歸[5-7]。雖然生龍接骨膠囊臨床治療骨折安全有效，但目前缺乏對生龍接骨膠囊作用機制相關的研究。鑒于此，本研究建立脛骨骨折大鼠模型，從成骨細胞的增殖、BMP-2和BMP-7等的表達等方面對生龍接骨膠囊促進大鼠骨折愈合的作用機制進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料SD大鼠180只，雄性，清潔級，8周齡，體質量155～175 g，由江西中醫藥大學動物科技中心提供，在江西中醫藥大學實驗動物中心飼養，自由進食和飲水，飼養室溫度22～25 ℃、濕度40%～50%。生龍接骨膠囊由南昌市洪都中醫院制劑室制備。PBS緩沖液實驗室自行配置。PBS緩沖液配置方法：磷酸二氫鉀0.24 g，磷酸氫二鈉1.44 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g。加去離子水800 ml充分攪拌溶解，稀鹽酸調pH至7.4，最后定容到1 L；其他相關試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物的分組按照隨機數字法，將實驗大鼠分為正常組(空白組)、對照組(自然恢復組)、生龍接骨膠囊低、中、高劑量組，每組36只。參照《中醫正骨學》中的骨折分期，除空白組外，各組大鼠又分為早、中、后3期骨折模型，每期分別12只。

1.2.2 大鼠脛骨骨折模型的建立將自然恢復組、對照組和生龍接骨膠囊低、中、高劑量組大鼠建立脛骨骨折模型。大鼠雙下肢常規脫毛處理，1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，無菌條件下雙下肢脛骨上1/3段前正中點，橫行切開骨膜造成約2.0 mm×1.5 mm大小的骨缺損。造模后1周的大鼠為早期骨折模型，3周的為中期骨折模型，4周的為后期骨折模型(即造模后第1周、第3周和第4周開始給藥治療)，以此作為骨折愈合基礎模型。每只大鼠腹腔注射青霉素20萬IU/d，連續注射7 d，預防感染。

1.2.3 治療方法正常組和對照組大鼠給予生理鹽水灌胃，每次灌胃體積1 ml。生龍接骨膠囊低、中、高劑量組分別給以生龍接骨膠囊10 g/(kg·d)、20 g/(kg·d)、40 g/(kg·d)灌胃治療，每次灌胃體積1 ml。其中生龍接骨膠囊早、中、后3期分別在造模后第1周、第3周和第4周開始給藥治療，對照組早、中、后3期分別在造模后第1周、第3周和第4周給以生理鹽水灌胃，空白組在各取12只，分別在相同時期給予生理鹽水灌胃。各組大鼠分別連續灌胃2周。

1.2.4 觀察指標開始治療后觀察各組大鼠下肢發生自主活動的開始時間，患處局部血腫消腫的時間。各組與末次給藥后2 h，眼球取血。取血后脫頸處死再常規處理脛骨骨折處標本，CCK-8法測定各組骨折斷端成骨細胞的A值(A值越高，表示成骨細胞數量越多)，酶聯免疫吸附法測定BMP-2和BMP-7的表達情況。

2 結果

2.1 一般情況治療過程中，對照組和治療組共144只大鼠，建模過程中死亡1只，其余143只成功建立骨折模型。空白組大鼠未活動正常，未發現死亡現象。治療組低、中、高劑量組給藥連續給藥7 d后可見骨折部位有局部突起增生，給藥14 d后可見到清晰的骨痂形成，但對照組大鼠灌胃14 d沒有發現有骨痂形成，僅有骨膜反應。

2.2 成骨細胞增殖情況與正常組比較，對照組的A值顯著升高，表明大鼠骨折后，成骨細胞開始生長。生龍接骨膠囊低、中、高劑量顯著高于對照組(P<0.05)，且呈劑量依賴性。低、中、高劑量組成骨細胞的A值早期>中期>后期(P<0.05)，這表明，治療越早，效果越好。CCK-8法比較各組大鼠治療前后不同時期成骨細胞的增殖情況。見表1。

表1 各組大鼠不同時期成骨細胞增殖A值比較 (只，

2.3 BMP-2表達生龍接骨膠囊低、中、高劑量BMP-2的表達顯著高于對照組(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴關系。低、中、高劑量組BMP-2的表達量早期>中期>后期(P<0.05)，這表明，治療越早，效果越好。見表2。

表2 各組大鼠BMP-2表達結果比較 (只，

2.4 BMP-7表達生龍接骨膠囊低、中、高劑量BMP-7的表達顯著高于對照組(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴關系。低、中、高劑量組BMP-7的表達量早期>中期>后期(P<0.05)，這表明，治療越早，效果越好。見表3。

表3 各組大鼠BMP-7表達結果比較 (只，

3 討論

本研究中生龍接骨膠囊對SD大鼠骨折愈合不同時期BMP-2及BMP-7的表達影和成骨細胞的增殖進行了初步的研究。研究的結果表明，生龍接骨膠囊低、中、高劑量組BMP-2及BMP-7的表達顯著高于對照組和正常組，且早期>中期>后期，且表現出劑量依賴性。這表明，骨折發生后，治療越早，效果越好。資料表明[8，9]，BMP-2和BMP-7是重要的骨折愈合促進蛋白，能誘導骨髓間充質前體細胞分化為成骨細胞，促進骨折的愈合，調節骨缺損的修復。資料表明[10]，成骨細胞在骨折的愈合過程中起十分關鍵的作用。本研究的結果表明，生龍接骨膠囊能通過上調BMP-2和BMP-7蛋白的表達，促進成骨細胞的增殖來達到促進骨折愈合的目的。臨床實踐經驗表明[11]，中醫藥在骨折治療方面安全有效，能通過多種作用機制促進骨折愈合，調節骨缺損的修復。生龍接骨膠囊是南昌市洪都中醫院的院內制劑，由生龍骨、三七、當歸、熟地黃、自然銅、雞血藤、續斷、骨碎補、炒土鱉蟲、乳香、淫羊藿、血竭等多種中藥組成，能活血化瘀，強筋健骨、療傷續折，尤長于促進骨折愈合。本研究的結果表明，生龍接骨膠囊能促進大鼠骨折的愈合，且早期的效果>中期>后期。這表明，對于骨折治療的越早，效果越好。