基于HS-SPME-GC-MS的小龍蝦加工水煮液中揮發性風味成分萃取條件優化

楊祺福

徐文思1,2,3,4,5

胡思思1,2,3,4,5

馬嘉晨1,2,3,4,5

黃 迪1,2,3,4,5

劉麗萍1,2,3,4,5

賀 江1,2,3,4,5

楊品紅1,2,3,4,5

周順祥6

(1. 湖南文理學院生命與環境科學學院，湖南 常德 415000；2. 水產高效健康生產湖南省協同創新中心，湖南 常德 415000；3. 環洞庭湖水產健康養殖及加工湖南省重點實驗室，湖南 常德 415000；4. 水生動物重要疫病分子免疫技術湖南省重點實驗室，湖南 常德 415000；5. 常德市農業生物大分子研究中心，湖南 常德 415000；6. 順祥食品有限公司，湖南 益陽 413200)

小龍蝦是一種淡水經濟蝦類，因滋味鮮美廣受消費者喜愛。其水煮液是加工過程中的副產物，具有濃郁的小龍蝦鮮香味及豐富的營養成分[1]，直接排放不僅造成資源浪費，還污染環境。食品風味是衡量食品食用品質的一個重要指標，風味成分種類、含量對食品最終風味的形成起著重要作用，而風味前體物質在加熱后發生分解及氧化還原等一系列化學變化，是食品中揮發性風味物質產生的主要途徑之一[2-3]。食品中風味物質常用的提取方法有頂空固相微萃取法(HS-SPME)、微波輔助萃取法(MAE)和同時蒸餾萃取法(SDE)等[4]。HS-SPME多數與氣相色譜—質譜技術(GC-MS)聯用形成一種快速高效的分析提取技術，具有前處理簡單、分析時間短、重復性佳等優點，被廣泛應用于食品及農產品檢測分析等行業[5-6]。該技術檢測效果受到多種因素影響，主要有萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間、鹽度和平衡時間等[7]。研究擬以小龍蝦加工水煮液為研究對象，通過單因素結合正交試驗優化HS-SPME-GC-MS技術檢測小龍蝦加工水煮液中揮發性風味物質的最佳萃取條件，并分析其揮發性風味物質組成，以期為小龍蝦加工水煮液的回收利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

水煮液：參照文獻[1]制備；

氯化鈉(NaCl)：分析純，湖南匯虹試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜—質譜聯用儀：7820A GC-5977E MSD型，美國Agilent Technologies公司；

頂空固相微萃取手動進樣手柄：SAAB-57330U型，上海安譜實驗科技股份有限公司；

固相微萃取頭：SAAB-57328U型，50/30 μm DVB/CAR/PDMS，上海安譜實驗科技股份有限公司；

電子天平：AUX120型，日本島津公司；

恒溫水浴鍋：HH-2型，上海秋佐科學儀器有限公司；

磁力攪拌器：TALBOYS 7X7型，美國Henry Tormenter公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 固相微萃取頭老化 選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，250 ℃的GC進樣口處老化20～30 min，直至GC-MS測定無干擾峰出現。

1.2.2 頂空固相微萃取 參照文獻[8]。

1.2.3 GC-MS分析 參照文獻[9]，并根據GC-MS分析結果中各成分相對保留時間，通過N1ST14.L質譜庫進行檢索定性，分析相似指數(SI)≥80%化合物的檢索結果[10]。

1.2.4 單因素試驗 以揮發性風味物質的峰個數和總峰面積作為指標，分別考察平衡時間(0，5，10，15，20 min)、NaCl添加量(0%，10%，20%，30%，40%)、萃取時間(20，30，40，50，60 min)和萃取溫度(65，70，75，80，85 ℃)對小龍蝦加工水煮液中揮發性風味物質萃取效果的影響。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以綜合評分為標準，設計L9(34)正交試驗表優化HS-SPME-GC-MS萃取工藝。

1.2.6 綜合評分 參照文獻[10]，峰個數與總峰面積的權重系數為0.5，按式(1)計算綜合評分。

(1)

式中：

A——綜合評分；

Mi——揮發性風味物質峰個數；

Mmax——揮發性風味物質峰個數最大值；

Ni——揮發性風味物質總峰面積；

Nmax——揮發性風味物質總峰面積最大值。

1.3 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行正交試驗設計，所有數據均平行測定3次取平均值；采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析，Tukey檢驗，P<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 平衡時間 由圖1可知，當平衡時間≤20 min時，揮發性物質的峰面積無顯著變化，但在15 min時達最大值；揮發性組分峰個數先略有增加后明顯減少，5 min時峰個數最多。通過綜合評分計算，當平衡時間為5 min時，揮發性風味物質達到相對平衡狀態，有利于萃取頭吸附。分子在空氣中比在其他介質中擴散快，頂空萃取時很容易達到平衡狀態，隨著平衡時間的延長，萃取頭趨于飽和，會影響其萃取吸附效果，甚至解吸附。故選擇5 min 為最佳平衡時間。

2.1.2 NaCl添加量 由圖2可知，隨著NaCl添加量的增加，揮發性成分的峰面積先顯著增大后顯著減小，當NaCl添加量為20%時達最大值；揮發性組分的峰個數先下降后上升再顯著減少，當NaCl添加量為20%時達最高值。適量的鹽離子可增加待測組分的離子強度，提高HS-SPME分析法的靈敏度，但若NaCl添加過量，一些揮發性組分的擴散速度可能會因此降低，進而影響基質分子基團之間的相互作用[9]。故最佳NaCl添加量為20%。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 平衡時間對小龍蝦水煮液中揮發性風味成分萃取效果的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 NaCl添加量對小龍蝦水煮液中揮發性風味成分萃取效果的影響

2.1.3 萃取時間 由圖3可知，當萃取時間為20～60 min 時，揮發性成分的峰面積先明顯增大后減小，在40 min時達最大值；揮發性組分的峰個數先顯著增加后略有減少，在40 min時達最高值。當萃取時間為40 min時，揮發性物質到達平衡狀態，萃取頭處于飽和。若萃取時間過長，已經被吸附的組分可能出現解吸附現象，反而會降低萃取效果[11]。綜上，40 min為最佳萃取時間。

2.1.4 萃取溫度 由圖4可知，當萃取溫度為65～85 ℃時，隨著萃取溫度的升高，揮發性成分的峰面積先顯著增大后無明顯變化，在75 ℃時達最大值；揮發性組分的峰個數先明顯增多后顯著減少，在75 ℃時達最高值。當萃取溫度為75 ℃時，一個相對高的溫度下，能夠加快揮發性組分的運動速率，促進揮發性成分被萃取頭富集和吸附，水煮液中絕大部分揮發性物質揮發出來并被吸附，才能達到最佳的萃取效果。萃取溫度過高，低沸點組分可能因與高沸點組分的競爭吸附處于劣勢而損失，此外，高溫還能使部分揮發性化合物發生變性或裂解[11]。綜上，75 ℃是一個相對穩定的萃取溫度。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 萃取時間對小龍蝦水煮液中揮發性風味成分萃取效果的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 萃取溫度對小龍蝦水煮液中揮發性風味成分萃取效果的影響

2.2 正交試驗

結合單因素試驗結果，選取平衡時間、NaCl添加量、萃取時間和萃取溫度為試驗因素，采用正交試驗設計對小龍蝦加工水煮液中揮發性風味物質萃取條件進行優化，試驗因素水平表見表1，試驗設計及結果見表2，方差顯著性分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal design factor level

表2 L9(34)正交試驗結果Table 2 L9(34) orthogonal experimental design results

由表3可知，各因素對揮發性風味物質的綜合評分影響大小為A(平衡時間)>D(萃取溫度)>C(萃取時間)>B(NaCl添加量)。最佳萃取條件為A1B3C3D2，即平衡時間0 min、NaCl添加量30%、萃取時間50 min、萃取溫度75 ℃，此時綜合得分為95.47，與預測值相對誤差為4.53%。采用方差分析和顯著性檢驗(F檢驗)進一步分析[12]，各因素的F值均未超過臨界值F0.05(4.46)，即在5%的置信區間內，各因素的交互作用無顯著影響，F值檢驗靈敏度相對較低，可能是由誤差自由度較小導致的。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Significant analysis of variance

2.3 小龍蝦水煮液中揮發性風味物質分析

小龍蝦水煮液中揮發性風味物質的總離子流圖如圖5 所示，揮發性風味物質成分及相對含量見表4。

圖5 HS-SPME萃取小龍蝦水煮液揮發性風味物質GC-MS總離子流圖Figure 5 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor compounds extracted from crayfishboiled liquid by HS-SPME

2.3.1 醛類和芳香族化合物 由表4可知，小龍蝦水煮液中共檢出12種醛類化合物，其相對含量占總揮發性風味成分的33.78%，芳香族化合物5種，占37.34%。其中苯甲醛和己醛的相對含量最高，分別達13.47%，12.05%，呈杏仁香、堅果香、水果香以及油脂、青草味[15-16]，是小龍蝦加工水煮液中重要的風味貢獻物質。其他有風味貢獻的醛類及芳香族化合物依次是苯乙醛(8.31%)、庚醛(6.39%)、壬醛(3.31%)、辛醛(1.69%)、癸醛(1.37%)、戊醛(0.71%)、反-2-壬烯醛(0.58%)、2-甲基2-辛烯醛(0.33%)和(E)-2-癸烯醛(0.24%)，基本呈油脂香和果香，是小龍蝦水煮液中主要的風味成分。水煮液中檢出的芳香族化合物的相對含量最高，近40%，主要呈清香、果香和木香，對豐富小龍蝦水煮液的風味起重要作用。

表4 小龍蝦水煮液中揮發性風味成分?Table 4 Volatile flavor components in crayfish boiled liquid

2.3.2 醇類和雜環化合物 水煮液中檢出醇類化合物5種，占10.96%，其中5-甲基-2-(1-甲基乙基)-環己醇的相對含量最高(4.79%)，其次是2-乙基己醇(2.04%)，且呈脂香、玫瑰香味[15-16]。對小龍蝦水煮液風味貢獻的其他醇類成分較少，而烯、酮、酚類等雜環化合物有5種，占11.01%。其中，(E)-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮也稱丙酮香葉酯，具有清香、果香、木香[14]。醇類和雜環化合物對小龍蝦水煮液的風味有一定的貢獻作用。

2.3.3 烴類和酯類化合物 烴類物質一般無特殊香味，主要是由脂肪酸烷氧自由基均裂產生，一般會有所謂的烷烴氣味[18]。水煮液中共檢出烷烴類化合物5種，占3.34%。其中十二烷的相對含量最高(1.15%)，其次是十三烷(0.83%)。烴類物質是肉類風味組分中雜環化合物的重要中間體，但其對小龍蝦水煮液風味的貢獻作用較小。而酯類化合物主要由酸和醇之間發生的酯化反應生成[19]。小龍蝦水煮液中僅檢出2種酯類化合物，即鄰苯二甲酸丁基環己酯和乙酸乙酯，其相對含量為3.57%。雖然酯類種類和含量較少，但一些雜環化合物也可以歸為酯類，如丙酮香葉酯，其主要提供水果香、花香等氣味[20]。在小龍蝦水煮液整體風味成分中，酯類化合物能起到微妙的作用。

HS-SPME有利于提取易揮發性化合物，如短鏈脂肪酸或醇類[21]，且出峰快。小龍蝦水煮液中揮發性風味物質共檢出34種，包括醇類5種(10.96%)、醛類12種(33.78%)、烷烴類5種(3.34%)、芳香族化合物5種(37.34%)、雜環化合物5種(11.01%)、酯類2種(3.57%)。而同時蒸餾萃取法(SDE)容易提取揮發性和半揮發性風味成分，出峰相對較慢。采用SDE-GC-MS技術從小龍蝦水煮液中共檢出73種揮發性風味物質，包括烷烴類28種(47.77%)、酯類12種(43.40%)、醛類9種(8.94%)、芳香族6種(7.31%)、醇類5種(7.28%)、酸類4種(14.09%)[1]。因此，可以認為醛類、芳香族類和酯類為小龍蝦水煮液中主要的揮發性風味物質。SDE法萃取時間較長，但能萃取到更多的揮發性化合物，適合對高沸點、低揮發性物質的分離；HS-SPME法出峰少，但快速簡便、更接近真實揮發風味，適合檢測易揮發性的化合物[22]。

3 結論

通過HS-SPME-GC-MS結合正交試驗優化小龍蝦加工副產物水煮液中揮發性風味物質的萃取條件。結果表明，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭老化后，不需要平衡，最優萃取工藝條件為NaCl添加量30%，萃取時間40 min、萃取溫度75 ℃，此條件下小龍蝦加工水煮液中揮發性風味物質共檢出34種，其中醛類和芳香族化合物的相對含量較高，其次為醇類和雜環化合物，烷烴類和酯類化合物的相對含量較少。HS-SPME法萃取小龍蝦加工水煮液中揮發性風味成分的方法簡便快捷，但在相同檢測方法下分析出的揮發性風味成分相對較少，后續可以結合SDE法萃取小龍蝦加工水煮液中的揮發性風味物質。