延黃牛脂制備高純度1，3-甘油二酯工藝

曲可心

高青山1,2

姚輝耀1

劉龍龍1

張 華1,2

李鉉軍1

(1. 延邊大學農學院，吉林 延吉 133002; 2. 延邊大學東北寒區肉牛科技創新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133002)

延邊黃牛因其適應能力強、產肉率高且肉質鮮美多汁等備受歡迎，是目前中國較好的肉牛培育品種之一[1]。其宰前重量為500 kg時，含牛脂約25～50 kg，占體重的5%～10%。延黃牛脂是由健康牛新鮮、干凈和完整的脂肪組織提煉而成，精煉后的牛脂呈類白色或淺黃色，因其風味特殊可用于火鍋底料、烘焙制品、調味品等各類食品加工中[2-3]。

現代火鍋以川渝火鍋為代表，其底料油大多采用牛油(甘油三酯)，然而牛油因飽和脂肪酸及膽固醇含量較高，過多食用會損害人體健康[4]。而結構酯是通過改變甘油三酯中脂肪酸的種類及位置得到的人工合成脂質，可以實現特定的理化性質與生理作用。研究[5]表明，1,3-甘油二酯(sn-1,3-DAG)因其消化途徑與甘油三酯不同，具有減少脂肪累積、抑制體重增加、預防高血脂的作用。sn-1,3-DAG作為火鍋底料油替代品將在一定程度上具有預防及緩解肥胖癥、心血管疾病、脂肪肝等疾病的作用。

1,3-甘油二酯的制備方法根據催化劑不同可分為酶法和化學法；根據工藝步驟可分為一步法和兩步法等[6]。與化學法不同，酶法催化制備的sn-1,3-DAG具有無環境污染、生產得率高、產品色澤良好等優點。為獲得高純度的甘油二酯，需對制備后得到的產物進行純化分離，目前純化甘油酯的方法主要有超臨界CO2萃取法、溶劑結晶分離法、分子蒸餾法和柱層析法等[7-8]。而測定sn-1,3-DAG含量的最新方法為核磁共振法(1H-NMR)，該方法消耗樣品少，且無需分離復雜的混合物，還具有同時測定樣品中多種成分含量的優點[9]。孟祥河等[10]以香榧籽油為原料，采用乙醇鈉催化富集金松酸(SCA)并用于酯交換反應生產1,3-甘油二酯，其中Lipozyme RM IM的位置選擇性較佳，1,3-DAG產率最高。Vazquez等[11]證明了以甘油和混合脂肪酸為原料，脂肪酶RM IM為催化劑，在酶添加量為5%，50 ℃反應4 h的條件下，無溶劑體系中DAG產率達84.0%。郭婷婷等[12]采用分子蒸餾技術對花生油甘油二酯產物進行分離，其產品純度為85%，得率為18.54%。

目前，以天然延黃牛脂為原料，經脂肪酶的醇解酯交換反應生產富含sn-1,3-DAG的火鍋底料油替代品的研究尚未見報道。試驗擬以延黃牛脂為原料，利用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM在無溶劑體系中催化發生酯交換反應，運用1H-NMR法測定反應產物，分析脂肪酶添加量、底物摩爾比、反應溫度、反應時間對sn-1,3-DAG含量變化及甘油酯得率的影響，并運用弗羅里硅土吸附法進行提純，旨在為延黃牛脂制備新型火鍋底料油的開發和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

延邊黃牛牛脂：實驗室自制；

氫氧化鉀、無水硫酸鈉、丙三醇、無水乙醇、正己烷：天津市科密歐化學試劑有限公司；

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM：酶活力250 IUN/g，諾維信(中國)生物技術有限公司；

氘代氯仿-d(D，99.8%)、四甲基硅烷(TMS，體積分數0.03%)、弗羅里硅土(F196373)：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

往復式恒溫震蕩水浴培養搖床：SPF-110X12型，上海世平實驗設備有限公司；

電子分析天平：FA-1004型，上海良平儀器儀表有限公司；

低速多管架自動平衡離心機：TDZ5-MS型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

旋轉蒸發儀：R201D型，上海一科儀器有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：IT-09B15型，上海一恒科學儀器有限公司；

核磁共振波譜儀：Bruker AVANCE III 500MHz型，德國Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 延黃牛脂提取 延邊黃牛脂肪切割成小塊，并將適量水同入鍋中，加熱熬制2 h，撈出懸浮于表層的油于燒杯中，按V油∶V正己烷為1∶1加入正己烷，加入無水硫酸鈉進行抽濾，使用旋轉蒸發儀去除溶劑，獲取純凈牛脂[13]。

1.2.2 延黃牛脂脂肪酸乙酯的制備 稱取50 g延黃牛脂于250 mL三頸燒瓶，65 ℃水浴預熱，加入氫氧化鉀—乙醇溶液(氫氧化鉀質量為牛脂的1%，n無水乙醇∶n牛脂為6∶1)，磁力攪拌下回流1 h。將燒瓶中的混合液置于分液漏斗中，加入適量正己烷，用熱水進行洗滌(重復多次至徹底洗凈)。使用無水硫酸鈉除去上層有機相殘留水分，運用旋轉蒸發儀除去有機相中剩余乙醇和正己烷，得牛油脂肪酸乙酯[14-15]。

1.2.3 薄層色譜條件 以油酸乙酯標準品為標樣，將樣品與正己烷[V樣品∶V正己烷為20∶10 (μL/mL)]混勻備用。以V石油醚∶V乙醚∶V冰乙酸為90∶10∶1為展開劑，充分混勻后倒入展開缸中，密封備用。向顯色層析缸中加入一層海砂和5～6粒固體碘，密封0.5 h使碘充分飽和，備用。用毛細管在硅膠板上距離底邊1.5 cm處點樣。當樣點上的溶劑充分揮干后，將硅膠板置于展開缸中，使展開劑從板的一端向另一端進行浸潤展開，待其距板上端1 cm 處停止展開，干燥后，將硅膠板置于碘缸中顯色[16]。

1.2.4 酶促酯交換反應合成1,3-DAG 稱取5 g牛油脂肪酸乙酯于50 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的甘油混勻，恒溫水浴搖床(80 r/min)中預熱，加入一定量的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM開始酯化反應并計時。分別考察底物摩爾比(n脂肪酸乙酯∶n甘油分別為1.0∶1.0，1.5∶1.0，2.0∶1.0，2.5∶1.0，3.0∶1.0)、酶添加量(1%，3%，5%，7%，9%)、反應時間(2，4，6，8，10 h)和反應溫度(35，40，45，50，55 ℃)對甘油二酯含量的影響。離心后對上層清液進行1H-NMR檢測，并按式(1)計算反應產物得率。

圖1 牛油脂肪酸乙酯薄層色譜圖Figure 1 Thin layer chromatography of fatty acidethyl ester in butter

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量5%，反應時間6 h，反應溫度50 ℃；同一指標字母不同表示差異顯著(P<0.5)

(1)

式中：

c——反應產物得率，%；

m1——上層清液質量，g；

m2——反應物質量，g。

1.2.5 弗洛里硅土法純化 取適量m弗羅里硅土∶m混合酯為5∶1的弗羅里硅土和混合酯于150 mL磨口三角瓶，吸附25 min。加入50 mL分析純正己烷，100 r/min攪拌10 min，過濾，反復洗脫9次，收集甘油三酯洗脫液，并同時點板確認有無甘油二酯出現，旋轉蒸發除去正己烷，得甘油三酯。向磨口燒瓶中加入60 mL正己烷—乙醚溶液(V正己烷∶V乙醚為16∶1)，100 r/min攪拌10 min，洗脫，重復3次，過濾除去甘油二酯和甘油三酯混合物。向磨口燒瓶中加入50 mL分析純乙醚，100 r/min攪拌10 min，反復洗脫3次。收集洗脫溶劑，利用旋轉蒸發儀去除乙醚，采用1H-NMR分析最終產物甘油二酯純度。

1.2.6 運用氫譜(1H-NMR)測定官能團

(1) 樣品制備：準確稱量反應產物溶于1 mL氘代氯仿中，以TMS為內標，混合搖晃至完全溶解，過0.45 mm有機相濾膜，轉移至5 mm核磁管中，制成待測樣品，備用。

(2) 1,3-DAG定量：待測樣品中酯交換產物含量以內標TMS計算而來，其計算式為：

(2)

式中：

W1,3-DAG——產物中1,3-DAG摩爾含量，%；

As——試樣特征峰峰面積。

(3) 脂肪酸定量：參照María等[17]的方法測定油脂中油基(O)、亞油基(L)、亞麻基(Ln)和飽和酰基(S)比例，并根據延黃牛脂分析1H-NMR官能團。

1.2.7 數據分析 所有試驗數據均以均值表示，平行3次。采用SPSS 25.0軟件進行數據分析，P<0.05判定為統計學顯著。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜分析

實驗室自制牛油提取率為82%。由圖1可知，延黃牛脂經乙酯化后得到的牛油脂肪酸乙酯薄層層析展開情況良好，斑點分離度高。牛油脂肪酸乙酯中存在與油酸乙酯標準品基本一致的斑點，說明牛油脂肪酸乙酯純度較高，可以進行后續甘油二酯制備試驗。經計算，延黃牛脂、牛油脂肪酸乙酯、油酸乙酯(標品)的Rf值分別為0.309，0.713，0.738。

2.2 單因素試驗

2.2.1 底物摩爾比 由圖2可知，不同底物摩爾比下，1,3-DAG和甘油三酯(TAG)摩爾含量無顯著性差異(P≥0.05)，但反應產物得率從54%逐漸升高至67%。從理論上看，任何一種底物摩爾數的改變都會影響體系的穩定性及產物的擴散速率與含量，當n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1時，1,3-DAG的摩爾含量達最佳，因為甘油二酯是由2分子的脂肪酸乙酯與1分子的甘油組成。脂肪酸乙酯含量過多，則利用底物的程度降低，同時導致純化過程復雜，耗時過長；甘油含量過多，則體系的極性大，甘油與脂肪酶將更易沉積于底部，因此與脂肪酸乙酯混合不充分，降低反應速率[18]。故選擇反應底物摩爾比(n脂肪酸乙酯∶n甘油)為2∶1。

2.2.2 酶添加量 由圖3可知，隨著酶添加量的增加，1,3-DAG和甘油三酯的摩爾含量無顯著性差異，甘油酯得率從77%下降至47%。酶催化酯交換反應過程中會生成過多水，當水分含量超過一定量后，脂肪酶的酯化活力大大降低，表現出較高的水解活力。酶維持活性中心構象需保持一定的柔性，而適量的水分活度正是維持這種柔性的需要[19]。孟祥何等[9]研究發現，當加酶量為5%，底物摩爾比(n乙酯∶n甘油)為2∶1時，1,3-甘油二酯產率達55.5%。當固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量為1%時，甘油二酯產率達77%，大幅度降低了生產成本。

2.2.3 反應溫度 由圖4可知，隨著反應溫度的升高，1,3-DAG、甘油三酯的摩爾含量及得率均無顯著變化。而適宜的溫度控制是酶促反應的關鍵，升高反應溫度有利于去除酯交換反應副產物中的水，一定程度上加快反應速率，同時物質在反應體系中的溶解度會有較大提高，體系黏度低，傳質速率快，因此反應速度快。溫度過高，則會導致大部分酶被破壞，發生不可逆變性，從而喪失酶的催化作用[20]，因此，控制適當的反應溫度為35 ℃。

2.2.4 反應時間 由圖5可知，隨著反應時間的延長，1,3-DAG、甘油三酯的摩爾含量及得率均無顯著變化。固定化脂肪酶Lipozyme RM IM為1,3-位特異性脂肪酶，假設該酶的位置選擇性完全專一，理想狀態下反應結束時應該全部連接到甘油酯骨架的sn-1和sn-3位置上，即僅生成sn-1,3-DAG，而試驗結果顯示反應2～10 h，混合酯中均存在甘油三酯，說明發生了副反應——酰基遷移，也有研究[21]表明，通過適當控制反應時間可以在一定程度上抑制酰基遷移。綜合考慮，選擇反應時間為6 h，此時甘油酯得率為77%，顯著高于(P<0.05)反應時間為2 h的(67%)。

n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1，反應時間6 h，反應溫度50 ℃；同一指標字母不同表示差異顯著(P<0.5)

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1，反應時間6 h

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1，反應溫度35 ℃

2.3 甘油二酯純化

酯化反應過程中會產生1,3-DAG、1,2-DAG、TAG、FFA、MAG等脂肪酸產物，通過查閱文獻[22-24]及結果分析初步鑒定該反應在酯化過程中產生甘油三酯(TAG)和1,3-甘油二酯(1,3-DAG)。經弗洛里硅土法分提甘油三酯及甘油二酯，提純前后甘油二酯的核磁共振譜圖如圖6所示，提純前后，甘油三酯摩爾含量從27.50%變為9.21%，1,3-DAG摩爾含量從72.50%變為90.79%。酯化產物中甘油三酯(TAG)特征峰與1,3-甘油二酯(1,3-DAG)特征峰核磁共振氫譜譜峰歸屬見表1。反應產物中雜質微小可忽略不計，故總含量可視為甘油三酯和1,3-DAG含量之和。

表1 各特征峰的核磁共振信號分配Table 1 Nuclear magnetic resonance signal distribution of each characteristic peak

圖6 提純前、后甘油二酯的核磁共振氫譜圖

2.4 核磁共振氫譜(1H-NMR)歸屬峰及計算方法的確認

牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯核磁共振氫譜圖見圖7，各峰的歸屬見表2。對圖7及表2進行分析，分別按式(3)～式(5)計算油脂中油基(O)、亞油基(L)和飽和酰基(S)比例[25]：

表2 牛油核磁共振氫譜中各峰的歸屬Table 2 Assignment of peaks in nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of beef tallow

(3)

(4)

(5)

式中：

αD——信號峰D的面積；

αE——信號峰E的面積；

αF——信號峰F的面積。

2.5 脂肪酸組成

根據圖7的各功能團信號峰位置，按式(3)～式(5)進行計算，原料牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯的脂肪酸組成變化見表3。由表3可知，與原料牛油相比，牛油脂肪酸乙酯中亞油酸、油酸含量分別降低了8.02%，2.34%，飽和程度上升了2.85%。試驗制備的延黃牛脂甘油二酯中亞油酸、油酸含量分別升高了13.65%，6.47%，飽和度降低了7.17%。特異性脂肪酶RM IM制備甘油二酯時，不飽和脂肪酸乙酯干擾了飽和脂肪酸乙酯與甘油的結合，使甘油二酯中飽和度降低。從牛脂制備的甘油二酯的脂肪酸組成及結構特性可以看出，其能發揮亞油酸和油酸的功效，具有原油的營養特性，并且是一種可替代傳統火鍋底料油的健康油品。

圖7 牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯核磁共振氫譜圖Figure 7 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of beef tallow, fatty acid ethyl ester and diacylglycerol

表3 原料牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯的脂肪酸組成?Table 3 The fatty acid composition of beef tallow, fatty acid ethyl ester of beef tallow and diglyceride %

3 結論

利用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM成功地合成了富含1,3-甘油二酯的目標產物。在固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，底物摩爾比(n脂肪酸乙酯∶n甘油)2∶1，反應時間6 h，反應溫度50 ℃條件下，1，3-甘油二酯生成率為72.5%、甘油三酯得率為77%，且反應對1,3-甘油二酯和甘油三酯的摩爾含量無影響；經弗羅里硅土吸附法提純，目標產物中的1,3-甘油二酯摩爾含量可達90.79%，可以用于生產高純度1,3-甘油二酯；經脂肪酸組成分析牛脂制備甘油二酯不僅改變其結構特性，還能降低飽和脂肪酸含量。1,3-甘油二酯為公認安全的食品成分，其精煉過程及功能安全性測定有待進一步研究。