鄰苯二甲酸單甲酯對大鼠血液生化指標的影響及毒理研究

高旭，于霞，李信薇，池振興,3,*

1. 哈爾濱工業大學(威海)海洋科學與技術學院，威海 264209 2. 威海環境再生能源有限公司，威海 264200 3. 浙江省污染暴露與健康干預重點實驗室，杭州 310015

鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters, PAEs)能夠增加塑料制品的可塑性[1]，其在工業生產過程中常作為增塑劑被應用于醫療器械、洗滌護理產品、清潔劑、化妝品和食品包裝等各個領域[2]，與人們日常生活息息相關。相關產品在生產、使用和處置過程中，可不斷釋放PAEs到環境中[3]，污染土壤[4]、水體[5]和大氣[6]。環境中的PAEs能夠通過皮膚接觸、呼吸和進食等多種途徑進入人體[7-8]，危害機體健康。血液是人體極其重要的組織，具有攜氧、免疫、物質運輸、調節體溫及信息傳遞等多種功能。進入人體的部分PAEs會被血液吸收，并在內源性酯酶的作用下被水解代謝為相應的鄰苯二甲酸單酯(mPAEs)[9]。此外，環境中的mPAEs也能以各種方式進入生物體血液[10-12]。研究人員已經在男性血液、母血和臍帶血中檢測到了mPAEs的存在[13-14]。存在于血液中的PAEs及其代謝產物隨血液循環被輸送到全身各處，損害體內的組織和器官，引發疾病。

目前，關于PAEs及其代謝產物毒性的研究主要集中在生殖發育、神經和遺傳等方面[15-21]，涉及血液毒性及其作用機制的研究鮮有報道，且研究對象主要針對分子量較大、毒性較強的鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)及其代謝產物鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)、鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)、鄰苯二甲酸單芐酯(MBzP)。張弘等[22]的研究表明，DEHP(500 mg·kg-1)亞慢性染毒90 d會使大鼠白細胞、紅細胞數量及血紅蛋白含量顯著下降。另有研究表明，MEHP也與血液中血紅蛋白含量的下降有關[23-24]。Sicińska[25]通過體外實驗發現，DBP、BBP(25 μg·mL-1)及其代謝產物MBP、MBzP(250 μg·mL-1)會使紅細胞出現溶血現象。此外，DBP、BBP、MBP和MBzP還會增加離體紅細胞中活性氧(ROS)含量，改變其抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT))活性，使胞內高鐵血紅蛋白(MetHb)含量升高[26]。

鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate, DMP)作為一種分子量較低的PAEs已經被列入我國優先污染物黑名單[27]，其一級代謝產物鄰苯二甲酸單甲酯(monomethyl phthalate, MMP)具有急性毒性、致畸和致癌活性[28-29]。目前，DMP和MMP在人體的各種體液中均已被檢測到[30-32]。Babu-Rajendran等[33]采用氣相色譜-質譜聯用法測定了人體尿液中的PAEs，發現尿液中DMP的濃度范圍為nd～141 ng·mL-1。陳甘訥等[34]的研究表明，MMP在孕婦分娩后母血和臍血中的濃度分別為1.89～2.07 μg·L-1和2.41～2.67 μg·L-1。針對研究現狀的不足，本實驗選取MMP(DMP的代謝產物)為研究對象，以Sprague Dawley(SD)大鼠為受試動物，通過檢測血細胞(紅細胞、白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞)數量、血液生化指標(總膽固醇、尿素氮、總蛋白和堿性磷酸酶)以及氧化應激水平(抗氧化酶SOD、CAT和丙二醛(MDA))以探究MMP(50、250和500 mg·kg-1)對大鼠血液的毒性影響及作用機制，有助于完善PAEs類代謝物對血液毒性效應的研究，為其風險評價和相關疾病預防提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器設備與試劑耗材

主要儀器設備：動物版血液分析儀(HF-3800，濟南漢方醫療器械有限公司，中國)、紫外-可見分光光度計(島津UV-1700，Shimadzu，日本)、離心沉淀機(80-2，上海榮泰生化有限公司，中國)、數顯恒溫水浴鍋(HH-S，常州翔天實驗儀器廠，中國)、旋渦混合器(XH-C，金壇市白塔新寶儀器廠，中國)、電熱鼓風干燥箱(101-00A，上海路韻儀器設備有限公司，中國)。

主要試劑耗材：鄰苯二甲酸單甲酯(MMP；分析純，國藥集團化學試劑有限公司，中國)、乙酸(冰醋酸；分析純，國藥集團化學試劑有限公司，中國)、肝素鈉(heparin sodium salt；185 USP units·mg-1，上海麥克林生化科技有限公司，中國)、長壽花金胚玉米油(山東三星玉米產業科技有限公司，中國)；總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)測試盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)測試盒、丙二醛(malonicdialdehyde, MDA)測試盒、總膽固醇(total cholesterol, T-CHO)測試盒、尿素氮(BUN)測試盒、總蛋白(total protein, TP)定量試劑盒、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)。

1.2 實驗動物

本研究選用的SD大鼠購自正規畜牧中心，所有大鼠均健康。在實驗過程中，大鼠被飼養在實驗室動物房中，溫度控制在18～25 ℃，相對濕度控制在(55±5)%，接受正常光照，可自由獲取標準動物飼料和經過濾的自來水。按照本地法規進行動物實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 SD大鼠染毒及采血

設置3個不同劑量的染毒組(低劑量50 mg·kg-1、中劑量250 mg·kg-1、高劑量500 mg·kg-1)和對照組，每組選用3只SD大鼠，按照體質量計算出每只大鼠灌胃所需MMP質量，用玉米油配成1.5 mL染毒液，對大鼠灌胃染毒。對照組灌胃等量的1.5 mL玉米油。

染毒結束后，用固定器將SD大鼠固定，在鼠尾中下部涂抹75%酒精消毒，用5.5號靜脈輸液針扎入靜脈采集所需血液。

1.3.2 血細胞檢測

將SD大鼠灌胃染毒3 h后，從尾部采集血液至EDTA-K2抗凝管中，使用HF-3800動物版血液分析儀的全血模式檢測血液中紅細胞、白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的數量，記錄檢測結果。

1.3.3 血液生化指標檢測

對SD大鼠灌胃染毒24 h(禁食12 h)和連續染毒7 d(每天同一時間灌胃染毒)后，從大鼠尾部取全血于離心管中，以3 000 r·min-1將血樣離心15 min，取上層血清用于檢測血液中總膽固醇、總蛋白的含量及酸性磷酸酶的活性。從大鼠尾部采取染毒24 h和連續染毒7 d后的全血于肝素抗凝離心管中，在3 000 r·min-1條件下離心15 min，取上層血漿用于檢測血液中的尿素氮含量。根據總膽固醇、尿素氮、總蛋白和酸性磷酸酶試劑盒說明書上的操作步驟，使用紫外-可見分光光度計檢測。

1.3.4 血液氧化應激水平檢測

對SD大鼠灌胃染毒3 h后，從尾部取全血于離心管中。將血樣以3 000 r·min-1離心15 min，取上層血清用于檢測血液中SOD、CAT活性和MDA含量。根據SOD、CAT和MDA試劑盒說明書上的操作步驟，使用紫外-可見分光光度計檢測。

1.4 數據分析

用Origin 2018和SPSS 25.0軟件計算平均值和標準差，對各組紅細胞、白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等血細胞數量，總膽固醇、尿素氮、總蛋白的含量和酸性磷酸酶活性等血液生化指標，以及SOD、CAT的活性和MDA含量等氧化應激指標之間的差異性進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齊性采用LSD檢驗，并繪制柱狀圖。

2 結果(Results)

2.1 MMP對SD大鼠血液中血細胞數量的影響

染毒3 h后，MMP對大鼠血液中紅細胞、白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的毒性影響如表1所示。統計分析表明，隨著MMP劑量的增加，SD大鼠血液中紅細胞、白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量總體上均呈現下降趨勢。低、中、高劑量染毒組紅細胞數量與對照組相比分別下降1.11%、4.7%和9.13%，但均無顯著差異(P>0.05)。淋巴細胞和中性粒細胞數量呈現低劑量興奮效應[35]，高劑量組白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量與對照組相比分別下降43.57%、30.7%和26.44%，均有顯著性差異(P<0.05)。這表明，MMP會導致大鼠血液中的血細胞數量出現不同程度的降低。

表1 不同劑量鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)染毒3 h后對SD大鼠血液中血細胞數量的影響Table 1 The number of blood cells of SD rats after monomethyl phthalate (MMP) exposure for 3 h

2.2 MMP對SD大鼠血液生化指標的影響

染毒24 h和連續染毒7 d后，MMP對大鼠血液總膽固醇、尿素氮、總蛋白含量和酸性磷酸酶活性的影響如圖1所示。

圖1 不同染毒時間下MMP對SD大鼠血液生化指標的影響注：T-CHO表示總膽固醇，BUN表示尿素氮，TP表示總蛋白，ACP表示酸性磷酸酶；*表示染毒組與對照組有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 Blood biochemical indexes of SD rats after MMP exposure for different timeNote: T-CHO stands for total cholesterol, BUN stands for blood urea nitrogen, TP stands for total protein, and ACP stands for acid phosphatase; * indicates significant difference from the control (P<0.05).

隨著MMP劑量增大，大鼠血液中總膽固醇含量均呈現出下降趨勢，且連續染毒7 d后下降得更快(圖1(a))。染毒24 h后，低、中、高劑量組總膽固醇含量分別下降17.47%、31%和36.67%，與對照組相比均差異顯著(P<0.05)。連續染毒7 d后，與對照組相比，低、中、高劑量組總膽固醇含量分別下降22.97%、37.4%和43.97%，均有顯著差異(P<0.05)。連續染毒7 d后，各劑量組總膽固醇含量均比染毒24 h后低，且500 mg·kg-1劑量下總膽固醇含量為最低。這表明，攝入MMP的時間越久、劑量越大總膽固醇含量降低越快，對血液損害越大。

MMP均會導致血液中尿素氮含量減少，且總體呈現下降趨勢(圖1(b))。其中，染毒24 h后，低、中、高劑量組尿素氮含量和對照組相比差異均顯著(P<0.05)，分別下降15.97%、26.43%和34.33%。連續染毒7 d后，尿素氮含量呈現低劑量興奮效應，中、高劑量MMP使尿素氮含量較對照組分別下降22.13%和28%，差異顯著(P<0.05)。這表明，短時間攝入不同劑量MMP均會使大鼠血液尿素氮含量減少；而長時間攝入低劑量MMP時，大鼠血液尿素氮含量會升高；MMP劑量增大后，血液中尿素氮含量會減少。

血液中總蛋白含量均隨著MMP劑量增加而減少，呈下降趨勢，但連續染毒7 d后下降趨勢較慢(圖1(c))。其中，高劑量MMP染毒24 h和連續染毒7 d后，總蛋白含量分別減少18.25%和26.35%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；連續染毒7 d后高劑量組的總蛋白含量最低。這表明，長時間高劑量攝入MMP會使大鼠血液總蛋白含量大幅降低。

MMP能使大鼠血液中酸性磷酸酶活性下降(圖1(d))。其中，染毒24 h后，血液中酸性磷酸酶活性隨著MMP染毒劑量的增加而下降，低、中、高劑量組較對照組分別顯著下降10.63%、19.93%和41.37%(P<0.05)。連續染毒7 d后，低劑量組酸性磷酸酶活性與對照組相比顯著上升27.4%(P<0.05)，呈現低劑量興奮效應；中、高劑量MMP分別使酸性磷酸酶活性顯著下降21.87%和31.43%(P<0.05)。這表明，無論短時間還是長時間，攝入MMP劑量越大，大鼠血液中酸性磷酸酶活性越低。

2.3 MMP染毒后SD大鼠血液氧化應激水平

不同劑量MMP染毒3 h后，大鼠血液中SOD、CAT相對活性及MDA相對含量如圖2所示。

隨著MMP劑量增加，SOD活性呈下降趨勢(圖2(a))。與對照組相比，低、中、高劑量MMP使SOD活性分別下降3.6%、11.7%和17.5%(P>0.05)。這表明，MMP能夠抑制SOD活性，但影響較小。

各劑量MMP對大鼠染毒3 h后，血液中CAT活性均低于對照組，且隨著MMP劑量的增加呈現下降趨勢(圖2(b))。低、中、高劑量染毒組CAT活性與對照組相比分別下降19.57%、24.13%和57.68%(P<0.05)。這表明，MMP會使CAT活性下降，損害血液的抗氧化防御體系。

圖2 不同劑量MMP染毒3 h后大鼠血液氧化應激水平注：SOD表示超氧化物歧化酶，CAT表示過氧化氫酶，MDA表示丙二醛；*表示染毒組與對照組有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Oxidative stress level in the blood of SD rats after MMP exposure for 3 h Note: SOD stands for superoxide dismutase, CAT stands for catalase, and MDA stands for malonic dialdehyde; *indicates significant difference from the control (P<0.05).

不同劑量染毒組MDA含量均高于對照組，且均有顯著差異(P<0.05) (圖2(c))。與對照組相比，低、中、高劑量組MDA含量分別升高70.43%、59%和34.8%。這表明，MMP進入機體后能夠誘導血液發生氧化應激反應，引起血液MDA含量升高。

3 討論(Discussion)

3.1 MMP對SD大鼠血液功能的影響

血液是機體重要的組織，由血細胞和血漿組成，具有攜氧、免疫等功能。血細胞包括紅細胞、白細胞和血小板。大量研究證實，紅細胞的主要功能是運輸氧氣和二氧化碳[36-37]，同時還具有免疫功能，參與免疫應答調節[38-39]。白細胞是血液中執行免疫功能最主要的細胞[40]，其能夠通過吞噬細菌等途徑來抵御和殺死入侵的病原體[41]，對機體防御系統的建立有重要意義。淋巴細胞和中性粒細胞均屬于白細胞，分別在機體特異性和非特異性免疫功能方面發揮重要作用[41-43]。

已有研究表明，PAEs會造成血細胞數目下降，影響機體的免疫功能[44]，但對其代謝物的影響仍不明確。本研究結果顯示，MMP(DMP的代謝產物)會對血液中紅細胞、白細胞、淋巴細胞及中性粒細胞造成不同程度的損傷，使其數目下降；且隨著MMP劑量的增大，細胞數目下降愈發明顯(表1)。這表明，作為PAEs類代謝物MMP也會使血液中的血細胞數量減少，進而造成血液的攜氧和免疫等功能下降。

臨床上，紅細胞、白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞也常作為診斷病理變化的重要依據。紅細胞數量下降意味著機體可能出現貧血、白血病等疾??；白細胞數目減少代表機體的造血功能出現障礙；淋巴細胞數目偏低會導致機體免疫缺陷；中性粒細胞數量減少表明機體受到化學損傷，出現骨髓造血異常等疾病。由此推測，MMP會影響血液的攜氧和免疫等功能，進而可能會引發機體出現貧血、免疫缺陷及骨髓造血功能障礙等疾病。

3.2 MMP對SD大鼠血脂代謝、腎、肝功能的影響

總膽固醇是反映機體內脂肪代謝水平的一項重要指標[45]，其含量過多過少都會對機體產生危害。Zhu等[46]研究發現PAEs類代謝物會使膽固醇含量下降。本研究也得到了相似的結果，無論短時間還是長時間攝入MMP，機體血液總膽固醇含量均呈現下降趨勢(圖1(a))。這表明，MMP會影響血液中脂質的新陳代謝水平。

尿素氮是蛋白質代謝的終末產物，其常作為機體腎功能評價的重要指標[47]。在正常情況下，尿素氮會被腎小球濾過排出體外，若其含量偏低則代表著腎功能失調，含量偏高則意味著過濾功能可能失效，造成器質性腎功能損害。本研究中，機體攝入MMP后，血液中尿素氮含量下降(圖1(b))。這表明，MMP會影響機體腎功能，導致其功能失調。

總蛋白含量能夠反映肝臟的合成功能以及儲備能力[48]。酸性磷酸酶也是描述機體肝功能的一個重要指標[49]。本研究發現，MMP會使血液中總蛋白含量以及酸性磷酸酶活性下降(圖1(c)、圖1(d))?？偟鞍缀肯陆悼赡苁且驗闄C體攝入MMP后使肝細胞受損，肝臟合成功能出現障礙，最終導致其合成蛋白質減少。由于PAEs類代謝物具有親脂性容易滲入膜脂質[50]，因此推測酸性磷酸酶活性下降可能是因為MMP與溶酶體膜相互作用，抑制了酸性磷酸酶的釋放，也可能因為MMP妨礙了溶酶體和質膜的融合，阻止酸性磷酸酶分泌到胞外而導致其活性下降[51]?？偟鞍缀亢退嵝粤姿崦富钚韵陆稻从吵鯩MP對肝功能有一定影響。由于肝臟是膽固醇和尿素氮合成的主要場所，因此推測兩者含量的下降也可能是肝功能受損造成的[52-53]。

綜上所述，機體攝入MMP后，會導致血脂代謝能力以及腎、肝功能受損。臨床上，總膽固醇含量偏低意味著機體可能出現肝硬化、貧血等疾病。尿素氮含量減少表明機體腎功能出現障礙且可能有嚴重的肝臟疾病?？偟鞍缀科痛頇C體可能患有腎炎、肝炎和肝硬化等疾病。酸性磷酸酶活性下降代表機體可能患有貧血、腎炎等疾病。本研究中，4個指標相互印證，且與3.1推測相吻合，因此MMP可能會誘導機體出現貧血、腎炎、腎功能障礙、肝炎和肝硬化等疾病。

3.3 MMP對SD大鼠血液抗氧化能力的影響

氧化應激(oxidative stress, OS)是指機體氧化與抗氧化平衡被破壞，生成過多的氧自由基而無法被清除，從而對機體產生的一種負面作用[54]。由于氧自由基可以直接或間接氧化DNA、脂質和蛋白質，誘發基因突變、脂質過氧化以及蛋白質變性，因此氧化應激通常被認為是污染物對機體產生毒性的作用機制之一[55]。已有研究表明，苯、四氯化碳及重金屬鉛、鑭、鈦等污染物能夠通過氧化應激引起機體造血、腎、肝功能受損，進而誘發貧血、造血功能障礙、腎炎、腎功能失調以及肝炎、肝硬化等疾病[56-60]。因此，筆者從氧化應激的角度探究MMP對大鼠血液、腎、肝損傷的可能作用機制。

SOD和CAT作為機體抗氧化酶系極其重要的組成部分，其存在可以減輕氧化應激產生的損傷[61]。其中，SOD能夠催化超氧陰離子進行歧化反應[62]，清除有害的超氧化物自由基；CAT能夠催化過氧化氫將其迅速轉化為無害或毒性較小的物質[63]，防止過氧化氫過多積累對機體造成損傷。本研究發現，機體攝入MMP后會使血液中SOD和CAT活性下降，且隨著MMP劑量的增加，SOD和CAT活性呈現出下降趨勢(圖2(a)、圖2(b))。這表明，MMP能夠抑制血液中抗氧化酶SOD和CAT的活性，進而損害血液的抗氧化系統。

MDA作為脂質過氧化物的產物，其含量的多少可以反映出機體氧化損傷的程度[64]。本研究發現，各劑量MMP染毒組的MDA含量均高于對照組(圖2(c))。這表明，機體攝入MMP后導致血液抗氧化防御體系受損，清除自由基的能力下降，引起氧化應激反應，對血液造成損傷。Holland等[65]研究發現婦女妊娠期尿液中的某些PAEs類代謝物會引起8-異丙醇烷(脂質過氧化的生物標志物)水平升高，使機體發生抗氧化損傷及氧化應激反應。本研究結果與之相符。

綜上所述，MMP作為PAEs類代謝物的一種，會使血液的抗氧化能力下降，誘發氧化應激反應，從而對血液中血細胞以及血液生化指標產生影響，損害血液的攜氧、免疫等功能；血脂的代謝能力以及機體的腎、肝功能，推測MMP進而可能引發機體發生貧血、造血功能障礙、腎功能失調以及肝硬化等相關疾病。本研究有助于明確鄰苯二甲酸酯類代謝物對血液的毒性效應，并為其潛在的風險評估和相關疾病的預防提供一定的理論指導。