基于液質聯用技術的壇紫菜甘油-3-磷酸脅迫響應分析

唐欣怡 趙佳麗 陳娟娟,* 駱其君 陳海敏 楊 銳 張 鵬

(1 寧波大學，農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室, 浙江 寧波 315211；2 浙江省海洋水產養殖研究所, 浙江 溫州 325005)

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)是中國東南部具有經濟價值的大型藻類之一，有很高的食用和藥用價值。壇紫菜不僅是一類富含多種維生素和微量元素的海洋蔬菜，還富含可作為化工原料的藻膠等多種生理活性物質[1-3]。壇紫菜生長在環境條件變化多端的潮間帶，溫度、鹽度和光照強度急劇變化，隨著潮水的漲落每天經歷周期性的干出與浸沒交替過程[4]。因此，為了適應復雜多變的環境，壇紫菜進化出一系列的抗逆防御方式。

研究證實甘油-3-磷酸是植物防御信號轉導途徑中的一個新的調控因子或信號分子[5-6]，是糖代謝和卡爾文循環代謝的重要中間物[7-8]。夏菲[9]發現甘油-3-磷酸參與了擬南芥非生物脅迫響應，通過自身主動調節甘油-3-磷酸合成水平，經一系列酶作用轉化成甘油-3-磷酸，增強擬南芥對鹽及干旱的耐受性。此外，Qian等[10]發現壇紫菜在干出脅迫后，藻體內紅藻糖苷含量顯著升高，以保護細胞免受脫水損傷的影響，同時其前體物質甘油-3-磷酸合成相關的甘油激酶(NHO1)和3-磷酸甘油脫氫酶(GPDH)基因表達上調，表明甘油-3-磷酸可能參與了防御反應。這一現象在壇紫菜經鞭毛蛋白肽flg22和35℃高溫刺激試驗中得到了證實，即甘油-3-磷酸的含量在脅迫中顯著升高，參與了防御響應。由此可知，甘油-3-磷酸作為紅藻糖苷的合成前體，在處于復雜環境的壇紫菜抗逆機制中發揮著重要作用[11-13]。

目前甘油-3-磷酸的下游物質紅藻糖苷的抗逆作用已有較多研究[14-15]，而甘油-3-磷酸的合成積累與紅藻糖苷的含量變化密切相關。因此推測，其他不同脅迫條件可能均會引起甘油-3-磷酸的響應，且甘油-3-磷酸在不同逆境下的不同響應或許是紅藻糖苷差異性響應的原因之一。然而，針對溫度、鹽度以及干出脅迫下，葉狀體內甘油-3-磷酸含量變化以及和紅藻糖苷異構體的含量變化關系還未被探討。基于此，本研究利用高效液相色譜-質譜聯用(ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，UPLC-MS)技術，建立起甘油-3-磷酸的定量方法，探究溫度、鹽度和干出脅迫條件下壇紫菜中甘油-3-磷酸的防御響應變化規律，旨在為進一步探究壇紫菜抗逆機制提供基礎試驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘油-3-磷酸標準品(純度98%)，北京翰隆達科技發展有限公司；甲醇(分析純)，上海國藥化工有限公司；甲醇和乙酸銨(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；0.22 μm孔徑有機相針式濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重串聯四極桿質譜聯用分析系統、C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，美國Waters公司；FreeZone冷凍干燥機，美國Labconco公司；Cascada II超純水系統，美國Pall公司；Precellys 24 Dual均質儀，法國Bertin公司；GXZ-380智能光照培養箱，寧波江南儀器廠；旋轉蒸發儀，浙江優納特科學儀器有限公司。

1.3 壇紫菜脅迫處理

對照組培養條件：將葉狀體置于鹽度25‰、溫度20℃、光照強度20 μmol·m-2·s-1、光暗比L∶D =12 h∶12 h的環境中培養24 h。溫度脅迫組培養條件：將100 mg濕重的葉狀體放置于鹽度為25‰的滅菌海水(自然海水煮沸)中，分別放入溫度為12、18、23、25、28℃，光照強度為20 μmol·m-2·s-1的培養箱中培養1 h，其中28℃條件下分別培養1、6、12、24、36、48、60和72 h。鹽度脅迫組培養條件：將100 mg濕重的葉狀體分別放置于鹽度為15‰、20‰、30‰、35‰、40‰、45‰、50‰、60‰、70‰、80‰的滅菌海水(使用海水晶NaCl調節鹽度)中，放入溫度為20℃、光照強度為20 μmol·m-2·s-1的培養箱中分別培養0.5、1和3 h。干出脅迫組培養條件：用濾紙輕輕吸干100 mg濕重葉狀體的表面水分，將其平鋪于滅菌培養皿中，放入溫度為20℃、光照強度為20 μmol·m-2·s-1的培養箱中分別培養1、2、3、4、5、6、8、10和12 h?；謴徒M培養條件：待溫度、鹽度及干出脅迫后，將壇紫菜置于鹽度為25‰的滅菌海水中，放入溫度為20℃、光照強度為20 μmol·m-2·s-1的培養箱內分別恢復1和3 h。

1.4 甘油-3-磷酸的提取

準確稱取濕重100 mg的壇紫菜葉狀體，置于2 mL勻漿管中，然后加入1 mL 80%甲醇與直徑為0.5 mm和3 mm的破碎珠，于均質儀中提取(5 000 r·min-1， 30 s×3，10個循環)。在完全破碎后進行離心(5 000 r·min-1， 10 min)，取上清液，利用旋轉蒸發儀去除溶劑，得到甘油-3-磷酸提取物。

1.5 UPLC-MS條件

采用C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)作為固定相；以甲醇作為有機相(A)，純水作為水相(B)，洗脫梯度為：0～2 min，10%～30%A；2～4 min，30%～50%A；4～6 min，50%～70%A；6～8 min，70%～90%A；8～10 min，90%A。流速0.4 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30℃。

采用電噴霧離子電源的負離子電離模式，毛細管電壓3 kV，錐孔電壓6V，脫溶劑氣溫度為450℃，脫溶劑氣流量為600 L·h-1，錐孔氣流量為50 L·h-1，碰撞氣采用氬氣(Ar)，碰撞氣流量0.15 mL·min-1。掃描采用多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)模式。甘油-3-磷酸離子通道和碰撞能量分別為m/z 171→m/z 96 (16 eV) 和m/z 171→m/z 78 (12 eV)。

1.6 數據分析

所有的液質數據處理、獲取和分析均由Masslynx (Waters，美國)軟件處理。差異性分析中，數據以平均值±標準差(mean ± SD，n=3)表示。利用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析，組與組之間差異P<0.05時定義為差異顯著，P<0.01時定義為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 甘油-3-磷酸的定量方法建立

準確稱取2 mg甘油-3-磷酸標準品溶解于2 mL 50%(v/v)甲醇，過0.22 μm濾膜后，得到濃度為1 mg·mL-1的甘油-3-磷酸母液。將母液稀釋至1 μg·mL-1， 采用直接進樣的方式將其注入電噴霧離子源(ESI)中，分別在正、負離子電離模式下進行一級全掃描，選擇離子響應最強的負離子檢測模式進行后續試驗。以該離子峰為母離子，施加碰撞能量進行二級質譜掃描，得到碎片離子信息，然后優化碰撞能量，當定性離子和定量離子的離子峰強度達到最大值時即為最佳碰撞能量。此外，改變色譜柱、流動相種類和梯度比例等液相色譜條件，比較分離度、保留時間和峰形確定最終色譜條件。甘油-3-磷酸的總離子流圖如圖1所示。

圖1 甘油-3-磷酸的總離子流圖Fig.1 The total ionization chromatograms of glycerol-3-phosphate

2.2 方法評估

2.2.1 線性曲線 將濃度為1 mg·mL-1的甘油-3-磷酸標準溶液分別稀釋至濃度0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μg·mL-1， 平行進樣3次，記錄峰面積與濃度，繪制標準曲線，如圖2所示。結果顯示，甘油-3-磷酸的標準曲線為y=1 674.7x+11 992，R2=0.998 5，如表1所示。

圖2 甘油-3-磷酸的標準曲線圖Fig.2 The standard curve of glycerol-3-phosphate

表1 甘油-3-磷酸的日內精密度和日間精密度Table 1 The day precision and inter-day precision of glycerol-3-phosphate

2.2.2 最低檢測限和最低定量限 將濃度為1 mg·mL-1的母液不斷稀釋后進樣。當色譜峰峰高與基線高之比即信噪比(S/N)為3和9時，對應的濃度為最低檢出限和定量限。結果顯示，當S/N=3時，最低檢測限為4 ng·mL-1；當S/N=9時，最低定量限為10 ng·mL-1， 表明本方法靈敏度較高。

2.2.3 穩定性 為了驗證儀器的穩定性，采用日間精密度和日內精密度進行穩定性檢測。結果顯示，高、中、低濃度的甘油-3-磷酸標準溶液(0.04、0.2和2 μg·mL-1)的日內精密度相對標準偏差值在1.6%～5.7%范圍內，日間精密度在4.6%～7.1%范圍內，表明本方法精密度良好。

2.2.4 回收率 為了驗證試驗過程的準確度，進行了加標回收率的計算。準確稱取100 mg新鮮壇紫菜，加入1 mg甘油-3-磷酸標準品作為加標樣品，以不添加標準溶液的100 mg壇紫菜為空白樣品，各設3個平行。然后根據試驗步驟1.4的提取方法進行甘油-3-磷酸的提取，將最終提取物溶解于1 mL 50%(v/v)甲醇，過濾膜后注入樣品瓶，上機檢測含量并計算回收率?；厥章视嬎愎饺缦滤? 加標回收率=(加標樣品測定值-空白樣品測定值)/加標量×100%。結果顯示，壇紫菜中甘油-3-磷酸的加標回收率為81.8%。

2.2.5 離子抑制率 為了考察復雜基質對甘油-3-磷酸在質譜中的離子化能力的影響，進行了離子抑制率的計算。準確稱取100 mg新鮮壇紫菜，根據1.4的方法提取甘油-3-磷酸后，溶解于1 mL 50%(v/v)甲醇。取800 μL復溶液，將其分為等體積的2份，在其中1份中加入1 mg甘油-3-磷酸作為加標樣品，以不添加標準品的復溶液為空白樣品。過濾膜后注入樣品瓶，上機檢測甘油-3-磷酸含量并計算離子抑制率。離子抑制率的計算公式如下所示：離子抑制率=[1- (加標樣品測定值-空白樣品測定值)/0.04]×100%。結果顯示，壇紫菜中甘油-3-磷酸離子抑制率為10.7%，說明基質對甘油-3-磷酸的離子抑制影響可以忽略。

綜上所述，該提取和檢測方法較全面地滿足了壇紫菜樣品中甘油-3-磷酸含量的測定要求。

2.3 脅迫條件對壇紫菜中甘油-3-磷酸含量影響

壇紫菜葉狀體經12、18、23、25和28℃ 5個不同溫度脅迫1 h后，其甘油-3-磷酸含量的變化趨勢如圖3所示。相比于最佳培養溫度20℃，18℃培養下葉狀體內甘油-3-磷酸含量無明顯變化，但是在培養溫度降至12℃時，甘油-3-磷酸含量顯著下降，為對照組的0.67倍(P<0.05)。在23、25和28℃溫度下培養，其含量分別為對照組的1.17倍、1.63倍和1.90倍(P<0.05)。隨著脅迫溫度從12℃增加至28℃，甘油-3-磷酸的含量持續增加。在不同溫度脅迫1 h后，將壇紫菜葉狀體重新置于20℃的正常培養條件進行恢復培養1 h和3 h。結果顯示，12℃刺激后的葉狀體在恢復1 h內其甘油-3-磷酸含量下降，為對照組的0.43倍(P<0.05)，但在恢復3 h后含量開始回升，但仍低于對照組水平，為對照組的0.68倍(P<0.05)。而高溫刺激后的葉狀體中甘油-3-磷酸含量在恢復培養過程中不斷下降，漸漸趨于對照組水平。

注：A：不同溫度脅迫和恢復條件下甘油-3-磷酸含量變化； B：28℃脅迫不同時間條件下甘油-3-磷酸含量變化； CK：對照組； -1 h: 脅迫1 h組；1 h: 脅迫后恢復1 h組；3 h: 脅迫后恢復3 h組；* 表示不同溫度和恢復時間下的差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: The contents of glycerol-3-phosphate under different temperature stress and recovery process. B: The contents of glycerol-3-phosphate under 28℃ for different time. CK: Control group. -1 h: Stress for 1 h. 1 h: Recovery culture for 1 h after stress. 3 h: Recovery culture for 3 h after stress.* mean significant difference at 0.05 level. The same as following.圖3 溫度脅迫后的壇紫菜葉狀體內甘油-3-磷酸的含量變化Fig.3 The contents of glycerol-3-phosphase in thallus of P. haitanensis under different temperature stress

在28℃脅迫不同時間的試驗中發現葉狀體內甘油-3-磷酸含量隨著脅迫時間的延長先增加后減少，在脅迫36 h時，含量達到最大值，為對照組的2.35倍(P<0.05)，繼續延長脅迫時間(36～72 h)，甘油-3-磷酸含量略有下降，但仍顯著高于對照組。

圖4為葉狀體在鹽脅迫下的甘油-3-磷酸含量變化情況。結果表明，當鹽度在15‰～80‰范圍內，葉狀體中甘油-3-磷酸含量均上升。當鹽度為15‰時，脅迫3 h， 甘油-3-磷酸含量積累幅度最小，為對照組的1.09倍。當鹽度高于30‰，甘油-3-磷酸含量顯著升高，且保持高水平的平穩狀態；其中在鹽度為40‰時，脅迫3 h，甘油-3-磷酸含量達到最大值，為對照組的1.74倍。而后將其置于正常鹽度(25‰)下進行恢復培養，結果顯示葉狀體內甘油-3-磷酸的含量均下降，逐步恢復到近對照組水平。其中，低鹽脅迫(15‰和20‰)組的葉狀體在恢復培養1 h后的甘油-3-磷酸含量下降至對照組水平，而高鹽脅迫組(30～80‰)葉狀體在恢復培養3 h后的甘油-3-磷酸含量依然明顯高于對照組水平?？傮w而言，甘油-3-磷酸含量在高低鹽脅迫下均上升，且高鹽下的積累量大于低鹽。此外，與脅迫組相比，恢復1 h組和3 h組的甘油-3-磷酸含量整體呈下降趨勢，其中鹽度30‰～45‰脅迫組，恢復3 h組的甘油-3-磷酸含量略高于恢復1 h組，但仍低于對應的脅迫組，這可能是組別差異造成的?？傊?，脅迫鹽度越高，葉狀體在恢復期的甘油-3-磷酸含量下降得越快，逐漸接近于對照組水平。

注：CK：對照組； -3 h: 不同鹽度脅迫3 h組；1 h: 不同鹽度脅迫后進行恢復1 h組；3 h: 不同鹽度脅迫后進行3 h組。Note: CK: Control group. -3 h: Different salinity stresses for 3 h. 1 h: Recovery culture for 1 h after salinity stress. 3 h: Recovery culture for 3 h after salinity stress.圖4 鹽度脅迫后壇紫菜葉狀體內甘油-3-磷酸含量Fig.4 The contents of glycerol-3-phosphate in thallus of P. haitanensis under salinity stress

干出脅迫下，葉狀體內甘油-3-磷酸的含量變化如圖5-A所示，短時間1 h的干出刺激后甘油-3-磷酸含量顯著上升，為對照組的1.19倍。隨著干出時間繼續增加，甘油-3-磷酸含量總體呈現下降趨勢，在干出6 h時，甘油-3-磷酸含量為對照組的0.89倍，而后趨于穩定。將干出6 h后的葉狀體置于海水中進行恢復培養(圖5-B)，結果顯示，甘油-3-磷酸含量在恢復1 h時顯著增加，達到對照組的1.23倍；而在恢復3 h時，其含量基本下降至對照組水平。

注：A: 不同干出脅迫時間下的甘油-3-磷酸含量變化； B: 干出脅迫6 h后恢復培養1 h和3 h后的甘油-3-磷酸含量變化。Note: A: The content changes of glycerol-3-phosphate under different desiccate time. B: The content changes of G3P under recovery culture for 1 and 3 h after 6 h desiccation stress.圖5 干出脅迫后壇紫菜葉狀體內甘油-3-磷酸的含量Fig.5 The contents of glycerol-3-phosphate in thallus of P. haitanensis under desiccation stress

3 討論

甘油-3-磷酸已被證實是植物防御信號轉導途徑中的一個新的調控因子或信號分子，在病原等生物脅迫防御中，甘油-3-磷酸是植物廣譜免疫的重要誘導物，是觸發免疫應答的關鍵物質。已有研究在擬南芥和大豆作物中發現甘油-3-磷酸可引發植物系統獲得性抗性，且效應與甘油-3-磷酸傳輸到植物末端組織的時間相關[14-15]。在非生物脅迫防御方面，Adler等[18]、陸信曜等[19]、Konte等[20]陸續進行鹽脅迫下的酵母胞內信號轉導機制研究，發現可通過高滲透壓甘油(high osmolarity glycerol，HOG)途徑實現甘油調節酵母菌滲透壓的重要作用，促使滲透壓穩定。甘油作為甘油-3-磷酸的代謝產物，在體內通過甘油磷酸酶的水解作用而產生。因此，可通過對甘油-3-磷酸的調控來調節甘油水平，以應對外界滲透壓的變化[6]。此外，甘油與尿苷二磷酸半乳糖(uridine diphosphate galactose，UDP-Gal)在紅藻糖苷合成酶和紅藻糖苷磷酸酶的作用下可生成紅藻糖苷異構體，作為小分子化合物發揮調節滲透壓和抗氧化損傷等作用[21-22]。

壇紫菜處于水溫劇烈變化的環境中，20℃為其最適生長溫度。而壇紫菜葉狀體在18℃條件下其甘油-3-磷酸含量無明顯變化，說明18℃仍是壇紫菜的適應溫度。陳偉洲等[23]也發現在17℃培養溫度下，壇紫菜的生長速率、光合色素及超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)活性均未受到影響，說明葉狀體完全能適應18℃條件。高溫引起細胞膜破壞和胞質外流，導致細胞內滲透壓失衡[24]，甚至細胞壁損壞，而紅藻糖苷可作為滲透壓調節物和細胞壁合成物提高細胞的抗高溫脅迫能力[14]。文獻報道顯示壇紫菜在35℃高溫脅迫30 min下紅藻糖苷含量略下降，而在恢復過程中逐漸升高至對照組近2倍[15]。Sun等[12]也發現35℃高溫脅迫30 min后，紅藻糖苷合成酶基因表達顯著上調，由此證明高溫脅迫下壇紫菜急需大量紅藻糖苷參與防御。甘油-3-磷酸是紅藻糖苷異構體的合成前體之一，甘油相關合成基因Phnho1和Phgpdh的表達量在35℃高溫脅迫下顯著升高，與本研究結果中甘油-3-磷酸出現上調現象相一致，即甘油-3-磷酸含量與溫度、時間呈正相關，該現象可以解釋為，溫度脅迫后壇紫菜迅速合成前體物甘油-3-磷酸，以促進紅藻糖苷的大量合成。而培養溫度低于18℃則無法激活甚至抑制藻體的甘油-3-磷酸合成途徑，因此藻體內原有的甘油-3-磷酸迅速被消耗，用于合成異紅藻糖苷。

鹽度脅迫中也發現紅藻糖苷合成酶活性直線升高，水解酶α-半乳糖甘酶活性降低，使得作為相溶性物質的紅藻糖苷大量累積，其目的是調節滲透壓并保護細胞內大分子和細胞膜[25-27]。Sun等[12]研究發現紅藻糖苷合成酶基因PhTPS在1 400 mmol·L-1NaCl脅迫下顯著升高2倍以上，同時紅藻糖苷異構體含量增加。在低鹽12‰和22‰脅迫下，紅藻糖苷含量分別降低8倍和2.5倍[28-30]。本試驗中也有所發現，甘油-3-磷酸作為紅藻糖苷的前體物質，其在壇紫菜體內的含量隨著鹽度(15‰～80‰)的增加而顯著上升，最高達到對照組的1.74倍；且當鹽度高于30‰時，甘油-3-磷酸累積量大于在低鹽脅迫條件下的累積量。這可能是由于壇紫菜為了發揮在鹽度脅迫下的滲透壓調節作用，可溶性糖紅藻糖苷會出現不同程度的水解；為了滿足紅藻糖苷的含量需求，壇紫菜需要快速合成其前體物甘油-3-磷酸；而當鹽度增高時，壇紫菜為加速調節藻體內部滲透壓，葉狀體急需大量的紅藻糖苷或甘油調節滲透壓，從而對前體物甘油-3-磷酸的需求也急劇增加。

Sun等[12]報道顯示，壇紫菜經干出1 h脅迫后，藻體中的紅藻糖苷合成酶表達量增加30倍以上，且隨著干出時間的增加而逐漸降低，但仍為對照組的5～12倍。此外，也有報道發現壇紫菜中紅藻糖苷含量在干出2 h后才出現顯著上升現象[10]。而本試驗中，為了合成紅藻糖苷，甘油-3-磷酸含量在1 h內顯著上升，這可能是由于甘油-3-磷酸作為信號分子，促進藻體開始激活紅藻糖苷異構體的響應通路，但隨著干出時間增加，紅藻糖苷的需求量開始減少，因此其前體物質甘油-3-磷酸的含量也開始下降，但仍被用于合成為藻體所需的紅藻糖苷異構體進行防御。

4 結論

本研究建立起基于超高效液相色譜-質譜聯用技術的甘油-3-磷酸定量方法，分析非生物脅迫下壇紫菜中甘油-3-磷酸的響應變化規律。結果顯示，甘油-3-磷酸含量與溫度和鹽度脅迫程度呈正比；不同干出時間脅迫造成壇紫菜中甘油-3-磷酸含量略上升后，整體呈下降趨勢。由此可知，作為紅藻糖苷的合成前體物，壇紫菜藻體內甘油-3-磷酸水平可快速響應環境脅迫，溫度和鹽度脅迫導致甘油-3-磷酸的合成，并作為信號分子促進了藻體開始激活紅藻糖苷異構體的響應通路，從而促進紅藻糖苷的生成，以參與藻類抗逆應答過程。而干出造成甘油-3-磷酸被逐漸消耗合成更多紅藻糖苷進行防御。