浙江省廣西越桔組織培養及遺傳多樣性分析

王挺進 袁 璐 劉 柯 劉玲娟 劉勝龍 陳利萍,* 文香英

(1浙江大學農業與生物技術學院園藝系，浙江 杭州 310058; 2浙江鳳陽山國家級自然保護區，浙江 龍泉 323700；3中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650)

廣西越桔(Vacciniumsinicum)是杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)的小灌木，生長于海拔1 200～1 700 m的山林、山谷石等地，主要分布于我國湖南、廣東及廣西地區[1]。葉立新等[2]于2001年首次在浙江省鳳陽山發現廣西越桔，標志著其分布區域向東北擴展。因個體數極少、自然更新能力差，鳳陽山上的廣西越桔面臨局部地區滅絕的危險。2012年，廣西越桔被列入《浙江省重點保護野生植物名錄(第一批)》[3]。因此，廣西越桔的保護和繁育對維護種質資源多樣性有著十分重要的意義[4-5]。目前關于廣西越桔的研究主要集中在分布地域、生境、植株形態、花果期等方面[6-7]，而對其進行保護的研究尚鮮見。

鳳陽山上的廣西越桔雖然每年都開花結果，但未觀察到自然更新后代。研究表明，對于自然界中難以自然更新的種群，可以通過早期胚培養減少胚育的發生，使其繼續生長發育成完整植株，并以此開展人工保護和繁育研究[8-11]。因此，通過培養未成熟種子獲得有性后代及其離體快繁是保護廣西越桔種質資源遺傳多樣性、擴大種群數量的有效途徑。

本研究以采集于浙江省鳳陽山的廣西越桔未成熟果實為材料，通過未成熟種子培養獲得試管實生苗。以試管實生苗莖段為外植體，培養于木本植物培養基(woody plant medium, WPM)[12]，附加不同濃度6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine, 6-BA)或玉米素(zeatin, ZT)和α-萘乙酸(naphthalene acetic acid, NAA)，建立離體快繁體系。在此基礎上，通過相關序列擴增多態性分子標記(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)[13]分析原生株與后代群體間的遺傳多樣性，以期將遺傳多樣性豐富的試管苗群體經煉苗后回歸至鳳陽山-百山祖國家級自然保護區，并為相近處境珍稀植物的保育和利用提供理論與實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以采集于浙江省鳳陽山的廣西越桔原生株的未成熟果實為材料，未成熟果實表皮堅硬，呈淺綠色。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消毒與滅菌 將未成熟果實用潔凈流水沖洗2 h后，置于超凈工作臺內，用75%酒精浸泡30 s， 無菌水沖洗3次。再用0.1% HgCl2水溶液浸泡處理10 min，無菌水沖洗3次。最后在無菌濾紙上將果實的表面水分吸干。

1.2.2 未成熟種子培養 縱向切開果實后取下未成熟種子及部分子房組織，接種至發育培養基(表1)，先于溫度25℃的黑暗條件下培養24 h后，再于光照強度20 μmol·m-2·s-1、 光照時間12 h·d-1條件下培養24 d后統計發育率。

待未成熟種子種皮變為暗褐色、種子飽滿即發育完全，接種至萌發培養基(表1)，于溫度25℃、光照強度20 μmol·m-2·s-1、光照時間12 h·d-1條件下培養60 d后統計萌發率。萌發率=萌發種子數/發育完全種子數×100%；總萌發率=萌發種子數/種子總數×100%。

表1 培養基成分Table 1 Component of medium

1.2.3 增殖培養與生根培養 種子露白后轉移至生長培養基(表1)培養。生長至6～7 cm時，取帶有一個腋芽的莖段，接種至1～8號增殖培養基(表1)進行增殖培養，以接種至生長培養基為對照。增殖培養60 d后統計增殖系數(增殖系數=總再生芽數/總外植體數×100%)和莖段長度。再生芽長至3～4片葉時接種至生根培養基(表1)。培養條件均為：溫度25℃、光照強度50 μmol·m-2·s-1、光照時間12 h·d-1。

1.2.4 種群增強與回歸 培養得到完整再生植株，株高達6～7 cm后，用清水洗去培養基，移栽入經高壓蒸汽滅菌的基質中(泥炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1)進行煉苗。煉苗條件為：溫度22℃/18℃、光照強度50 μmol·m-2·s-1、 光照時間12 h·d-1。煉苗期間每14 d澆施少量水溶肥，30 d后選取壯苗移栽至保護區苗圃，在苗圃中生長6個月后于回歸試驗地進行種群增強與回歸，6個月后觀察植株生長情況。期間由保護區工作人員定期清除競爭植被，統計移栽前后成活率、株高、株幅、成熟葉長、成熟葉寬、一級分枝數。

1.2.5 SRAP-PCR體系建立及遺傳多樣性分析 通過SRAP分子標記對鳳陽山野生廣西越桔原生株及試管實生苗后代進行遺傳多樣性分析。提取葉片DNA，采用2×Taq PCR Master Mix進行SRAP-PCR反應。在20 μL體系中，對反應的退火溫度、模板DNA含量、引物濃度進行五水平優化，其中退火溫度設置為46、48、50、52、54℃，模板DNA含量設置為40、60、80、100、120 ng，引物濃度設置為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1。研究退火溫度、模板DNA含量、引物濃度對反應的影響時，固定其他影響因素水平為模板DNA含量120 ng、引物濃度0.5 μmol·L-1、退火溫度48℃。經初步篩選采用引物組合Me7+Em8和Me8+Em1(表2)進行反應。反應結束后，在20 μL體系擴增產物中加入4 μL 6×Loading Buffer，94℃變性5 min。冷卻后利用6%聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)進行電泳分離和強堿銀染檢測。記泳道中清晰易辨的條帶為“1”，同一遷移率處無清晰條帶的為“0”，建立0/1矩陣，并用NTSYS-pc2.1軟件計算遺傳相似系數(genetic similarity, GS)。

表2 試驗所用SRAP引物Table 2 SRAP primers used in this study

2 結果與分析

2.1 未成熟種子培養

為了解決廣西越桔無自然更新后代的問題，本試驗以其未成熟果實為材料，開展了未成熟種子培養。從原生株上取得4顆未成熟果實，果實直徑6.31±0.34 mm，表皮堅硬，呈綠色，蠟質不明顯，萼片開放呈淺粉紫色(圖1-a)。4顆未成熟果實中共有未成熟種子27粒，呈長卵形或紡錘形，種皮淺黃褐色，較飽滿；敗育種子共3粒，形狀不規則，種皮淺黃色，較干癟。

27粒未成熟種子在發育培養基上培養25 d后，其中23粒種皮顏色加深，由淺黃褐色(圖1-b)轉為深棕褐色(圖1-c)，種子體積略增大，視為發育完成，發育率為85.19%。將發育完成的種子接種至萌發培養基，培養60 d后共萌發7顆種子，萌發率達30.43%，總萌發率為25.92%。種子萌發后，生長成為試管實生苗(圖1-d)。在未成熟種子培養過程中，無污染發生。因此，可以通過未成熟種子培養獲得廣西越桔有性后代，改變鳳陽山廣西越桔無有性后代的現狀。

2.2 離體快繁體系建立

為了擴大個體數量以迅速建立種群，本試驗以未成熟種子培養得到的試管實生苗為外植體，利用不同濃度植物生長調節劑配比的培養基，建立了離體快繁體系。結果顯示，相比6-BA，ZT處理能更有效地誘導芽的發生(表3，表4)，6～8號增殖培養基均可誘導出叢生芽(圖2-a)，其中6號增殖培養基對芽的誘導率最高，為106.67%(表4)，1～4號增殖培養基與生長培養基均只誘導出單個再生芽。在一定濃度范圍內，6-BA和ZT處理后再生枝長度呈現先增加后減少的趨勢，ZT處理更有效地促進再生枝的生長，再生枝長度均大于對照組(表3，表4)，其中6號增殖培養基中再生枝長度最長，為4.88 cm(表4)。因此，確定6號增殖培養基為最佳增殖培養基，可達到較高的增殖系數并有效促進再生枝的生長。

注：a：未成熟果實； b：未成熟種子；c：發育完全種子；d：試管實生苗。Note: a: Immature fruit. b: Immature seed. c: Fully developed seed. d: In ritro seedling.圖1 廣西越桔未成熟種子培養Fig.1 Immature seeds culture of V. sinicum

再生枝長至3～4片葉后接種至生根培養基培養45 d后，成活率及生根率達100%，根系生長旺盛且再生植株生長良好(圖2-b)。在離體快繁體系建立過程中，無污染發生。

表3 6-BA對廣西越桔莖段增殖系數及長度影響Table 3 Effects of 6-BA on the multiplication coefficient and the length of stem in V. sinicum

2.3 種群增強與回歸

種群增強與回歸可改善種群結構，調節種群動態，使現存天然種群得到恢復壯大。本試驗將生長至6～7 cm的完整再生植株進行煉苗并回歸至原發現地。煉苗過程中再生植株生長良好，未發生污染，成活率達100%。經過30 d的煉苗處理，將其中23株壯苗回歸至保護區苗圃，6個月后存活23株，成活率為100%。再回歸至試驗地，6個月后存活22株，成活率為95.65%，生長良好(表5，圖3)。結果表明，離體快繁得到的再生植株適應回歸試驗地生境，有望建立起具

表4 ZT對廣西越桔莖段增殖系數及長度影響Table 4 Effects of ZT on the multiplication coefficient and the length of stem in V. sinicum

注：a：叢生芽的誘導；b：生根培養。Note: a: Induction of cluster buds. b: Root induction.圖2 廣西越桔快繁體系的建立Fig.2 In vitro propagation of V. sinicum

有一定適應能力，且能自然更新的種群。

通過對已回歸植株進行形態學觀察，發現其中2株(記為Ⅱ類，圖4-a)在葉形、葉色、葉質上與其他植株(記為Ⅰ類，圖4-b)及原生株存在差異(表6)：Ⅱ類葉形為闊橢圓形近圓形、葉色淺綠、葉質革質化淺；Ⅰ類和原生株葉形為闊橢圓形，葉色濃綠、葉質革質化深，表明未成熟種子培養獲得的后代與原生株相比發生表型變異。

2.4 遺傳多樣性分析

為了探究原生株與未成熟種子培養后代群體的遺傳多樣性，本試驗以原生株與后代群體為材料，以初篩Me7+Em8、Me8+Em1引物組合為前后引物，發現在退火溫度48℃、模板DNA濃度80 ng、引物濃度0.4 μmol·L-1條件下獲得最多清晰條帶(表7)。

以原生株(記為P)及未成熟種子培養后代(記為S1～S7)為模板DNA，利用上述反應條件，以不同引物組合擴增并進行后續分析(圖5)。通過統計分析建立

表5 植株回歸前后生長情況Table 5 Growth states of seedlings before and after reintroduction

表6 植株葉形差異Table 6 The difference of leaf shape

0/1矩陣，采用NTSYS-pc2.1軟件計算得到P和S1～S7群體的遺傳相似系數在0.727 1～0.977 8之間，平均相似系數為0.841 0，極差為0.250 7(表8)。結合回歸結果，原生株與未成熟種子培養后代群體在遺傳結構上確實存在差異且可能引起表型變異。

注：a：2017年10月生長情況；b：2018年4月生長情況。Note: a: Situation of plant growth in Oct. 2017. b: Situation of plant growth in Apr. 2018.圖3 植株回歸前后生長情況Fig.3 Growth state of seedlings before and after reintroduction

注：a：Ⅱ類植株；b：Ⅰ類植株。Note: a: Type Ⅱ plant. b: Type Ⅰ plant.圖4 回歸植株群體的兩種表型Fig.4 Two phenotypes of plant populations after reintroduction

表7 不同反應條件對廣西越桔SRAP-PCR體系的影響Table 7 Effects of different reaction conditions on SRAP-PCR of V. sinicum

3 討論

浙江省廣西越桔種群數量極小，亟需保護其種質資源并擴大種群數量，為此本研究采用組織培養技術進行未成熟種子培養及其離體快繁。研究表明，組織培養克服了傳統無性繁殖方法速度慢、繁殖系數低等缺點，便于集約化管理和工廠化生產，可用于越桔屬植物及其他眾多珍稀瀕危植物的快速培育[14-16]，并且可避免不利環境因素影響，尤為適用于珍稀植物種質資源的離體保存[17]。對于野生珍稀植物而言，其遺傳多樣性越豐富，對環境變化的適應能力就越強[18]，因此必須通過有性繁殖保護其遺傳多樣性，單純通過無性繁殖擴大種群數量難以改變珍稀現狀。本研究以廣西越桔未成熟果實中的未成熟種子為起始材料，保存了不同基因型的有性后代，并通過離體快繁增加了種群數量。

注：紅色方框內為顯著差異區域。Note: Significantly different areas are in the red box.圖5 部分引物組合SRAP擴增結果Fig.5 SRAP amplification results of parts of primer combinations

表8 樣本間的遺傳相似系數Table 8 Genetic similarity coefficients among samples

野生越桔屬植物主要依靠種子繁殖，但自然條件下其種子萌發率低，種群自然更新能力弱。富晶晶等[10]研究發現，幼嫩種子經培養后萌發率可達44.5%，高于成熟種子的32.0%。本研究中，廣西越桔的未成熟種子經離體培養后可發育完全直至萌發，萌發率達30.43%，而鳳陽山未觀察到自然更新后代，因此采用未成熟種子培養進行保護是科學的。此外，王明潔等[19]以400 mg·L-1GA3溶液浸泡篤斯越桔種子，使萌發率達91.3%，而本研究中，廣西越桔種子的萌發率僅為25.92%，一方面可能是物種本身特性引起的種子活力不足，另一方面可能是發育完全的種子進入休眠，因此在后續研究中可通過誘導未成熟胚萌發或適當提高培養基中的GA3濃度等方式進一步提高廣西越桔種子的萌發率。通過離體快繁可在短時間內獲得大量長勢良好的組培苗，這一研究結果與前人觀點一致[20]，相比愈傷組織再生途徑，本研究主要通過“短枝發生型”再生途徑獲得再生芽，雖然增殖系數較低，但遺傳變異少。Cheng等[21]發現ZT對越桔屬植物不定芽再生具有良好的促進作用，本研究也發現ZT的促進效果優于6-BA，因此在野生越桔屬植物離體保護中，可優先考慮ZT。

利用高共顯性的SRAP分子標記進行遺傳多樣性分析發現，有性后代與原生株群體間的相似系數在0.727 1～0.977 8之間，平均為0.841 0，極差為0.250 7，說明群體遺傳結構在部分特定區域存在差異，這種差異可能來自雜合原生株有性繁殖過程中的自交分離、基因重組或自然變異等。采用SRAP分子標記可實現后代群體的早期鑒定[22]，據此本研究通過篩選不同基因型的后代個體回歸至原分布的自然或半自然生境中，以期建立具有一定規模且適應環境變化，能夠自然維持與更新的新種群，這對種群以及生態系統保護具有重要意義。因種群內個體由原生株自交(或近交)產生，導致遺傳多樣性水平較低。但研究表明，在遺傳多樣性水平低的情況下，增加表型多樣性也有利于種群適應環境[23]，因此觀察到的廣西越桔后代表型變異也是適應環境變化的潛在基礎。通常因生長速度慢、環境適應性差等不足，珍稀瀕危植物回歸后處于弱勢，難以與生長繁殖能力強和爭奪光照、養分及空間等能力強的植物如禾本科植物競爭，導致回歸試驗成功率較低，植株長勢不良甚至逐漸死亡[24-25]。而鳳陽山杜鵑花科植被資源豐富，如灌木層的優勢種即鹿角杜鵑(Rhododendronlatoucheae)、杜鵑(Rhododendronsimsii)等[2]，一定程度上說明了鳳陽山生境適宜杜鵑花科植物生長，且土壤中杜鵑花類菌根真菌豐富，其在杜鵑花科植物的營養吸收、逆境生理、生態適應等方面具有重要作用[26]。前人研究表明藍莓雖缺失根毛，但內生菌根真菌對其具有顯著的促生作用，可支持其迅速生長[27]。得益于適宜的生境和杜鵑花類菌根真菌的共生，回歸的廣西越桔成活率達95.65%。因此，在鳳陽山建立廣西越桔回歸種群是科學可行的。但廣西越桔生長緩慢，回歸后仍未開花結實，可在后代達到開花年限后采用人工授粉的方式增加坐果率和萌發率[28]，并進一步探究種群能否完成自然更新。此外，廣西越桔果徑大、觀賞性強，隨著種群數量的擴大，可有目的性地進行開發利用，如作為栽培越桔育種的親本，培育更適于南方地區生產的越桔品種。

4 結論

本研究通過未成熟種子培養和離體快繁等試管保育技術獲得了廣西越桔試管實生苗和再生植株。未成熟種子經發育培養后萌發，獲得試管實生苗。以試管實生苗為外植體，在WPM培養基中添加0.2 mg·L-1ZT 和0.5 mg·L-1NAA可達到最高增殖系數并促進再生芽的生長；在添加0.1 mg·L-1IBA后達到最高生根率。經煉苗后將種群回歸，植株長勢良好、株幅顯著增加。SRAP分析表明原生株與后代群體具有一定的遺傳多樣性。