基于網絡藥理學探析桃紅四物湯治療滑膜炎的潛在作用機制

龍 剛，劉 炯，付興前

（1.貴州中醫藥大學研究生院，貴州 貴陽 550002；2.貴陽市第四人民醫院運動醫學科，貴州 貴陽 550007）

滑膜炎（synovitis）是指滑膜組織受到多種關節損傷或慢性勞損等引起的非感染性病變[1]，多表現為滑膜增厚或關節積液[2]。研究表明[3]，滑膜炎發生在50%的關節炎患者中。滑膜炎患者需長期忍受疼痛的折磨，特別是肩負著家庭責任和社會的中青年患者，這已成為影響其工作和生活質量的重要因素之一。目前，尚無治療滑膜炎的特效藥物，治療主要是緩解疼痛和減輕癥狀，治療不當還可能出現不良反應。同時，該病存在治療后易復發、治療時間長、費用高昂、關節活動度降低等特點，且部分患者尚不能完全治愈。長期以來，研究關節炎發病機制的研究人員主要集中關注關節軟骨和軟骨細胞的病理變化，對滑膜的炎性變化關注較少[4，5]。中醫學認為，滑膜炎的主癥為疼痛，故歸屬于“痹證”范疇，治療宜活血化瘀，消腫通絡。桃紅四物湯首載于吳謙的《醫宗金鑒》，具有養血、活血、行氣、祛邪之效[6]。中藥治療疾病具有多成分的特點，但具體作用機制不明,故本研究基于網絡藥理學的研究方法，初步探析桃紅四物湯治療滑膜炎的潛在靶點、信號通路以及作用機制。

1 資料與方法

1.1 桃紅四物湯的有效成分和靶點篩選 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索桃紅四物湯中六味中藥（桃仁、紅花、當歸、熟地黃、川芎、白芍）的所有活性成分，根據類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavilability，OB）≥30%的參數進行中藥活性成分篩選，然后在TCMSP 數據庫中收集桃紅四物湯的有效成分對應的作用靶點，將獲取到的靶點蛋白輸入Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數據庫中轉換為官方的基因符號。

1.2 滑膜炎疾病基因獲取 將關鍵詞“Synovitis”輸入到Genecards 數 據 庫（https://www.genecards.org）、OMIM 數據庫（http://www.omim.org）、Drugbank 數據庫（https://www.drugbank.ca）和TTD 數據庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）中，挖掘滑膜炎的潛在靶點。利用Excel 合并上述4 個數據庫中挖掘到的基因靶點并去重，刪除重復值后獲得滑膜炎的靶點。

1.3 構建“中藥-成分-靶點”網絡圖 將中藥、成分和靶點用Excel 表格制作文件，再導入Cytoscape3.7.2軟件中，構建可視化網絡圖。利用Cytoscape3.7.2 軟件對該網絡圖進行網絡分析，得到連接度Degree值，并根據該值篩選藥物的主要活性成分。

1.4 桃紅四物湯-滑膜炎靶點PPI 網絡構建 利用Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線工具對桃紅四物湯作用的靶基因與滑膜炎疾病靶基因取交集，并繪制韋恩圖。將獲得的交集基因輸入STRING11.0 數據庫（https：//string-db.org）構建蛋白質互作（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡圖，分析設置為默認值，隱藏網絡中斷開連接的蛋白。導出PPI 網絡的tsv 文件，并將此文件導入Cytoscape3.7.2 軟件中，利用該軟件對其進行統計分析，并根據該網絡的度值參數篩選關鍵靶點。

1.5 KEGG 通路富集分析 使用Metascape 數據庫（http://metascape.org/gp/index.html）對桃紅四物湯與滑膜炎的共同靶點進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，采用bioinformatics 在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn）繪制KEGG 富集氣泡圖。

2 結果

2.1 桃紅四物湯活性成分及潛在靶點 在TCMSP 數據庫中按照DL≥0.18 和OB≥30%的標準篩選，得到活性成分69 種，去除重復化合物后得到61 種活性成分。在TCMSP 數據庫預測得到61 種化合物潛在靶點740 個、并轉換為基因，刪除重復基因后得到191 個。

2.2 滑膜炎相關靶點篩選 從Genecards 數據庫獲得滑膜炎靶點858 個，并從OMIM、Drugbank、TTD 數據庫中補充相關靶點，合并刪除重復后獲得904 個滑膜炎相關靶點。

2.3 桃紅四物湯中藥-成分-靶點網絡圖構建 使用Cytoscape3.7.2 軟件構建中藥-成分-靶點網絡圖，利用該軟件對網絡節點進行統計分析，并根據該網絡拓撲學參數篩選關鍵作用靶點。Cytoscape 網絡分析結果顯示，槲皮素連接度（Degree）為129，其次為β-谷甾醇（Degree 為112）、山柰酚（Degree 為102），見圖1。

圖1 中藥-成分-靶點網絡圖

2.4 桃紅四物湯-滑膜炎靶點PPI 網絡的構建 將獲取的桃紅四物湯靶點與滑膜炎疾病靶點進行交集，得到桃紅四物湯成分-滑膜炎共同靶點81 個。進一步將交集靶點輸入至STRING11.0 數據庫，得到PPI網絡圖，見圖2。圖中包含81 個節點（其中隱藏3 個斷開連接的節點）、321 條邊。將PPI 網絡tsv 文件導入Cytoscape3.7.2 軟件中并進行統計分析，根據其Degree 值篩選前3 的靶點，分別為TNF、JUN、IL-6（Degree≥23）。

圖2 桃紅四物湯-滑膜炎靶點PPI 網絡

2.5 KEGG 通路富集分析結果 利用Metascape 平臺對81 個關鍵靶點進行KEGG 分析，并借助bioinformatics 在線工具對結果可視化。KEGG 通路富集得到279 個信號通路，其中富集分析具有代表性的通路為癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、Toll 樣受體信號通路、T 細胞受體信號通路、NF-κB 信號通路等，見圖3。

圖3 KEGG 通路富集氣泡圖

3 討論

骨性關節炎是一類涉及關節軟骨退變與軟骨下骨硬化性疾病[7]。有研究表明[8]，滑膜炎在我國的患病率約為7.6%。而膝關節滑膜炎在臨床上治療方法頗多，常見的治療方法有中藥內服及外用、針灸、理筋手法、藥物注射等[9]。研究表明[10，11]，骨關節炎形成的主要因素為滑膜炎分泌的炎性因子（如IL-6、TNF-α、IL1-β）通過影響關節軟骨分解代謝速度而成。李寧等[12]指出桃紅四物湯的療效與吲哚美辛相似，能降低滑膜的炎性滲出、關節軟骨細胞的退變和抑制膠原蛋白，從而達到對關節軟骨的保護作用。也有研究發現[13]，桃紅四物湯能明顯改善患者關節的腫脹、疼痛和功能障礙。

中醫學認為，滑膜炎多因慢性勞損、外傷等，導致經絡損傷，血不循經，溢于脈外，瘀血阻滯，氣血運行遲滯不暢，故出現關節疼痛、腫脹及屈伸不利[14]。桃紅四物湯功擅活血化瘀，是骨傷科治療骨性關節炎的常用方劑。基于中醫辨證論治的基礎上，本研究利用網絡藥理學，對桃紅四物有效成分減輕滑膜炎癥作用的分子機制展開探討。

本次研究結果顯示，Degree 值位居前3 位的為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚。研究顯示[15]，槲皮素通過抑制MAPK/TLR4 信號通路降低IL-17 和炎性細胞因子的產生，減少Th17 的極化，從而發揮抗炎作用。有研究發現[16]，β-谷甾醇-SLNs 的抗炎作用可能與其抗炎和抗氧化作用有關；這可能與抑制STAT3等基礎基因、降低細胞因子和炎性介質水平以及清除ROS 有直接關系。據報道[17]，山柰酚具有廣泛的藥理活性，包括抗炎和抗氧化作用。已有研究認為[18，19]，山柰酚的抗關節炎活性可以調節炎癥酶的活性、破骨細胞的形成。桃紅四物湯治療滑膜炎癥病變存在多靶點、多成分的特點，機制復雜，與中醫整體觀念、辨證論治的原則相吻合。

PPI 是蛋白質之間相互作用的關系，本研究中PPI 分析TNF、JUN、IL-6 位居前3，均與滑膜炎癥相關。研究表明，成纖維細胞樣滑膜細胞中Cadherin-11的表達與滑膜炎的程度呈正相關，且TNF-α 在成纖維細胞樣滑膜細胞中Cadherin-11 的上調中起著至關重要的作用[20，21]。JUN 是一種轉錄因子，由蛋白1激活，介導分解代謝轉錄和細胞凋亡；它在TNF 信號通路和IL-17 中發揮重要作用[22]。研究表明[23]，IL-6 誘導TRIM27 表達增加，TRIM27 參與IL-6/STAT3信號轉導的細胞增殖和炎癥反應。

靶基因的KEGG 通路富集分析掲示了桃紅四物湯活性成分主要通過細胞周期調節和炎癥相關通路發揮調節滑膜炎癥的作用。

炎癥相關通路：①產生IL-17 的促炎性RORcTh17 細胞可以同時轉錄FoxP3，從而實現共同產生抗炎細胞因子IL-10 的能力[24]；②MAPK（JNK、ERK和p38）通路是關節炎發生發展中與炎性反應相關的關鍵信號轉導通路[25]；MAPK 在軟骨形成中起重要作用，ERK 介導軟骨細胞增殖和基因表達，JNK和p38 在關節軟骨的炎癥和破壞中起重要作用[26]；③最近發現的TNF 介導的破骨細胞生成和炎癥性骨吸收的內在抑制機制改變了炎癥性破骨細胞生成的范式[27]；④Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號由其配體激活，最終通過不同途徑產生炎性細胞因子、趨化因子和干擾素；TLR 的激活主要與通過產生免疫信使分子誘導炎癥過程和激發細胞介導的免疫反應有關[28]；⑤NF-κB 的激活是由兩種典型的信號通路介導的，即典型信號通路和非典型信號通路；這些途徑主要由促炎信號或參與發育的因子激活[29]。

細胞周期相關通路：PI3K-AKT 信號通路介導的信號在細胞增殖、分化、凋亡中是最關鍵的途徑之一，并且PI3K 途徑通過抑制下游分子Akt 來抑制細胞周期進程[30，31]。有研究發現[32]，miR-34a 的下調可以促進大鼠骨關節炎軟骨細胞的增殖并抑制其凋亡，可能的機制是通過激活PI3K-Akt 通路實現的。

綜上所述，桃紅四物湯通過多種成分、通路及靶點治療滑膜炎，這些靶點可能成為治療滑膜炎的新方法。