黑果枸杞花青素結構差異對其穩定性及細胞抗氧化活性的影響

鄧 楷，歐陽健,3，胡 娜，王洪倫*

1中國科學院藏藥研究重點實驗室，西寧 810008； 2中國科學院大學，北京 100049；3湖州中科高原生物創新中心，湖州 313000

黑果枸杞是生長于青藏高原上的一種多年生灌木植物，具有防止土壤鹽堿化、改善生態環境等諸多生態功能[1]。藥理學研究也表明黑果枸杞具有抗炎、抗氧化、降糖降脂、增強免疫力、抗疲勞、抗炎癥等諸多活性[2]，其價值逐漸被社會所重視并成為研究的熱點。

花青素因其自身結構等原因在應用時容易不穩定，而穩定性制約著花青素的發展。如B環上取代基上的羥基或甲基會降低其穩定性，酰基化以及糖基的種類、數量、結合位點也影響著花青素的穩定性[3]。Chen[4]的研究也表明外界的金屬離子、氧化劑、還原劑對黑果枸杞花青素的穩定性有一定影響。花青素的結構對其生物活性也有著重要的影響，Rahman[5]的結果表明4′-OH甲基化顯著降低花青素的抗氧化活性，糖苷相較于花青素母核結構對抗氧化活性的影響較小。由此可見穩定性和抗氧化活性都與結構有著不可分割的關系，因此討論結構對其二者的影響有助于加深我們對花青素的內在了解，并促進它的進一步開發與利用。

黑果枸杞中富含大量花青素，但目前研究普遍集中在其花青素的穩定性和藥理活性的獨立研究上。比如在穩定性上，Hu[6]對黑果枸杞花青素進行了pH穩定性評價，結果表明隨著pH的增加花青素愈發容易降解，Luan[7]也證實多酚提取物對黑果枸杞花青素有一定的穩定作用。在藥理活性上，黑果枸杞花青素具有對PC12細胞良好的細胞保護作用[8]，以及緩解D-半乳糖誘導的記憶障礙[9]。然而，現階段還未有研究討論黑果枸杞花青素的結構變化對其穩定性以及細胞抗氧化活性的影響，這在一定程度上制約了黑果枸杞及花青素的研究及應用。本研究通過穩定性實驗、計算化學以及氧化損傷細胞模型評價了花青素化合物，其結構相關性的討論可為后續黑果枸杞花青素的穩定性以及活性研究提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黑果枸杞鮮果于2019年10月采摘自青海省都蘭縣(東經96.43°，北緯36.44°，海拔3 000 m)，采摘后經中國科學院西北高原生物研究所高慶波研究員鑒定為黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)，標本存放于中國科學院西北高原生物研究所藏藥研究重點實驗室。將鮮果置于40 ℃烘箱內低溫烘干4天后得到黑果枸杞干果，并于-20 ℃儲存備用。

乙腈(色譜純，上海展云化工有限公司)；AB-8大孔樹脂(河北寶恩生物科技有限公司)；三氟乙酸(分析純，天津大茂化學試劑廠)；無水乙醇、氫氧化鈉、冰醋酸、硼酸、磷酸(分析純，浙江中星化工試劑有限公司)；氘代甲醇、氘代三氟乙酸(色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)。高糖培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(美國康寧公司)；CCK-8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；細胞裂解液，BCA蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2 儀器與設備

半制備型高效液相色譜儀(NP7000，江蘇漢邦科技有限公司)；高效液相色譜系統(Agilent 1100，美國惠普公司)；核磁共振儀(DRX-400，德國布魯克科技有限公司)；酶標儀(Varioskan Flash，賽默飛世爾科技公司)；生化培養箱(SPX-150B-Z，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司)；旋轉蒸發儀(N-1300，東京理化器械株式會社)；管式離心機(GF105，遼陽天圣達制藥機械有限公司)；恒溫二氧化碳培養箱(ICP500，德國Memmert公司)；雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-1C，上海滬凈醫療器械有限公司)；超低溫冰箱(DW-86L578J，青島海爾股份有限公司)；電子分析天平(AB104-N，瑞士METTLER TOLEDO公司)；恒溫搖床(THZ-100，上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞花青素的分離及鑒定

1.2.1.1 黑果枸杞花青素的提取純化

黑果枸杞干果以料液比(1∶20)的70%乙醇浸泡過夜，50 ℃超聲波輔助提取60 min，管式離心機離心去除雜志后，旋轉蒸發儀以50 ℃去除提取液中的醇，隨后使用AB-8大孔樹脂富集純化，以5倍柱體積的純水沖洗以便洗脫吸附在樹脂上的蛋白質和糖類，隨后使用3倍柱體積的95%乙醇溶液洗脫，旋轉蒸發儀50 ℃濃縮洗脫液。得到的黑果枸杞花青素粉末，經pH示差法計算[10]，花青素含量為363.19 ± 3.06 mg/g(錦葵色素計)。

1.2.1.2 黑果枸杞花青素的分離制備

將黑果枸杞花青素粉末溶解于0.1%鹽酸-甲醇并使其終濃度為5.0 mg/mL，進樣量為1.0 mL。色譜柱：XAqua C18柱(21.2 mm×250 mm，5 μm)；流動相流速18.0 mL/min，流動相A為0.6%三氟乙酸/水，流動相B為乙腈，洗脫程序：0 min，10% B；0～20 min，10%→17% B；20～25min，17% B；25～55 min，17%→25% B；55～60 min，25%→90% B。雙波長520 nm和280 nm進行檢測，程序運行中所接的組分旋轉蒸發去除溶劑后得到花青素化合物粉末，低溫避光保存。

1.2.1.3 黑果枸杞花青素的結構鑒定

核磁共振(1H NMR 600 MHz)所用樣品溶劑為氘代三氟乙酸/氘代甲醇(5∶95，V/V)。通過與已知文獻中的氫譜數據和數據庫進行比對，鑒定所分離的花青素化合物的結構。

1.2.2 黑果枸杞花青素的穩定性

通過測定化合物在不同pH溶液下儲存前后在λmax處吸光度的變化來探究其穩定性的變化規律[11]。使用96孔酶標板，每孔加入提前與緩沖液反應的化合物溶液200 μL，并使每孔樣品濃度為50 μM，反應平衡1 h后使用酶標儀測定λmax處吸光度，將酶標板置于25 ℃溫度的暗培養箱中儲存8 h并記錄λmax處的吸光度。通過以下方程式計算花青素的降解率：

式中：D：花青素的降解率；A1：樣品溶液平衡1 h的λmax吸光度；A2：樣品溶液儲存8 h的λmax吸光度。

1.2.3 黑果枸杞花青素的分子模擬

為了探究不同花青素結構可能會帶來穩定性的影響，我們使用Hyperchem 8.0程序對花青素分子進行模擬，采用分子力學計算(MM+)和半經驗量子力學計算(AM1)模擬花青素化合物的形態結構[12]。

1.2.4 黑果枸杞花青素的細胞活性

1.2.4.1 SH-SY5Y細胞培養及細胞損傷模型的構建

液氮中取出細胞凍存管，放于37 ℃水浴，盡快搖晃解凍，轉移凍存液至離心管25 ℃、1 000 rpm離心5 min，棄上清，除去DMSO。用含有10%(V/V)胎牛血清、1%(V/V)青鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中復蘇細胞，再用0.25%胰酶進行消化，細胞計數、傳代。選擇生長良好的3～4代細胞，待細胞長至80%～90%融合時，用于實驗，更換無血清培養基使細胞饑餓6 h，同步細胞狀態。舍棄舊培養基，加入含400 μM H2O2不含FBS的高糖培養基孵育4 h，建立細胞氧化損傷模型[13]。

1.2.4.2 細胞活力的測定

將正常培養的SH-SY5Y細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中，在細胞培養箱中孵育12 h后，換成含有黑果枸杞花青素化合物1～4的DMEM高糖培養基(含10% FBS)繼續培養4 h。培養至特定時間后，將原來的培養液棄掉，每孔加入100 μL含10% FBS的DMEM培養基。隨后每孔加入10 μL CCK溶液，置于細胞培養箱中孵育2 h。最后在37 ℃水平搖床上繼續孵育10 min，測定波長450 nm處的吸光度值。細胞活力計算公式如下：

式中：V：細胞活力；A3：含有細胞、藥物和CCK溶液的孔的吸光度；A4：不含藥物，含有細胞和CCK溶液的孔的吸光度；A0：不含細胞，含有培養基和CCK溶液的孔的吸光度。

1.2.4.3 細胞分組及藥物處理

取對數生長期的SH-SY5Y細胞，以5×104個/mL的密度鋪于6孔板，在含10% FBS的DMEM培養基中，每孔3 mL，培養48 h。加入400 μM的H2O2與化合物共孵育4 h。設置為對照組(DMEM+10% FBS)，模型組(DMEM+400 μM H2O2)，化合物給藥組(DMEM+400 μM H2O2+化合物)，模型給藥組的化合物濃度根據細胞活力實驗決定。

1.2.4.4 H2O2誘導氧化損傷SH-SY5Y細胞的乳酸脫氫酶(LDH)測定

共孵育4 h后，用1 mL PBS清洗1遍，加入300 μL胰蛋白酶消化，用PBS吹打細胞，于5 000 rpm、25 ℃離心5 min。加入PBS重懸細胞沉淀，超聲破碎得到細胞懸液。LDH的測定按照試劑盒說明書操作。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞花青素的分離及鑒定

如圖1所示，從黑果枸杞花青素提取物中分離得到了化合物1～4，通過核磁技術對花青素化合物的化學結構進行鑒定。

圖1 黑果枸杞花青素半制備液相色譜圖Fig.1 The semi-prepared HPLC chromatogram of anthocyanins from L.ruthenicum

經核磁共振波譜分析和數據庫比對[14-16]，1為petunidin-3-O-(glucosyl-trans-p-coumaroylrutinoside)-5-O-glucoside；2為petunidin-3-O-(glucosyl-cis-p-coumaroylrutinoside)-5-O-glucoside；3為petunidin-3-O-(trans-p-coumaroylrutinoside)-5-O-glucoside；4為malvidin-3-O-(trans-p-coumaroylrutinoside)-5-O-glucoside，化學結構如圖2所示。

圖2 黑果枸杞花青素化合物的化學結構Fig.2 The chemical structures of anthocyanin compounds from L.ruthenicum

2.2 黑果枸杞花青素的穩定性

2.2.1 黑果枸杞花青素不同pH下的穩定性

將黑果枸杞花青素化合物儲存在25 ℃的暗培養箱中8 h以考察黑果枸杞花青素的穩定性。如圖3所示，1與2是順反異構，1在中性和弱堿性環境下有著更低的降解率，2在酸性條件下有著更低的降解率，結果說明反式結構在中性和弱堿性條件下有著更好的穩定性，而順勢結構在酸性條件下穩定性較好，這與文獻所述一致[17]。現有研究表明花青素的穩定性隨著B環上的甲氧基取代基的增加而增加，并隨著羥基取代基的增多而減少[18]，因此4與3相比，在各個pH條件下有著更低的降解率，說明B環上的甲氧基取代能明顯提高花青素的穩定性。花青素的穩定性隨著糖苷分子的數量增加而增加，文獻表明接骨木果花青素中含有二糖苷的花青素比單糖類花青素更穩定[19]，且二糖苷和三糖苷也被證實比單糖苷的花青素更穩定[20]，所以1較于3，在弱酸性中性和弱堿性環境下降解率均有下降，表明糖基的增加可以增加一定的穩定性。

圖3 黑果枸杞花青素化合物的在不同pH值下的降解率Fig.3 The degradation rates of anthocyanin compounds from L.ruthenicum at different pH注：不同字母代表組間差異顯著，P<0.05；相同字母代表組間差異不顯著，P>0.05。Note:Different letters indicated significant differences between groups,P<0.05;Same letters indicated no-significant differences between groups,P>0.05.

2.2.2 黑果枸杞花青素分子模擬模型

通過分子力學計算(MM+)和半經驗量子力學計算(AM1)模擬花青素化合物在水中的形態結構，從而在一定程度上解釋其穩定性與結構之間的關系，結果如圖4所示。圖注表示是香豆酰基與花青素母核的分子距離，花青素可以通過分子折疊保護母核免受親水攻擊，從而降低其降解率[12]。1有著4.23?的分子間距且香豆酰基與花青素母核呈現平行的構象，而2的分子間距為8.00?，其酰基與母核之間的構象呈現垂直，1與2互為順反異構，結果表明反式結構能有效減少酰基和母核的分子距離從而達到保護母核免受親水攻擊。3的分子間距為6.08?，糖基的缺少增加了分子間的距離，相對于1更易受到親水攻擊，4的分子間距為4.90?，通過與3對比，B環上的甲氧基取代能有效減少分子間距，對花青素形成保護。細胞毒性，其結果如圖5所示。在實驗過程中我們發現花青素化合物需要加入少量的DMSO促溶，為

圖4 黑果枸杞花青素化合物的分子結構模擬圖Fig.4 The simulated molecular structures of anthocyanin compounds from L.ruthenicum

圖5 黑果枸杞花青素化合物對SH-SY5Y的細胞毒性作用 Fig.5 The cytotoxicity of anthocyanin compounds from L.ruthenicum on SH-SY5Y 注：與對照組比較，#P<0.05；*與DMSO組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,#P<0.05;*Compared with DMSO group,*P<0.05,**P<0.01.

2.3 黑果枸杞花青素的細胞活性

2.3.1 細胞活力的測定

利用CCK8法檢測化合物1～4對SH-SY5Y的了排除DMSO對于細胞活力的負面影響，我們加設了DMSO組，并通過給藥組與DMSO組為對比確定化合物對細胞活力的影響。細胞活力實驗中DMSO組相比對照組，均出現了顯著的下降，表明實驗中所使用DMSO的含量對于細胞活力會出現一定的下降。在給藥組的實驗中，相比DMSO組，1在1～40 μM 的濃度范圍里并未表現顯著的細胞活力增長或降低，但在80～100 μM出現了明顯的細胞活力下降；2在1～100 μM濃度均有極其顯著的細胞活力升高的現象；3在40 μM濃度下細胞活力有著顯著的提升；4在1～40 μM有著顯著的細胞活力增殖效應，1、5以及40 μM濃度下極其顯著。綜合考慮細胞活力實驗的結果，對于2和4化合物在40 μM的濃度下對SH-SY5Y細胞活力有著極其顯著的增殖效果，因此出于統一濃度的考慮，后續選用40 μM作為花青素化合物作用濃度，進行后續實驗。

2.3.2 LDH的測定

LDH是乳酸脫氫酶，當細胞發生氧化應激損傷時會出現LDH水平升高的現象，綜合考慮細胞活力結果，選用40 μM作為化合物給藥濃度，考察化合物對H2O2誘導的SH-SY5Y氧化損傷細胞模型的作用，其結果如圖6所示。模型組與對照組相比，LDH含量發生了明顯的升高，這表明氧化損傷造成了模型組細胞的LDH的顯著增加[13]，模型的建立是成功的。較模型組(0.082±0.00 U/gprot)相比，給藥組中1(0.047±0.00 U/gprot)、2(0.066±0.00 U/gprot)以及3(0.073±0.00 U/gprot)均可以顯著減少氧化損傷模型細胞中的乳酸脫氫酶含量，對損傷細胞具有一定的保護作用，而4對LDH水平有著顯著的升高。對花青素的抗氧化活性研究表明，花青素B環上的甲氧基取代數量的增多會降低花青素的抗氧化活性，而羥基取代基的增多會提高花青素的抗氧化活性[21]，4相較于3，它的甲氧基取代造成了抗氧化水平的下降，在LDH含量上未能體現陽性結果。K?hk?nen[22]報道了單糖苷類的矮牽牛素抗氧化能力比矮牽牛素母核要更為優秀，因此對于矮牽牛素類化合物來說，糖基的增加能顯著地提高其抗氧化能力，進而降低損傷細胞中的LDH水平。值得注意的是，根據文獻報道黑果枸杞花青素的反式結構相較于順勢結構有更好的抗氧化活性[1]，這和我們實驗結果體現的反式結構較順勢結構有著更好的LDH活性相符合，我們推測可能與反式結構更為緊湊的空間構象有關。

圖6 花青素化合物對氧化損傷模型細胞的LDH影響 Fig.6 The effects of anthocyanin compounds on the LDH level of the oxidative injured cells注：與對照組比較，#P<0.05；*與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,#P<0.05;*Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01.

3 結論

通過使用半制備型高效液相色譜得到了4種黑果枸杞花青素單體化合物，并對其穩定性、細胞抗氧化活性的結構相關性進行了初步評價。結果表明，反式結構在中性和弱堿性條件下有著相比順式結構更好的穩定性，糖基的增加以及母核B環上的甲氧基取代可以增加花青素的穩定性。分子模擬結果表明，反式結構、糖基的增加和B環上的甲氧基取代均能通過縮短母核與糖鏈的分子距離從而達到提高穩定性。細胞活性實驗的結果表明花青素化合物對細胞無毒性，且能在一定程度上改善由H2O2誘導的SH-SY5Y細胞的氧化損傷，具體表現在糖基的增加能顯著地降低損傷細胞中的LDH水平，且反式結構較順式結構更有活性優勢，其中以1最明顯。研究結果表明結構上的反式酰基化以及糖基數量的增加可以提高黑果枸杞花青素的pH穩定性及改善在H2O2誘導的SH-SY5Y細胞的氧化損傷的LDH水平。本研究對4種從黑果枸杞中分離得到的花青素化合物的穩定性和細胞抗氧化活性進行了初步的研究，希望可為后續黑果枸杞花青素的穩定性和活性的研發提供有益的參考。