紫甘藍花青素智能指示膜的制備及其在牛乳新鮮度監(jiān)測中應用

陳賽艷，趙正禾，胥小清，余惠容，何賓賓，劉 濰，王璐瑤，冀俊杰

·農產品加工工程·

紫甘藍花青素智能指示膜的制備及其在牛乳新鮮度監(jiān)測中應用

陳賽艷1，趙正禾1，胥小清1，余惠容1，何賓賓1，劉 濰1，王璐瑤1，冀俊杰2

（1. 四川農業(yè)大學食品學院，雅安 625014；2. 山東技師學院，濟南 250200）

為研究不同紫甘藍花青素含量對大豆分離蛋白基智能指示膜性能的影響，提高指示膜的綜合包裝性能，考察指示膜對巴氏殺菌乳新鮮度的監(jiān)測效果。以大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）為原料，添加紫甘藍花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）制備指示膜，對其結構、熱性能、機械性能、色度及其穩(wěn)定性和pH敏感性進行表征和分析，并將指示膜應用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測中。結果表明：相對于SPI/Na2SO4膜，含有質量分數4%紫甘藍花青素的指示膜，拉伸強度從2.46 MPa增加到3.77 MPa，斷裂伸長率從105.36%增加到131.96%；與標準白的色差從21.13增加到52.88，指示膜明度降低，色度偏黃綠色，結晶溫度比SPI/Na2SO4膜升高。指示膜的色度在常溫下5 d內不出現可視性色差，但pH敏感性強。將指示膜應用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測中，指示膜的顏色隨著牛乳變質由綠變紅，指示膜與原始膜的色差變化與巴氏殺菌乳的pH值變化呈相反趨勢，且色差可見。因此，該指示膜具有監(jiān)測巴氏殺菌乳腐敗過程的潛力，應用前景廣闊。

膜；包裝；大豆分離蛋白；紫甘藍花青素；pH指示膜；新鮮度監(jiān)測；巴氏殺菌乳

0 引 言

食品腐敗會降低食品的營養(yǎng)，甚至產生有毒成分，危害人體健康。以巴氏殺菌乳為例，微生物在儲存過程中大量生長繁殖，極易使巴氏殺菌乳失去初始營養(yǎng)價值和商品價值，還易導致食源性疾病，危害人體健康[1]。隨著社會發(fā)展和人們生活水平提高，人們對食品營養(yǎng)和安全的要求逐漸提高。因此，迫切需要一種簡單可行的方法來監(jiān)測食品新鮮度的變化。

指示性包裝是智能化包裝領域的一項新技術，能夠利用食品的代謝產物作為信息來執(zhí)行感測、跟蹤和記錄等功能，消費者無需打開包裝即可觀察到包裝內食品新鮮度變化，檢測成本低且可實時監(jiān)測[2]。近年來，隨著白色污染的加劇和世界能源的日漸短缺，綠色、環(huán)保、可生物降解的智能指示膜備受關注。

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）作為多羥基天然高分子聚合物，分子中含有大量的氫鍵、疏水鍵和疏水作用的基團，具有優(yōu)異的成膜性、生物相容性、生物降解性和低成本性[3]，常被選為成膜基材。但純SPI膜脆性大、機械強度不足，常與增塑劑、還原劑等共混，同時通過熱處理、堿處理以改善性能[2]，達到擴大包裝應用的目的。智能指示膜的制備除了需要成膜基材外，還需要指示劑。目前，已有學者在食品包裝材料中添加對pH敏感的合成指示劑制備智能指示膜，如溴甲酚綠、甲基紅和溴甲酚紫。這類指示劑對顏色響應顯著且迅速，但具有潛在毒性，存在安全隱患，因此亟需尋找一些安全的合成指示劑替代品[4]。

紫甘藍花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）作為天然指示劑，安全、無毒、對環(huán)境pH值敏感，在不同pH環(huán)境下呈現不同結構和顏色[5]，因此，富含紫甘藍花青素的包裝膜具有作為食品新鮮度監(jiān)測膜的潛力。目前，紫甘藍花青素作為pH指示劑在智能指示膜中的應用已被前人所研究。劉丹飛[6]以聚乙烯醇/羧甲基纖維素鈉為成膜基材，紫甘藍花青素為pH指示劑，制備了智能指示膜并成功應用于豬肉和蝦新鮮度監(jiān)測，發(fā)現含紫甘藍花青素的指示膜在豬肉和蝦新鮮度監(jiān)測過程中都表現出明顯的顏色變化，且花青素含量較低的指示膜顏色響應迅速，指示效果明顯，更適合在常溫下監(jiān)測豬肉和蝦新鮮度的變化。王艷娟[7]以殼聚糖/木薯淀粉為成膜基材，紫甘藍花青素為pH指示劑，制備了智能指示膜并成功監(jiān)測了鹿肉新鮮度，鹿肉腐敗過程中薄膜顏色從淡粉色變?yōu)辄S綠色。Guo等[8]制備了一種基于果膠的紫甘藍花青素指示膜，用于監(jiān)測羊肉新鮮度，羊肉腐敗過程中薄膜顏色從紫紅色變?yōu)榈{色，指示膜色差顯著，監(jiān)測效果良好。目前雖有較多關于大豆分離蛋白復合膜負載紫甘藍花青素制備智能指示膜的研究，但此類指示膜多應用于肉（豬肉、魚肉、鹿肉、羊肉等）及肉制品的新鮮度檢測中，這與花青素的pH響應范圍和肉制品變質過程中的微生物繁殖引起的環(huán)境變化有關。而將此指示膜應用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測中的研究鮮有相關報道。

本研究為了制備具有pH指示功能的大豆分離蛋白膜并研究其應用效果，以大豆分離蛋白為成膜基材，添加紫甘藍花青素為指示劑制備pH指示膜，應用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測中，重點考察紫甘藍花青素指示膜在巴士殺菌乳腐敗變質過程中的指示機理，以期為紫甘藍花青素智能指示膜的研究及應用提供理論指導和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（食品級純度），哈爾濱高科技大豆食品有限公司；紫甘藍花青素（食品級純度），濟南魯源生物科技有限公司；巴氏殺菌乳：成都新希望乳業(yè)股份有限公司。

無水亞硫酸鈉、甘油、氫氧化鈉（分析純），成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

HD-B609B-S智能電子拉力試驗機，海達國際儀器有限公司；SC-10便捷式色差儀，蘇州欣美和儀器有限公司；WGW光電霧度儀，上海儀電物理光學儀器有限公司；ZUS-4厚度測試儀，長春月明小型試驗機有限責任公司；LRH-150智能生化培養(yǎng)箱，上海飛越儀器有限公司；NICOLETIS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛尼高力儀器有限公司；pHS-25酸度計，成都世紀方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指示膜的制備

根據文獻[9-10]的方法稍作調整。將7 g大豆分離蛋白溶于93 g蒸餾水中，加入2%甘油（質量分數，基于SPI水溶液計）作指示劑，機械攪拌20 min，加熱到60 ℃,恒溫水浴30 min。加入0.1%亞硫酸鈉（質量分數，基于SPI水溶液計）作還原劑，25 ℃下恒溫攪拌40 min。加入3%、4%和5%（質量分數，基于大豆分離蛋白質量計）紫甘藍花青素，在常溫下、10 000 r/min的轉速下均質10 min，得到含不同濃度紫甘藍花青素的混合液，再用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值為9，于0.09 MPa真空環(huán)境中常溫脫氣1 h，制得成膜液。取85 mL成膜液流延至（15 cm×25 cm）有機玻璃板上，40 ℃下恒溫干燥7 h，揭膜，置于（25±2） ℃、55%±1%相對濕度的環(huán)境中平衡24 h，待測。其中不加花青素的膜標記為SPI/Na2SO4，與不添加亞硫酸鈉和花青素均的SPI膜，均作為對照膜。

1.3.2 指示膜性能測定與分析

1）機械性能：按照國標方法GB/T 1040.3—2006測定指示膜的拉伸強度和斷裂伸長率[11]。

2）色度與透明度：按照國標方法GB/T 7921—2008測定指示膜的色度，并按式（1）計算色差Δ[12]。

式中、、為膜的色度值，0=99.49，0=-0.07，0=-0.16為標準白的色度值。

按照國標方法GB/T 2410—2008測定指示膜的透明度[13]。

3）紅外光譜分析：將膜樣裁成2 cm×2 cm試樣，在60 ℃條件下干燥24 h，利用傅里葉變換紅外光譜儀測定薄膜的吸收光譜，掃描范圍650～4 000 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，掃描次數32次[3]。

4）差示掃描量熱分析：根據許安的方法做少量修改[14]。在氮氣環(huán)境下，以10 ℃/min的速率從20 ℃升溫至250 ℃，測定并分析。

5）掃描電鏡分析：將膜樣裁成2 cm×2 cm試樣，在60 ℃干燥24 h，用液氮將膜冷凍斷裂，真空濺射噴金，通過掃描電子顯微鏡（SEM，Scanning Electron Microscopy）觀察膜的橫截面（放大500倍）及表面（放大3 000倍），加速電壓為5～15 kV[15]。

6）pH值響應將指示膜裁剪成3 cm×3 cm，浸于pH值2、4、6、8、10、12的緩沖溶液中，通過數碼相機每5 min拍照一次，記錄膜的顏色變化，直至指示膜顏色穩(wěn)定。同時采用上文中的方法測定膜的色度值并計算色差值，研究指示膜的pH敏感性。

7）顏色穩(wěn)定性

儲藏溫度對薄膜顏色穩(wěn)定性的影響：將指示膜置于相對濕度為75%±1%，自然光照，溫度分別為37、25 ℃環(huán)境中，利用便攜式色差儀按一定的時間間隔測定薄膜的色度值（，，），總時長為10 d。

儲藏光照對薄膜顏色穩(wěn)定性的影響：將指示膜分別置于室內避光（用黑色自封袋）和自然光照（透明自封袋）環(huán)境中，相對濕度為75%±1%，溫度為25 ℃，利用便攜式色差儀按一定的時間間隔測定薄膜的色度值（，，），總時長為10 d。

在測試薄膜的顏色穩(wěn)定性時，將樣品膜的色度值與初始膜的色度值進行對比，計算色差，即式（1）中0，0，0采用初始膜的色度值。

1.3.3 指示膜的應用

根據前人的研究，將pH值、酸度和菌落總數作為巴士殺菌乳的新鮮度指標[16]。準確移取25 mL巴氏殺菌乳樣品置于培養(yǎng)皿中。將指示膜裁成大小為3 cm×3 cm的小塊，貼于培養(yǎng)皿頂部內表面，指示膜不與殺菌乳接觸。用保鮮膜包裹后置于（37±2）℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。每隔3 h采用pHS-25酸度計測定巴氏殺菌乳的pH值，根據GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》和平板計數法測定巴氏殺菌乳的菌落總數[17-18]，根據GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》測定巴氏殺菌乳的酸度[19]，同時拍照記錄指示膜的顏色和測定指示膜的色度，并根據上文的方法計算膜的色差值。

1.3.4 數據處理

試驗數據使用SPSS 26.0、Origin 2019進行處理與分析，結果以平均值±標準差表示。顯著性分析用方差分析法（ANOVA），<0.05表示存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 指示膜的紅外光譜分析

圖1是薄膜的紅外光譜圖。在大豆分離蛋白膜中，在3 100～3 500 cm-1處有一段較寬的吸收譜帶，來源于O-H拉伸振動和N-H伸縮振動產生的多重吸收峰[20]，以及SPI分子內部及其分子間-H、O-H、C-H鍵的伸縮振動[21]。在2 800～3 000 cm-1處有一段較窄的吸收譜帶，這是聚合物基質飽和C-H鍵的伸縮振動所產生的拉伸振動峰[20]。3 289 cm-1處是O-H鍵的伸縮振動和N-H鍵的彎曲振動吸收峰，2 959 cm-1處是C-H鍵的吸收峰[20]，1 632 cm-1處是C=O鍵的伸縮振動峰來自于酰胺Ⅰ帶[21]，1 539 cm-1處是N-H鍵的彎曲振動吸收峰來自酰胺Ⅱ帶[22]，1 400 cm-1處是C-OH伸縮振動吸收峰來自于酰胺Ⅲ帶[5]，1 235 cm-1處為C-N和N-H的伸縮振動峰，1 110 cm?1處吸收峰表示C-H鍵、O-CH鍵的變形振動[23]。加入亞硫酸鈉后，2 880 cm-1處的飽和C-H鍵的伸縮振動加強，這是由于亞硫酸鈉作為還原劑，打斷了大豆分離蛋白分子間的S-S鍵，暴露了分子內部疏水基團，削弱了復合膜的分子間力。加入花青素之后，3 289 cm-1處的波峰向低波數偏移，這是由于大豆分離蛋白與紫甘藍花青素之間產生氫鍵作用[24]，同時大豆分離蛋白鏈上羥基的O電負性大，與多酚羥基上的H發(fā)生靜電吸引作用，使-OH的電子更偏向O，-OH共價鍵被拉伸，H周圍的電子云密度降低，羥基峰向低波數偏移[22]。添加紫甘藍花青素后指示膜的紅外圖譜與大豆分離蛋白膜的紅外圖譜峰形相似，指示膜的O-H伸縮振動峰向右偏移，說明花青素與大豆分離蛋白之間為物理結合，花青素的加入并未破壞大豆分離蛋白的基本結構，主要通過非共價鍵（氫鍵或者疏水相互作用）結合。1 539 cm-1處由N-H鍵的彎曲振動產生的吸收峰在加入紫甘藍花青素之后向左發(fā)生偏移，說明添加花青素對復合膜的N-H有明顯影響[24]。以上結果說明花青素與大豆分離蛋白之間具有較好的相容性。

注：SPI膜為純SPI膜，SPI/Na2SO4膜為SPI中加入Na2SO4的復合膜，SPI/Na2SO4/PCA 3膜、SPI/Na2SO4/PCA 4膜和SPI/Na2SO4/PCA 5膜分別為含質量分數3%、4%、5%紫甘藍花青素的指示膜。下同。

2.2 指示膜的掃描電鏡分析

利用掃描電鏡觀察指示膜的微觀結構，如圖2。SPI膜具有光滑、均勻的表面和橫截面結構，表明大豆分離蛋白成膜性良好。加入少量紫甘藍花青素后，指示膜表面和內部均出現少量顆粒和團聚的現象，但無裂痕，這可能是由帶正電的紫甘藍花青素分子與帶負電的大豆分離蛋白分子之間的相互吸引出現的少量顆粒[25]，同時表面出現了少量的粗糙。隨著紫甘藍花青素含量增加，指示膜的截面出現較多的顆粒，表面的顆粒和團聚狀物也隨之增加，表明紫甘藍花青素與大豆分離蛋白的融合已經飽和，過量的花青素分子浮于指示膜表面。故選擇紫甘藍花青素與SPI基質融合良好、指示膜均勻性和致密性佳的PCA4%添加量的指示膜進行分析，因為致密的結構有可能改善薄膜的機械性能和阻隔性能，同時均勻、致密的微觀結構也有利于提高消費者對商品的青睞。

圖2 指示膜的掃描電鏡圖

2.3 指示膜的熱穩(wěn)定性分析

指示膜的熱穩(wěn)定性在一定程度上影響其應用。本研究通過差式掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）分析指示膜的熱穩(wěn)定性，結果如圖3所示。有研究顯示，純SPI 膜的熔融溫度為87.26 ℃[10]。本研究中SPI膜中加入亞硫酸鈉后在167 ℃處出現吸熱峰，發(fā)生熔融；添加質量分數3%紫甘藍花青素后，結晶溫度升高了3 ℃，達到170 ℃，且隨著PCA含量增加，結晶溫度繼續(xù)升高。這可能是一定量的亞硫酸鈉作為還原劑增強了SPI膜的結構致密性，使其熔融溫度升高；而PCA與SPI分子間強烈的作用力，需要更多的熱能方可對其進行解離。而PCA含量較低時，PCA與SPI分子間的相互作用力較弱，隨著PCA含量增加，分子間作用力增加，同時SPI與PCA分子間形成的氫鍵也可以提高復合膜的熱穩(wěn)定性，這與紅外圖譜的分析一致。當花青素含量繼續(xù)增加時，熔點稍有降低，如從4%添加量時的194 ℃下降到5%添加量時的190 ℃，同時在添加過量的花青素之后的指示膜不再出現單一精確的熔融點，而是形成了寬的軟化帶，這可能與過量花青素在指示膜表面分布不均有關[10,25]，這種不均會降低指示膜的結構穩(wěn)定性，進而出現寬的軟化溫度區(qū)間。

圖3 指示膜的DSC曲線

2.4 指示膜的厚度與機械性能分析

指示膜厚度與膜液濃度、膜液溶質中分子結構及成膜過程中的相互作用以及成膜面積有關[3]。本研究中成膜面積固定，膜液濃度隨著PCA含量增加而升高。這是因為添加的PCA增加了成膜液的干物質含量，導致相同量的成膜液流延時質量增加，從而指示膜的厚度增加[26]。當PCA增加到一定量時，膜的厚度趨于穩(wěn)定，整個厚度在115.67～144.91 μm之間。這是因為PCA與SPI具有良好的相容性，小分子進入SPI大分子的間隙中，膜的內部結構均勻而固定，這一點在紅外光譜分析中得到了證實。過量的PCA分子不會進入SPI大分子間，故膜的厚度增加不顯著。

在指示膜的應用中，需要將指示膜覆蓋于巴士殺菌乳的包裝容器出口處，良好的機械性能可保障巴士殺菌乳包裝的完整性和安全性，尤其是在運輸過程中[27]。指示膜的機械性能如表1所示，相比于添加亞硫酸鈉的SPI膜（2.46 MPa），含PCA的指示膜拉伸強度（TS，Tensile strength）和斷裂伸長率（EAB，Elongation At Break）均較高，這與Huang的研究結果一致[28]。且隨著PCA濃度增加，指示膜的TS先增后減，EAB遞減。這可能是因為三方面的原因：一是添加PCA后，PCA與SPI相容性佳，混合均勻，提升了復合膜的結構致密性；二是帶正電的PCA分子與帶負電的SPI分子之間由于靜電作用、氫鍵作用形成了高密度的空間立體網絡[25]；三是PCA中大量的羥基與SPI分子之間產生了強的相互作用，阻礙了SPI分子的鏈段運動，從而TS增加。而PCA增加到一定量時，過量的PCA小分子浮于指示膜表面發(fā)生自身聚集，削弱了SPI網絡結構中的鍵合作用，使指示膜的TS降低。這與前人研究結果的規(guī)律一致[25]。但由于該指示膜中添加了具有還原性和漂白性的亞硫酸鈉，亞硫酸鈉小分子進入SPI大分子間增強了指示膜的結構致密性和機械性能，漂白作用增強了指示膜的白度，降低其顯色效果。故添加花青素后，膜的顯色響應會更顯著，導致了少量花青素的顯色效果與前人研究中添加較多花青素的顯色效果相當。這也是本文中花青素添加量少于前人研究的原因所在。同時過量PCA的加入使得指示膜的分子空隙更小，與水分子之間的交聯(lián)更少，從而EAB變小[6]。但本研究指示膜斷裂伸長率（131.96%）也優(yōu)于其他含花青素的膜，比如馬鈴薯淀粉/硫酸軟骨素/藍莓花青素復合膜（42.15%）[29]、大豆分離蛋白/納米氧化鋅/葡萄皮紅復合膜（113.29%）[3]。以上結果說明，PCA在SPI膜的添加量選擇4%為宜，此時指示膜的TS比添加亞硫酸鈉的SPI膜增加53.25%，EAB比添加亞硫酸鈉的SPI膜增加25.25%。

表1 指示膜的厚度和機械性能

注：數值=均值±標準差（=3），同一列中標有不同小寫字母表示差異顯著（<0.05），下同。

Note: Values are presented as mean±standard deviation. Different letters in the same column indicate significant differences (<0.05), the same below.

2.5 指示膜的色度與環(huán)境穩(wěn)定性分析

一般來說，指示膜應用于食品包裝和銷售過程中，膜的色度直接影響食品的感官效果和消費者接受度，膜的顏色不宜過深，故對指示膜的初始色度進行測試。此時的色差用指示膜的色度與標準白的色度進行對比，色差越低，表明指示膜顏色淺，更適合于銷售。指示膜的色度如表2所示，相比于SPI膜，含PCA的指示膜值和值較小，值和Δ值均較大，說明指示膜偏綠偏黃。隨著PCA濃度增加，指示膜的顏色從淡黃色轉變?yōu)槟G色，不利于銷售。但若指示劑含量過低，則指示膜的變色響應不夠靈敏，不能滿足應用的要求[2]。透明度直接影響食品的感官效果，由表2可見，添加紫甘藍花青素顯著降低了指示膜的透明度，但均在消費者可接受的范圍內，故在確保指示膜可接受透明度和pH敏感性響應的雙重前提下，選擇4%的PCA添加量為宜。

表2 指示膜的色度

為準確傳遞所監(jiān)測食品的新鮮度信息，必須確保指示膜在食品保質期內的顏色穩(wěn)定性，故對指示膜進行溫度和光照穩(wěn)定性分析，此時色差用指示膜的實時色度與初始色度相比較。而花青素的穩(wěn)定性易受到溫度、光照等環(huán)境的影響[30]。圖4顯示了指示膜在不同溫度、光照環(huán)境下的顏色穩(wěn)定性。與在37℃下相比，25℃環(huán)境下的指示膜顯示出更高的穩(wěn)定性，Δ值更低，這與前人的研究結果一致[30]。這是因為對花青素具有保護作用的3-糖苷結構在高溫下易水解，同時花青素吡喃環(huán)也會水解，整個花青素結構被破壞，薄膜顏色發(fā)生改變[31]。Δ>5時，薄膜顯示出肉眼可見的顏色變化[32]。

光照也是影響薄膜顏色的重要參數，長時間的光照會誘發(fā)花青素碳骨架在C2位斷裂，形成C4羥基降解的中間產物，之后被氧化成查爾酮，查爾酮進一步氧化成如苯甲酸和2，4，6-三羥基苯甲醛等水解產物[33]，同時光照引起的樣品表面溫度升高也會引起花青素的分解。由圖4c和d可見，相比于光照條件下，避光下的指示膜顯示出相對較高的顏色穩(wěn)定性，尤其是PCA-4在光照條件下120 h內顏色穩(wěn)定（Δ<5），在避光條件下132 h內顏色穩(wěn)定（Δ<5），這得益于SPI的親水中心與紫甘藍花青素結合，在避光條件下具有良好的水合作用，從而減少了PCA分子水合降解的機會，同時SPI分子的三維網絡結構對PCA具有一定的包裹作用[34]。同時不論是光照條件下還是避光條件下，指示膜的顏色穩(wěn)定時長均超過了5 d，符合巴氏殺菌乳的包裝監(jiān)測要求。

注：PCA 0膜為SPI中加入Na2SO4而不含花青素的復合膜；PCA 3膜、SPCA 4膜和PCA 5膜分別為含質量分數3%、4%、5%紫甘藍花青素的指示膜。

2.6 指示膜的pH敏感性分析

根據上述分析，選擇PCA-4指示膜浸泡在不同pH值的酸堿緩沖液中以顏色變化評估指示膜的pH敏感性。指示膜的顏色變化見表3。當pH值為2時，指示膜呈紅色。隨著pH值升高，指示膜紅色減淡，這是因為紫甘藍花青素此時近乎無色。堿性條件下指示膜顏色變深，當pH值>12，指示膜呈現黃綠色。這是由于花青素在不同pH環(huán)境下呈現的不同結構所致[35]。當花青素在pH值為2～4的強酸性環(huán)境中時，以紅色黃烊鹽離子為主；隨著pH值升高，PCA失去碳氧環(huán)上的陽離子，并與水中的OH-離子結合后形成無色甲醇假堿，紅色逐漸變淡；pH值繼續(xù)升高，花青素中的黃酮離子發(fā)生水合作用形成了無色的查爾酮結構[36]，指示膜顏色變淡；在堿性溶液中，PCA部分結構極不穩(wěn)定，黃烊鹽離子失去質子，藍色醌式堿逐漸增加，PCA呈現藍綠色。如表3所示，在pH值2-12之間，指示膜的值先增大后減小；值逐漸降低，即顏色由紅（+）到綠（-）的變化趨勢；值先減小后增大，但始終為正。同時表3數據表明，pH值4-8范圍內指示膜與初始膜（=46.96，=-4.60，=3.76）的色差值為18.66～21.12，通常認為當色差Δ值>5時，該顏色變化可被肉眼識別；Δ值>12時，則表示不同的顏色空間[37]。本研究中的指示膜在pH值4～8顏色變化靈敏，具備監(jiān)測巴氏殺菌乳新鮮度的潛力。

2.7 指示膜在監(jiān)測巴氏殺菌乳新鮮度中的應用

巴氏殺菌乳在腐敗變質過程中，微生物的生長會導致乳酸累積，降低pH值。實際檢測中，常以酸度和pH值作為巴氏殺菌乳新鮮度的重要指標[38]。本研究中，將巴氏殺菌乳貯藏于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔3 h檢測巴氏殺菌乳的酸度和pH值，以及指示膜的色差。將指示膜的初始色度（=46.96，=-4.60，=3.76）作為對照，經過不同時間測定的指示膜色度與初始色度進行對比，根據式（1）計算得到各個時間點指示膜與原始膜的色差值，結果見表4。巴氏殺菌乳的初始酸度值為12.12°T，隨著時間延長，酸度值持續(xù)增加，且速度越來越快；同時pH值持續(xù)降低，尤其是18 h后，巴氏殺菌乳的pH降至5.84，這是由于微生物代謝產生的乳酸積累所致。根據前人的研究結論，乳酸菌在pH值較低的4.0～5.0時，會導致牛奶出現不良變質[39]。同時檢測指示膜的色差值，發(fā)現指示膜與初始膜的色差逐步增加，與2.6節(jié)中指示膜在不同pH值條件下的顏色響應行為一致，如圖5a所示，指示膜的顏色由綠色逐漸變成紅色。貯存初期（<9 h）新鮮牛乳中的乳糖在微生物作用下分解成丙酮酸，在氧氣充足時被氧化成二氧化碳和水，同時也由于乳糖未被大量分解，牛乳酸度增長緩慢；而后期在氧含量不足時丙酮酸無法即時轉化而發(fā)生堆積，于是乳酸脫氫酶將丙酮酸還原成乳酸（圖5b），導致變質牛乳的酸度增長越來越快，同時整個巴士殺菌乳的環(huán)境呈酸性[40]。此時指示膜處在酸度增加的環(huán)境中，產生的顯色反應由紫甘藍花青素的結構變化所致。紫甘藍黃花青素的反應平衡可以通過Handerson-Hassel-Balch方程進行分析和證明（圖5c）[39]。

表3 不同pH值條件下指示膜的顏色響應

表4 巴氏殺菌乳酸度、pH值和指示膜的色差變化

圖5 巴氏殺菌乳腐敗過程中指示膜色度變化原理

在巴士殺菌乳的保鮮初期，花青素中的黃素陽離子（紅色）脫除質子形成醌式堿（紫色）/陰性醌式堿（藍色）[41]，指示膜呈現藍色或紫色，但本研究中的巴士殺菌乳酸性為主，堿性不足，故指示膜只在6 h內呈青色；隨著巴士殺菌乳酸性增強，黃素陽離子的雙鍵在周圍環(huán)境中發(fā)生擴展共軛，形成無色甲醇假堿和查爾酮，逐漸顯示出黃素陽離子的本色，紅色[42]，表現為指示膜在24 h內以黃色/紅色系為主（圖5a）。因此，在貯存時間達9 h時，指示膜與前一個相鄰貯存時間的色差值為10.27，與初始膜的色差為18.52；貯藏時間達12 h后指示膜與初始膜的色差值繼續(xù)增大，巴氏殺菌乳的酸度值已經超過國家標準所規(guī)定的范圍12～18 °T[43]，菌落總數也超過了50 000 CFU/mL[43]，巴氏殺菌乳呈不新鮮狀態(tài)，指示膜的顏色由綠變紅。黃正農等[44]提取甘藍紅添加到塔拉膠膜基質中，制備指示膜研究其在巴氏殺菌乳體系中的應用時，與本研究結果相似。本研究中，當貯存時間超過18 h后，巴氏殺菌乳出現凝乳狀態(tài)，已經完全變質，同時pH值顯著下降，酸度值上升，菌落總數超過國家安全標準[43]，巴氏殺菌乳發(fā)出酸敗氣味，指示膜紅色加深，Δ值為17.33，視覺觀察明顯。通常情況下，色差大于5即可肉眼識別[14]，本研究中指示膜與初始膜的色差值均大于5，表明色差可見。根據前人的研究成果，包含有葡萄皮紅花青素的pH指示膜在監(jiān)測新鮮牛奶和變質牛奶時的顏色分別為黃色、略深和略紅，與本文的研究結果有相似之處[45]。表明本研究具有一定的科學性和實踐價值。

3 結 論

1）紫甘藍花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）加入大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）中，與SPI通過氫鍵和靜電相互作用交聯(lián)，提高了PCA/SPI指示膜的機械性能。PCA添加量為4%較為合適，與不添加PCA的SPI/Na2SO4膜相比，添加了4%花青素的指示膜拉伸強度上升了53.25%，斷裂伸長率上升了25.25%。

2）相比較于 SPI 膜，含PCA的指示膜熱穩(wěn)定性增強不明顯。PCA在SPI內融合均勻，但在膜表面分布不均。

3）指示膜具備良好的透明度和環(huán)境穩(wěn)定性，5 d內色差不可見。pH敏感性強，在不同的pH值環(huán)境下色差可見。

4）指示膜在巴氏殺菌乳新鮮度檢測中應用效果良好，隨著巴氏殺菌乳腐敗變質，指示膜與原膜的色差均大于5，色差可見。該指示膜具有作為指示標簽用于牛乳新鮮度可視化監(jiān)測的潛能。

[1] Ma Y L, Li S Y, Ji T T, et al. Development and optimization of dynamic gelatin/chitosan nanoparticles incorporated with blueberry anthocyanins for milk freshness monitoring[J]. Carbohydrate Polymers, 2020, 247: 116738.

[2] Ran R M, Chen S Y, Su Y H, et al. Preparation of pH-colorimetric films based on soy protein isolate/ZnO nanoparticles and grape-skin red for monitoring pork freshness[J]. Food Control, 2022, 137: 108958.

[3] 冉銳敏，王璐瑤，何賓賓，等. 納米氧化鋅/葡萄皮紅改性大豆分離蛋白膜的制備與性能研究[J]. 農業(yè)工程學報，2021，37(14)：294-301.

Ran Ruimin, Wang Luyao, He Binbin, et al. Preparation and characterization of soy protein isolate films modified by ZnO nanoparticles and grape-skin red[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(14): 294-301. (in Chinese with English abstract)

[4] Liu X Y, Chen K K, Wang J Y, et al. An on-package colorimetric sensing label based on a sol-gel matrix for fish freshness monitoring[J]. Food Chemistry, 2020, 307(C): 125580-125580.

[5] Yong H M, Liu J, Kan J, et al. Active/intelligent packaging films developed by immobilizing anthocyanins from purple sweet potato and purple cabbage in locust bean gum, chitosan and κ-carrageenan-based matrices[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 211: 238-248.

[6] 劉丹飛. 花青素智能比色膜的制備及其在新鮮度檢測中的應用[D]. 株洲：湖南工業(yè)大學，2021.

Liu Danfei. Preparation of Anthocyanin Intelligent Colorimetric Films and Application in Freshness Detection[D]. Zhuzhou: Hunan University of Technology, 2021. (in Chinese with English abstract)

[7] 王艷娟. 用于鹿肉新鮮度檢測的天然色素指示標簽的研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學，2019.

Wang Yanjuan. Study on Natural Pigment Indicator labels for Venison Freshness Detection[D]. Harbin: Northeast Forestry University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[8] Guo Z L, Zuo H X, Ling H, et al. A novel colorimetric indicator film based on watermelon peel pectin and anthocyanins from purple cabbage for monitoring mutton freshness[J]. Food Chemistry, 2022, 383: 131915.

[9] 王璐瑤，何淑蹇，冉銳敏，等. 基于Plackett-Burman試驗設計篩選大豆分離蛋白膜制備的主要工藝因素[J]. 中國油脂，2021，46(11)：73-77.

Wang Luyao, He Shujian, Ran Ruimin, et al. Screening of main process factors impacting the comprehensive performance of soy protein isolate film using Plackett-Burman design[J]. China Oils And Fats, 2021, 46(11): 73-77. (in Chinese with English abstract)

[10] 陳成，李蕾，畢會敏，等. 紫甘藍花青素/大豆分離蛋白復合膜的制備與性能研究[J]. 西部林業(yè)科學，2022，51(3)：67-73

Chen Cheng, Li Lei, Bi Huimin, et al. Preparation and characterization of purple cabbage anthocyanins/soy protein isolate composite film[J]. Journal of West China Forestry Science, 2022, 51(3): 67-73. (in Chinese with English abstract)

[11] 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 塑料拉伸性能的測定第3部分薄膜和紙片的試驗條件：GB/T 1040. 3-2006[S]. 北京：中國標準出版社，2006.

[12] 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 均勻空間與色差公式：GB/T 7921-2008[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[13] 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 透明塑料透光度和霧度的測定：GB/T 2410-2008[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[14] 許安，劉淑強，吳改紅，等. 生物可降解 PLLA/PGA復合膜的力學性能及熱性能研究[J]. 塑料科技，2017，45(1)：69-73.

Xu An, Liu Shuqiang, Wu Gaihong, et al. Study on mechanical and thermal properties of biodegradable PLLA/PGA composite film[J]. Plastics Science and Technology, 2017, 45(1): 69-73. (in Chinese with English abstract)

[15] 汪敏，陳潔瑩，徐磊，等. 竹葉抗氧化物/酪蛋白酸鈉/乳清分離蛋白可食膜的制備和性能分析[J]. 食品科學，2021，42(3)：266-272.

Wang Min, Chen Jieying, Xu Lei, et al. Preparation and performance analysis of bamboo leaf antioxidant/sodium caseinate/whey protein isolate composite edible film[J]. Food Science, 2021, 42(3): 266-272. (in Chinese with English abstract)

[16] Mohsen M G, Mehran M, Hossein T, et al. Development of an easy-to-use colorimetric pH label with starch and carrot anthocyanins for milk shelf life assessment[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 153: 240-247.

[17] 李艷肖，胡雪桃，張芳，等. 基于高光譜技術的菌落圖像分割與計數[J]. 農業(yè)工程學報，2020，36(20)：326-332.

Li Yanxiao, Hu Xuetao, Zhang Fang, et al. Colony image segmentation and counting based on hyperspectral technology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(20): 326-332. (in Chinese with English abstract)

[18] 國家市場監(jiān)督管理總局. 食品微生物學檢驗菌落總數測定：GB 4789. 2-2022[S]. 北京：中國標準出版社，2022.

[19] 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準食品酸度的測定：GB 5009. 239-2016[S]. 北京：中國標準出版社，2016.

[20] Han Y, Yu M, Wang L. Preparation and characterization of antioxidant soy protein isolate films incorporating licorice residue extract[J]. Food Hydrocolloids, 2018, 75: 13-21.

[21] 王振國，高育哲，時家峰，等. 擠壓溫度對大豆分離蛋白與原花青素復合物結構和功能特性的影響[J]. 農業(yè)工程學報，2022，38(21)：279-286.

Wang Zhenguo, Gao Yuzhe, Shi Jiafeng, et al. Effects of extrusion temperature on the functional and structural properties of soybean protein isolate and proanthocyanidin complex[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(21): 279-286. (in Chinese with English abstract)

[22] Koshy R R, Reghunadhan A, Mary S K, et al. pH indicator films fabricated from soy protein isolate modified with chitinnanowhisker and Clitoria ternatea flower extract[J]. Current Research in Food Science, 2022, 5: 743-751.

[23] Martelli-tosi M, Assis O B G, Silva N C, et al. Chemical treatment and characterization of soybean straw and soybean protein isolate/straw composite films[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 157: 512-520.

[24] 張淑瑜，陳春秀，李國英．膠原/氧化羥丙基甲基纖維素復合膜的制備與表征[J]．現代食品科技，2022，38(1)：248-255.

Zhang Shuyu, Chen Chunxiu, Li Guoying. Preparation and characterization of collagen/dialdehyde hydroxypropyl methylcellulose composite films[J]. Modern Food Science and Technology, 2022, 38(1): 248-255. (in Chinese with English abstract)

[25] Yong H M, Liu J. Recent advances in the preparation, physical and functional properties, and applications of anthocyanins-based active and intelligent packaging films[J]. Food Packaging and Shelf Life, 2020, 26: 100500-100517.

[26] Qin Y, Liu Y, Yong H, et al. Preparation and characterization of active and intelligent packaging films based on cassava starch and anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 134: 80-90.

[27] Rambabu K, Bharath G, Banat F, et al. Mango leaf extract incorporated chitosan antioxidant film for active food packaging[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 126: 1234-1243.

[28] Huang S Y, Xong Y B, Zou Y, et al. A novel colorimetric indicator based on agar incorporated withroot extracts for monitoring fish freshness[J]. Food Hydrocolloids, 2019, 90(5): 198-205.

[29] Bao Y W, Cui H J, Tian J L, et al. Novel pH sensitivity and colorimetry-enhanced anthocyanin indicator films by chondroitin sulfate co-pigmentation for shrimp freshness monitoring[J]. Food Control, 2022, 131: 108441-108453.

[30] 孫倩怡，任珅，魯寶君，等. 藍莓花青素的穩(wěn)定性研究[J]. 營養(yǎng)學報，2017，39(4)：400-404.

Sun Qianyi, Ren Kun, Lu Baojun, et al. Study on the Stability of anthocyains from blueberry[J], Acta Nutrimenta Sinica, 2017, 39(4): 400-404. (in Chinese with English abstract)

[31] Zhang J J, Zou X B, Zhai X D, et al. Preparation of an intelligent pH film based on biodegradable polymers and roselle anthocyanins for monitoring pork freshness[J]. Food Chemistry, 2019, 272: 306-312.

[32] Prietto L, Mirapalhete T C, Pinto V Z, et al. pH-sensitive films containing anthocyanins extracted from black bean seed coat and red cabbage[J]. LWT-Food Science and Technology, 2017, 80, 492-500

[33] Peron D V, Fraga S, Antelo F. Thermal degradation kinetics of anthocyanins extracted from ju?ara (euterpe edulis martius) and “italia” grapes (L. ), and the effect of heating on the antioxidant capacity[J]. Food Chemistry, 2017, 232: 836-840.

[34] 孫嘉臨，袁玉嬌，曾渙煌，等. 基于大豆分離蛋白的環(huán)境友好型包裝材料研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45(24)：269-277.

Sun Jialin, Yuan Yujiao, Zeng Huanhuang, et al. Research progress of environment-friendly packaging materials based on soy protein isolate[J]. Food and Fermentation Industries, 2019, 45(24): 269-277. (in Chinese with English abstract)

[35] 蔣希芝，徐磊，張蓓，等. 基于生物酶法的酰基化桑椹花青素的制備與特性[J]. 農業(yè)工程學報，2021，37(3)：294-301.

Jiang Xizhi, Xu Lei, Zhang Bei et al. Preparation and characterization of acylated mulberry anthocyanins using biological enzyme method[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(3): 294-301. (in Chinese with English abstract)

[36] 孫武亮，李文博，靳志敏，等. 花青素納米纖維智能標簽對羊肉新鮮度的無損檢測[J]. 農業(yè)工程學報，2021，37(4)：24-30.

Sun Wuliang, Li Wenbo, Jin Zhimin, et al. Non-destructive detection of mutton freshness using anthocyanin nanofiber smart label[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(4): 24-30. (in Chinese with English abstract)

[37] Ezati P, Rhim J W. pH-responsive chitosan-based film incorporated with alizarin for intelligent packaging applications[J]. Food Hydrocolloids, 2020, 102: 105629-105639.

[38] Perez G C, Salvo C C, Martin P F, et al. Analysis of milk using a portable potentiometric electronic tongue based on five polymeric membrane sensors[J]. Frontiers in Chemistry, 2021, 9: 706460.

[39] Gao R C, Hu H L, Shi T, et al. Incorporation of gelatin and Fe2+increases the pH-sensitivity of zein-anthocyanin complex films used for milk spoilage detection[J]. Current Research in Food Science, 2022, 5: 677-686.

[40] 徐楚璇. 牛奶的變質與新鮮度檢測探討[J]. 現代商貿工業(yè)，2019，40(10)：176-178.

Xu Chuxuan. Discussion on the detection of milk deterioration and freshness[J]. Modern Business Trade Industry, 2019, 40(10): 176-178. (in Chinese with English abstract)

[41] Priyadarshi R, Ezati P, Rhim J W. Recent advances in intelligent food packaging applications using natural food colorants[J]. ACS Food Science & Technology, 2021, 1: 124-138.

[42] Li Y N, Wu K X, Wang B H, et al. Colorimetric indicator based on purple tomato anthocyanins and chitosan for application in intelligent packaging[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 174: 370-376.

[43] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品安全國家標準巴氏殺菌乳：GB 19645-2010[S]. 北京：中國標準出版社，2010：1-5.

[44] 黃正農，劉飛，鐘芳. 甘藍紅-塔拉膠膜在巴氏殺菌乳新鮮程度監(jiān)測中的應用研究[J]. 廣東化工，2019，46(7)：107-109.

Huang Zhengnong, Liu fei, Zhong Fang. Study on application of cabbage red-tara gum film for pasteurised milk freshness monitoring[J]. Guangdong Chemical Industry, 2019, 46(7): 107-109. (in Chinese with English abstract)

[45] Ma Q, Wang L. Preparation of a visual pH-sensing film based on tara gum incorporating cellulose and extracts from grape skins[J]. Sensors and Actuators, B Chemical. 2016, 235: 401-407.

Preparation of intelligent indicator film based on purple cabbage anthocyanidin for monitoring milk freshness

Chen Saiyan1, Zhao Zhenghe1, Xu Xiaoqing1, Yu Huirong1, He Binbin1, Liu Wei1, Wang Luyao1, Ji Junjie2

(1.,,625014,; 2.,250200,)

A pH-colorimetric film is one of the most important indicators to acquire straightforward information by the visible color changes without opening packages in the food industry. Among them, purple cabbage anthocyanins (PCA) can be expected to serve as a natural anthocyanin pigment with high pH sensitivity. Different color changes can be easily observed in the pH variation, due to the unique structure. The PCA color can be changed from dark to light red in the acid solutions (pH=2-4) as the dominant flavylium cation. At pH level of 5-6, the flavylium cation can react with the hydrogen, and then transform into the carbinol pseudobase (colorless) or chalcone (colorless) and appeared pink. The quinoidal base can also be established with the increase of pH (7-8). Subsequently, the anion quinoidal (blue) is dominant in the alkalinity pH (9-10). The color can turn greenish-blue for the anionic quinoidal base (blue) that is synthesized at pH 11. Soy Protein Isolate (SPI) (a byproduct of the soybean oil industry) can be used to characterize by its low cost, high biodegradability, biocompatible, and excellent film-forming properties. Also, the SPI, as a natural material is easy to fuse with the purple cabbage anthocyanins. Hence, the SPI can be selected as a film-forming material. However, the SPI films share relatively low mechanical properties and thermal stability, due to the hydrophilic bonds (-OH, -NH2, -COOH, and -SH) in the film matrix. The typical C6-C3-C6 carbon skeleton structure in anthocyanins can contain two benzoyl rings and oxygenated hexameric heterocycles with the cations (a typical 2-phenyl-benzopyran cation structure). Two typical and highly reactive structural in the PCA molecules can cross-link with the SPI molecules via the hydrogen bonds and electrostatic interactions, in order to form the homogeneity and low surface roughness of films, due mainly to the excellent fusibility and compatibility of PCA and SPI, indicating the improved mechanical properties and pH sensitivity of SPI/PCA indicator films. Therefore, this study aims to synthesize the SPI/PCA-based pH-indicator films with a uniform structure, excellent mechanical properties, and strong pH sensitivity, and then apply them to monitor the freshness of pasteurized milk. FTIR and SEM demonstrated that the PCA was successfully dispersed in the SPI film matrix, and then interacted with the SPI molecules under electrostatic interactions and hydrogen bonds. In SEM micro graphs, the number of small particles was observed to float on the surface, while small holes were in the section of indicator films with the overdose PCA. The highest limitation of the fusion degree of PCA with SPI was 4%. PCA significantly enhanced the mechanical properties of indicator films. The tensile strength of indicator films increased by 53.25% (from 2.46 to 3.77 MPa), and the elongation at break increased by 25.25% (from 105.36% to 131.96%), compared with the SPI/Na2SO4film. The thermal stability of indicator films with the PCA was similar to the SPI films (167 to 194℃). The color difference (Δ) of indicator films with the PCA from the standard white increased from 21.13 to 52.88. L value, where the indicator film was yellowish-green. The indicator films presented strong chromatic stability without the visible color difference within 5 days at room temperature. A high pH sensitivity was found with the visible color difference under different pH values. Two properties were beneficial to monitor the freshness of the indicator film. The indicator films were also applied to monitor the milk. The color was then changed from green to red, together with the freshness deterioration of pasteurized milk. Also, the color difference with the initial film was visibility (Δ≥5) at any time. Hence, purple cabbage anthocyanins were used to promote the indicator function of pure SPI films. The indicator films can be used to monitor the freshness of pasteurized milk via color change. Therefore, the indicator films can be widely expected to apply in intelligent packaging, due mainly to excellent pH-sensitive properties and color stability. The finding can provide insightful ideas to design and produce SPI/PCA-based pH-indicator films.

film; packaging; soy protein isolate; purple cabbage anthocyanins; pH indicator film; freshness monitoring; pasteurized milk

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025

TS206.4

A

1002-6819(2022)-24-0228-09

陳賽艷，趙正禾，胥小清，等. 紫甘藍花青素智能指示膜的制備及其在牛乳新鮮度監(jiān)測中應用[J]. 農業(yè)工程學報，2022，38(24)：228-236.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025 http://www.tcsae.org

Chen Saiyan, Zhao Zhenghe, Xu Xiaoqing, et al. Preparation of intelligent indicator film based on purple cabbage anthocyanidin for monitoring milk freshness[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(24): 228-236. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025 http://www.tcsae.org

2022-08-01

2022-09-27

四川省科技廳創(chuàng)新苗子工程資助項目（2021106）和四川省科技廳項目（2020YFN0147）資助

陳賽艷，博士，講師，研究方向為智能化包裝材料。Email：ssdj1102@163.com