黑蘿卜胞質類型的分子鑒定與育種利用

李曉梅 楊峰 雍曉平 冉茂林

摘 ? ?要：蘿卜胞質類型鑒定是雜種優勢利用的前提。以NWB/DCGMS CMS及Ogura CMS兩個蘿卜細胞質雄性不育特異基因設計引物，對3份黑蘿卜材料進行胞質類型鑒定。結果表明，3份可育黑蘿卜資源均含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因orf463，利用3份黑蘿卜為母本與其他蘿卜構建的F2代遺傳群體表現出育性分離現象，根據育性分離比發現黑蘿卜R3、R4含2對恢復基因，黑蘿卜R5含3對恢復基因。同時，利用黑蘿卜含有NWB/DCGMS CMS線粒體不育主控基因及細胞核恢復基因的特性，進行了不育系及恢復系的創制選育，為蘿卜NWB/DCGMS CMS雜交品種的選育利用提供了技術支撐。

關鍵詞：黑蘿卜;細胞質雄性不育;育種利用

中圖分類號：S631.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2022）02-007-05

Molecular identification of cytoplasm types of black radish（Raphanus sativus L. var. niger）and the breeding utilization

LI Xiaomei1，2，3， YANG Feng1，3， YONG Xiaoping1， RAN Maolin1，3

（1. Rice and Sorghum Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Deyang 618000， Sichuan， China; 2. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， Sichuan， China; 3. Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan， Chengdu 610300， Sichuan ， China）

Abstract：The identification of radish cytoplasm is the prerequisite for the utilization of heterosis. We used NWB/DCGMS and Ogura CMS gene specific primers to identify the cytoplasm types of three black radish lines. The result showed that all three fertile black radishes had NWB/DCGMS CMS major gene orf463. The segregation of F2’s using the three black radishes as female parents and other radish as male parents suggest that black radish R3， R4 carried 2 pairs of restorer genes， and black radish R5 carried 3 pairs of restorer genes. Taking advantage of black radish having both NWB/DCGMS CMS mitochondrial sterility gene and nuclear restorer gene， we carried out the breeding of sterile lines and restorer lines to provide resources for breeding and utilization of NWB/DCGMS CMS hybrids.

Key words： Black radish; Cytoplasmic male sterility; Breeding utilization

黑蘿卜（Raphanus sativus L.var.niger）是蘿卜屬普通種的一個變種，其根皮黑色，圓形或圓柱形[1-2]。黑蘿卜主要分布在歐洲，不僅是當地的根類蔬菜，也是重要的藥用化合物來源，許多研究表明其內部主要活性物質為硫代葡萄糖苷，可被用于治療肝、尿、膽、胃腸、心血管和癌癥等疾病[3-6]。中國地區以消費各類大根類型蘿卜（Raphanus sativus L.var. hortensis）為主，至今國內只有一例關于黑蘿卜品種選育的報道[7]。

Yamagishi和Terachi[8]在對已測序的8個蘿卜線粒體基因組進行比對研究時發現，黑蘿卜線粒體含有DCGMS CMS不育主控基因orf463。DCGMS CMS是韓國學者Lee等[9]從一份引自于烏茲別克斯坦的蘿卜材料中發現，該胞質不育類型花藥上有少量無功能花粉，敗育發生在單核小孢子時期，且在蘿卜品種中存在廣泛的保持源，此特征與Nahm等[10]報道的NWB CMS相似，但與Ogura CMS差異較大，是一類新的蘿卜胞質不育類型。Park等[11]通過線粒體基因組測序推測orf463為DCGMS CMS不育主控基因。隨后，Yamagishi等[12]發現orf463基因廣泛存在于黑蘿卜中，且同一黑蘿卜線粒體中DCGMS CMS線粒體結構類型與已測序日本黑蘿卜線粒體結構類型并存，只是不同材料2種類型的亞計量不同。Wang等[13]通過對NWB CMS線粒體基因組測序發現，NWB CMS與日本黑蘿卜線粒體基因組序列與結構完全一致，與DCGMS CMS僅存在結構上的差異，是同分異構型，以上兩項研究從分子與線粒體基因組水平證實NWB CMS與DCGMS CMS屬于同一不育胞質類型，且廣泛存在于黑蘿卜中。

NWB/DCGMS CMS在蘿卜種質資源中具有廣泛的保持源[9-10]，因此極易選育出不育的F1代雜交品種，可很好保護育種者的知識產權，近年來該類型品種日益增多，如韓國世農種業的“301”“501”系列等。但與此同時，恢復材料的缺乏導致此類品種的優良性狀難以利用，長此以往將導致大量蘿卜種質資源的丟失。雖然黑蘿卜不適合國內消費習慣，但其內含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因與相應恢復基因，因此育種利用價值較大。四川省農業科學院水稻高粱研究所蘿卜課題組2016年從國外引進了3份黑蘿卜資源，隨后對其胞質進行了鑒定，并以其開展了NWB/DCGMS CMS不育系與恢復系的選育研究，可為國內研究者對NWB/DCGMS CMS胞質及其恢復基因的深入研究與育種應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

參試的10份蘿卜材料均為四川省農業科學院水稻高粱研究所蘿卜課題組選育或引進，其中Ogura CMS及NWB CMS不育系各1份（不育胞質對照組）、黑蘿卜3份（圖1）、其他不同類型蘿卜品種（品系）5個，材料詳情見表1。所有材料于2016年9月至2021年5月種植于四川省農業科學院水稻高粱研究所德陽市大同試驗基地，每年秋冬季進行根、葉性狀評價，春季進行育性鑒定與材料創制。

1.2 蘿卜胞質類型的鑒定

根據DCGMS CMS線粒體基因組（Genebank ID：KC193578.1）中orf463序列設計特異引物orf463-F/R，同時以Ogura CMS特異引物[14]對試驗材料胞質類型進行鑒定，各引物序列見表2。植物DNA提取按照TIANGEN公司通用型植物DNA提取試劑盒產品說明進行，PCR反應體系為25 μL，含40 ng DNA，2.5 μL 10×Taq Plus Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol·L-1 Super pure dNTPs，0.5 μL 10 μmol·L-1正向引物，0.5 μL 10 μmol·L-1反向引物，0.5 μL 2.5 U·μL-1 Taq Plus，用ddH2O補齊25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環;最后72 ℃延伸10 min。 PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.3 黑蘿卜的育種利用

1.3.1 ? ?NWB CMS不育源的創制與不育系的選育 ? ?以可擴增出orf463特異基因的3份黑蘿卜為母本，以試驗材料中的R8為父本，構建F1、F2群體，并對遺傳群體進行育性分析，然后對育性調查結果進行χ2檢驗，分析黑蘿卜內恢復基因對數。同時以上述不育株為母本，以R6～R10為回交父本，進行不育系的選育。

1.3.2 ? ?NWB CMS恢復系的創制 ? ?以黑蘿卜R4為母本，白長根蘿卜材料R8為父本，獲得F1代材料，然后以F1為母本，R8為輪回父本，每代選擇可育回交后代為母本，回交3代性狀基本與輪回親本一致后，進行自交，選擇自交后代育性不分離的材料，即可獲得含NWB CMS純合恢復基因的材料。

2 結果與分析

2.1 蘿卜胞質類型分子標記鑒定結果

利用DCGMS CMS與Ogura CMS特異引物對試驗材料進行PCR擴增，并對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果可知，3份黑蘿卜可擴增出orf463特異基因片段（圖2-a），證實其含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因，但所有黑蘿卜材料均可育，說明其細胞核攜帶恢復基因R8材料可擴增出orf138特異片段（圖2-b），其為Ogura CMS的雜交品種。R6、R7、R9、R10未能擴增出兩類不育胞質特異片段，為普通胞質類型。

2.2 不育源的創制與不育系的選育

以3份不同來源的黑蘿卜為母本，以R8為父本構建F1、F2群體，各群體育性情況見表2。由表2可知，F1群體全部可育，F2呈現不同的育性分離比例，說明其細胞核內所含恢復基因對數不同。以黑蘿卜R3、R4構建的F2群體可育株與不育株分離比經χ2檢驗符合2對完全顯性基因遺傳特性，而以R5構建的F2群體育性分離比為65.4∶1，經χ2檢驗符合3對完全顯性基因遺傳特性，這與筆者團隊以黑蘿卜為父本的檢驗結果一致[15]。

試驗以黑蘿卜創制的不育株為母本，以R6～R10為回交父本，進行不育系的選育，現已選育回交BC4代的NWB/DCGMS CMS各類蘿卜不育系5份（圖3）。

2.3 NWB/DCGMS CMS恢復系的創制與利用

以黑蘿卜R4為母本，R8為回交父本進行NWB/DCGMS CMS恢復系的創制，由圖4-a可知，其F1代黑蘿卜的皮色除根頸部少量黑色，其余根皮均白色，由此說明，黑蘿卜的皮色容易改良。后續每代選擇可育株做母本（說明其內含恢復基因），R8為回交父本，回交3代后其基本性狀即與回交父本相似，再進行自交，選擇自交育性不分離材料即為含NWB/DCGMS CMS純合恢復基因的材料（圖4-b）。

3 討論與結論

蘿卜為典型的異花授粉植物，其雜交優勢明顯，利用細胞質雄性不育系做母本進行雜交制種是當前蘿卜雜種優勢利用的主要途徑。因此，開展蘿卜雄性不育胞質類型分類鑒定是蘿卜雜交品種選育的前提。現今，已報道的蘿卜胞質類型主要有Ogura CMS及NWB/DCGMS CMS，其線粒體不育主控基因分別為orf138與orf463，根據不育主控基因設計引物即可對蘿卜胞質類型進行準確鑒定。筆者以兩個胞質不育基因設計特異引物篩選到3份黑蘿卜資源含有NWB/DCGMS CMS不育基因，這與YAMAGISHI等的研究結果一致[12]。

前人研究表明，NWB/DCGMS CMS在蘿卜中恢復材料極少，只有少量歐洲蘿卜材料含有該不育胞質恢復基因[8]。蘿卜以根為收獲器官，在育種過程中不需要特定恢復系即可進行雜交品種選育。NWB/DCGMS CMS相比Ogura CMS在蘿卜中具有廣泛的保持源，因此極易用該胞質配制F1代不育的雜交品種，可很好地保護育種者知識產權[15]。然而，如果缺乏恢復系的該類胞質品種大面積應用會導致育種資源逐漸丟失。本試驗鑒定到的3份黑蘿卜資源全部可育，說明其含有NWB/DCGMS CMS恢復基因，后續利用3份黑蘿卜為母本，以不含恢復基因的材料為父本，分析F2代育性分離情況，發現2份黑蘿卜含有2對恢復基因，1份黑蘿卜含有3對恢復基因，這一結果與前人研究結果相似[8，12]。

本課題應用黑蘿卜創制的不育源，開展了NWB/DCGMS CMS不育系的選育，轉育各種蘿卜類型不育系5份。同時，利用黑蘿卜材料含有NWB/DCGMS CMS恢復基因的特性，創制了含純合恢復基因的白長根蘿卜1份，該恢復材料可用于市場上含orf463特異基因的不育雜交品種優良性狀的“固定”，可擴大育種者資源利用范圍。本課題組正在開展黑蘿卜NWB/DCGMS CMS恢復基因的定位與克隆研究，相信后續研究結果對揭示NWB/DCGMS CMS不育與恢復機制及提高蘿卜育種應用效率具有重要的意義。

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