黃顙魚遲緩愛德華氏菌的分離鑒定與藥物敏感實驗

祝鑌

（廣西岑溪市三堡鎮水產畜牧獸醫站，廣西 岑溪 543215）

黃顙魚屬于鯰形目鲿科黃顙魚屬，是我國重要的淡水經濟魚類，為廣溫性魚，廣泛分布于我國除西部高原外的國內各水域，因其皮光無鱗、肉質細嫩、鮮美回甘、肌間刺少、個體小、營養豐富等原因，受到消費者的喜愛。［1］黃顙魚富含多種蛋白質和氨基酸，有助于人體鋅、硒等微量元素的補充。［1，2］《醫林集要》中記載，黃顙魚具有益脾健胃、利尿消腫等功效，還具有抗衰老、促進兒童生長發育等作用。消費者的高度認可推動了黃顙魚的人工養殖，先后涌現“黃優1號”［3］、“全雄1號”［4］等國家級新品種，2020年全國黃顙魚養殖總產量達56.5萬噸，實現每667 m2產量近5000 kg，在我國特色淡水魚類養殖產量中排名第一，并逐漸成為我國水產養殖的重要組成部分。［5］

然而隨著養殖規模的擴大、養殖密度和集約化程度的提高，病害逐漸凸顯，尤其細菌性疾病頻繁暴發，給黃顙魚養殖業造成較大的經濟損失。先后出現紅頭病、裂頭病、魚體潰瘍病、腹水病、出血性水腫以及多種寄生蟲病。主要病原有遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）、鮰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）、嗜水氣假單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）［6］以及車輪蟲、指環蟲等。［7］

遲緩愛德華氏菌又叫遲鈍愛德華氏菌，是腸桿菌科愛德華菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，無莢膜，不形成芽孢，廣泛存在于溪水、湖泊等淡水和海洋等水環境中，能感染多種動物，包括魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及哺乳動物，該菌是愛德華氏菌屬中唯一能感染人的致病菌，能引起人的腸胃炎、腹瀉等。［8］學者們先后在斑馬 魚（Danio rerio）［9］、大 菱 鲆（Scophthalmus maximus）［10］、日 本 鰻 鱺（Anguilla janponica）［11］、羅非魚（Oreochromis mossambicus（Peters,1852）［12］、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）［13］、鱖 魚（Siniperca chuatsi）［14］、黃鱔（Monopterus albus）［15］等20多種魚類中發現了該菌感染的病例。

本研究從廣西多個養殖場死亡的黃顙魚中先后分離到3株致病菌，分別命名為GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。通過形態學、生理生化特性、16S rDNA鑒定分析等方法，確定分離菌株為遲緩愛德華氏菌，進而通過藥物敏感試驗，成功篩選出具有較好療效的藥物，為黃顙魚遲緩愛德華氏菌的預防控制提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 發病情況

2020年6～8 月間，廣西3個大型黃顙魚養殖場先后出現大量黃顙魚死亡的病例，病程持續9～15 d，共造成3000尾約170 kg黃顙魚死亡，涉及水域29.5 hm2，其中2個養殖場伴隨同池養殖魚類（青魚、鰱魚、鳙魚、斑點叉尾鮰）的零星死亡。

3個養殖場黃顙魚發病的臨床癥狀稍有不同，分別表現為：1#養殖場病死魚體表黏液多、頭部發紅、肛門紅腫、體表有少量紅斑；2#養殖場病死魚除未見頭部發紅外，其他癥狀與1#養殖場相似；3#養殖場病死魚體表多處發紅，鰭條邊緣潰爛、黏液多。

上述養殖場養殖密度為3000～4500尾/667 m2。發病時，水質較差，水呈黃綠色或藍綠色，透明度5～10 cm；水溫29～31℃；pH為7.6～8.8，溶解氧為3.5～5 mg/L，氨氮濃度為0.1～0.25 mg/L，亞硝酸鹽濃度為0.1～0.4 mg/L。

1.2 主要試劑

腦心浸液肉湯培養基（BHI）（購自杭州濱和微生物試劑有限公司），營養瓊脂培養基（購自北京陸橋技術股份有限公司），5%山羊血瓊脂培養基（在營養瓊脂培養基基礎上添加5%山羊血，由作者無菌配制），新型微生物微量生化鑒定管和藥物敏感紙片（購自杭州濱和微生物試劑有限公司），Premix TaqMix（RR003Q）、DL2000〔購自寶生物工程（大連）有限公司〕。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離及形態學觀察

無菌解剖瀕死黃顙魚，分別采集心、肝、腎等臟器病變組織劃線接種于5%山羊血瓊脂培養基，37 ℃培養20 h后，挑取形態特征一致的優勢菌落，進行細菌純化、革蘭氏染色，于1000倍光學顯微鏡下觀察細菌形態；并將純化的菌株，接種于BHI培養基，37 ℃培養后，采用甘油保存法，分裝樣品，并凍存于-70 ℃冰箱。［16］

1.3.2 生理生化鑒定

按照常規方法進行糖、醇類等生化試驗，即分別選取3株純化培養的細菌劃線培養，挑取單菌落接種于微量生化反應管中，37 ℃培養24 h后，根據各生化反應管的實驗結果及《常見細菌系統鑒定手冊》［17］對各菌株進行鑒定。

1.3.3 細菌16S rDNA擴增及序列分析

分別取上述純培養細菌接種于BHI培養基中，37 ℃培養20 h后，按參考文獻［18］擴增細菌16S rDNA。PCR反應體系為50μL：Premix Taq預混液為25μL，菌液5μL，上游引物、下游引物各1μL，ddH2O 18μL。引物序列分別為5 ’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5 ’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。［2］擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，進行膠回收，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI上分別進行BLAST同源性比對，利用MEGA11.0軟件進行多重序列比對分析，采用鄰接法（Neighbor-joining Method）構建系統發育樹。

1.3.4 藥物敏感實驗

根據Kirby-Bauer瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑，即分別取100 μL新鮮培養的3種菌液，均勻涂布在5%山羊血平板上，無菌挑取各種藥物敏感紙片，分別貼在5%山羊血平板上，37 ℃倒置培養24 h，觀察并測定各種藥物的抑菌圈直徑，依據美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）判定分離菌株對藥物的敏感性。［8-11］

2 結果

2.1 細菌形態學觀察

分離菌形態特性如圖1所示。本研究從瀕死黃顙魚內臟中分離到3株細菌，分別命名為GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。該菌在血平板上出現明顯的α溶血，菌落呈圓形、灰白色、表面光滑、邊緣整齊、中間略隆起。通過革蘭氏染色及顯微鏡觀察，顯示該菌為革蘭氏陰性短桿菌。

圖1 分離菌形態特性

2.2 生理生化試驗結果

菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3的生理生化鑒定結果見表1，麥芽糖、葡萄糖、H2S、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、七葉苷、硝酸鹽還原、D-甘露糖和磷脂酶均為陽性，其他各項均為陰性。該結果與《常見細菌系統鑒定手冊》以及文獻中關于遲緩愛德華氏菌的生理生化試驗結果完全一致，結合形態學觀察結果，初步判斷GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3疑似遲緩愛德華氏菌。

表1 菌株生理生化鑒定結果

2.3 細菌16S rDNA擴增及序列分析

PCR擴增菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3的16S rDNA基因片段，通過PCR產物電泳，獲得大小約1300bp目的片段。測序后與NCBI中收錄的多種細菌16S rDNA基因片段進行序列比對，并繪制系統進化樹（圖2），由此可見，分離菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3與遲緩愛德華氏菌KJ725360、HM222643、HQ852209位于同一分支，同源性為100%，3種菌株間同源性也為100%。因此可以判定菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3均為遲緩愛德華氏菌，根據生化實驗結果、16S rDNA基因測序結果，推測3株分離菌相似性較高，選取菌株GXLJ20-1進行藥物敏感試驗。

圖2 16S rDNA系統進化樹

2.4 藥物敏感試驗結果

選取臨床常用的34種藥物，對菌株GXLJ20-1進行藥物敏感試驗，結果見表2，菌株對恩諾沙星、紅霉素、甲砜霉素、四環素、強力霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、氟甲喹、諾氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、氟苯尼考、哌拉西林、頭孢哌酮、卡那霉素、惡喹酸共16種藥物敏感；對9種藥物中度敏感，對9種藥物表現為耐藥。因此，在生產中，可在16種敏感藥物中，根據生產實際進行選擇，用于該菌的預防和治療。

表2 藥物敏感試驗結果

續表

3 討論

通過細菌分離鑒定，從廣西大型養殖場大量死亡的黃顙魚體內分離到遲緩愛德華氏菌，確定遲緩愛德華氏菌是致黃顙魚及同池養殖的青魚、鰱魚、羅非魚等魚類死亡的病原。為了更好地預防和治療該病，通過藥物敏感試驗篩選出恩諾沙星等16種敏感藥物，生產過程中可根據實際情況選用敏感藥物對遲緩愛德華氏菌進行預防和治療。

美國、韓國以及我國廣東、湖南、江蘇、山東、廣西、湖北、四川、浙江等地先后報道黃顙魚“紅頭病”或“裂頭病”，該病的主要表現為病魚頭頂部充血、出血、發紅，顱骨頂部皮膚潰爛，甚至露出顱骨，嚴重時頭頂穿孔，顱骨裂開，甚至露出腦組織；此外鰓蓋、上下頜可見細小的出血斑，鰭條出血、腹部可見細小的出血斑，肛門就生殖孔充血、出血、外突；病魚腹部膨大，有大量淡黃色腹水，腸道充血、發炎，胃內充滿氣體和淡黃色水樣液體，肝臟腫大、有出血點或出血斑，顏色灰白，腎臟腫大充血。［19-23］

遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌均屬愛德華氏菌屬，但遲緩愛德華氏菌毒力更強，廣泛感染淡水河海水養殖魚類。鮰愛德華氏菌主要為害斑點叉尾鮰，病程較快，但目前也有鮰愛德華氏菌感染黃顙魚病例的報道，因此進行細菌的分離鑒定及藥物敏感試驗，才能有針對性地做好防治。［16，24，25］此外，遲緩愛德華氏菌是愛德華氏菌屬唯一能夠感染人的病菌，是一種人魚共患病原，能引發人的胃腸黏膜及其深層組織的出血性或壞死性炎癥、關節炎，甚至腦膜炎和敗血癥等疾病，值得引起重視。［17，26］

魚類遲緩愛德華氏菌于1962年在日本首次發現，每年3～10月是引起黃顙魚發病的高發季節，發病適宜水溫多為22～28 ℃。目前對該病需堅持“預防為主、防重于治”的原則，加強日常管理，做好預防工作。首先，放養魚前做好消毒，改善池塘底質環境，并加強日常水質管理，定期調控水質，避免應激；其次，加強引種管理，從源頭控制病原，并控制養殖密度，合理追求產量；再次，科學投喂優質飼料，定期添加多種維生素、抗菌藥物，并在水溫不穩時控制投喂量，提高魚體自身抵抗力；最后，在發生病害時，使用六亞甲基胍、聚維酮碘或生石灰等消毒劑，殺滅病原體，同時通過藥物敏感試驗篩選有效藥物，進行魚體治療。［6，27］