提高雌鼠受孕率方法的研究進展

劉 鑫 岑妍慧,2 李 森 何 爽 黃 慧

提高雌鼠受孕率方法的研究進展

劉 鑫1岑妍慧1,2李 森1何 爽1黃 慧1

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023）

實驗鼠是科學實驗中應用范圍最廣、應用數量最多的實驗動物，也是生命科學研究中最重要的研究對象，生命科學的發展與進步離不開實驗動物學的發展，為了提高實驗研究的準確性、科學性以及統計學意義，科學實驗中往往需要用到大量的實驗動物模型，所以，如何有效地提高雌鼠的受孕率以擴大種群數量、推進實驗進展、提高實驗效率，成為了科學研究中的重要問題。文章通過查閱數據庫中相關文獻記載，對影響雌鼠受孕率的因素，以及有助于提高雌鼠受孕率的方法的研究進展進行綜述。

雌鼠；受孕率；動情周期

引言

生命科學的研究及發展和實驗動物科學密不可分，而實驗鼠是實驗中應用范圍最廣、應用數量最多的動物。實驗鼠在醫學、藥學、生物學、畜牧獸醫學、農業學、化工學等科學領域的研究中都起到了非常重要的作用。由于實驗鼠經濟效益高、容易獲得、易于飼養、成活率高、個體差異小、可操作性強、繁殖傳代能力強、環境適應能力強、遺傳背景明確、基因序列和人類相似度高，以及生理結構和病理轉歸與人類類似等優點[1-3]，實驗鼠成為了科學研究領域中應用面最廣、應用數量最多的實驗動物。許多實驗都需要以大量的實驗鼠模型作為研究對象，或者實驗過程中具有令實驗鼠進行受孕或者傳代的要求，所以雌鼠的受孕率成為了影響實驗效率和實驗進展的重要因素。所以實驗鼠的飼養管理以及繁育技術越來越受到重視。本綜述主要從雌鼠性周期動情期的把握、雌雄配比的選擇、初次交配日齡及合籠天數、胎間隔和交配間隔、外界環境因素、社會心理學因素以及營養水平等方面對可以有效提高雌鼠受孕率的相關方法進行論述。

1 繁殖方法

1.1 雌鼠性周期動情期的把握

在正常情況下, 雌鼠每隔4 d～5 d為一個性周期，發情后2 h～3 h即可排卵，在雌鼠排卵期間進行成功交配最有利于精卵結合完成受孕。因此鑒定并且把握實驗鼠的動情期是提高雌鼠受孕率的關鍵。目前實際實驗中常用到的確定雌鼠動情周期的檢測方法有：宮頸粘液結晶法、陰道脫落細胞學檢察法、角化細胞計數法[4,5]、外陰直接觀察法等。值得一提的是，在以往研究[5]中發現，在宮頸粘液結晶法中，動情前期結晶為云霧狀，動情期為典型的羊齒狀，動情后期為金魚草狀，動情間期為橢圓體或者菱形物；用陰道脫落細胞學檢察法進行觀察，若涂片上有大量角化上皮細胞和少量有核上皮細胞，細胞分散未成團成堆, 即可確認為動情期雌鼠[6,7]。在角化細胞計數法中，用低倍鏡進行觀察計數200個細胞，若無核角化細胞占據160個即80%以上，則可認定雌鼠處于動情期排卵后。宮頸粘液結晶法和陰道脫落細胞學檢察法在檢查過程中并沒有完全客觀的標準，可能會出現假陽性的情況，而角化細胞計數法與前兩者相結合可以增加檢測結果的準確度。但是因為這些檢測方法操作相對復雜，耗費一定的時間和人力物力，所以在大多數的交配實驗中應用并不廣泛。相對而言，雖然外陰直接觀察法在觀察過程中存在主觀性和不確定性，在一定程度上會影響觀察結果的完全客觀性和準確性，但是該類方法可操作性強，簡便易行，直觀經濟，所以適合廣泛應用于實驗中。研究發現，在交配前檢查雌鼠的陰道狀態，若雌鼠的陰道口打開，外陰微腫，顏色呈粉紅色，且陰道內有黏液分泌物，則為動情前期；若陰道口開大，外陰腫脹，陰道口開大，呈灰白色，陰道干燥，則為動情期，此期進行交配成功率極高；若外陰腫脹不明顯或回復正常，陰道口緊閉，陰道內由粘液變為液狀，則為動情后期；若外陰無明顯變化，略微濕潤，陰道口緊閉，則為動情間期。實驗過程中，可以通過及時在動情周期完成實驗鼠交配或者人工誘導雌鼠進入動情周期并完成交配的辦法，來提高雌鼠的受孕率。

1.2 雌雄配比的選擇

在雌鼠與雄鼠進行合籠交配前，確定合適的雌雄配比，不但可以提高雌鼠的受孕率，還可以對鼠資源進行合理利用。在探討不同雌雄配比下對大、小鼠的受孕率的實驗中，當Wistar大鼠雌雄配比為1∶1、2∶1、3∶1時，其平均受孕率分別為19%、15.8%、9%；當ICR小鼠雌雄配比為1∶1、2∶1、3∶2時，其受孕率分別為72.34%、60.71%、35.94%。兩組研究均得出了雌雄配比為1∶1時，雌鼠受孕率最高的結論[8,9]。在生殖毒理實驗中較常使用的雌雄配比一般為2∶1或者1∶1[10]。在美國的試驗標準操作程序中規定，動物的雌雄配比為1∶1[11]，Wilson Jame Graves則認為雌雄配比可以是2∶1或者3∶2[12]。而也有研究顯示，在實驗小鼠的繁育實驗中，在不影響小鼠的遺傳質量控制的情況下，2∶1的雌雄配比是優于1∶1的[13]。由此可見，如果在短時間內孕鼠需求量大且實驗鼠來源充足的情況下，采用受孕率最高的1∶1雌雄配比進行交配實驗較為合適；若在實驗期限允許的條件下，選用2∶1的雌雄配比進行交配即可，這樣既符合保證了生殖毒理實驗的需要，又節省了實驗經費和實驗動物資源，更符合“3R”原則[14]，這也是目前實驗室中較為普遍運用的實驗鼠交配雌雄配比。

1.3 初次交配日齡及合籠天數

實驗鼠的日齡、性成熟程度以及生理機能是影響雌鼠受孕率的重要因素。研究表明，實驗鼠的初次交配日齡及合籠天數會在一定程度上影響雌鼠的受孕率。不同品系的實驗鼠性成熟的日齡有所不同，所以其最佳初配日齡也略有差異。在不同初次交配日齡對小鼠繁殖性能的研究中發現，NIH小鼠在70～85日齡進行初次交配繁殖性能較好，雌鼠受孕率較高[15]；昆明小鼠則是在75～90日齡進行交配繁殖性能較好，雌鼠受孕率較高[16]。不同品系的實驗鼠的性成熟期和繁殖適齡存在差異，而且動物的性成熟期往往較動物的繁殖適齡要早[17]，即初次交配日齡若相對較小，會出現由于雌鼠與雄鼠雖然性成熟，但是實驗鼠的其他生理機能尚未發育完全，導致雌鼠受孕率降低的情況。所以要根據實驗鼠的品系和繁殖適齡確定其最佳初次交配日齡范圍。且7～8月齡后繁育能力可能會下降，應及時常規替換8月齡實驗鼠。

除此之外，延長合籠時間法也是實驗中常應用的提高雌鼠受孕率的方法[18]。有實驗研究表明，雌鼠合籠天數和受孕率成正相關，即合籠天數越多，雌鼠受孕率也越高[19,20]。從動物飼養的角度來考慮，有可能是因為雄鼠會影響雌鼠的孕周期，誘使其進入動情期，從而有助于提高了雌鼠受孕率。

1.4 胎間隔和交配間隔

雌鼠的胎間隔時間以及雄鼠的交配間隔時間是影響雌鼠受孕率的重要因素。在以昆明小鼠為實驗對象的研究中發現，胎間隔時間大于102ｄ的雌鼠與交配間隔時間大于60ｄ的雄鼠進行交配，其受孕率相比于沒有時間間隔的雌雄鼠顯著下降；胎間隔時間大于102ｄ的雌鼠或者交配間隔時間大于60ｄ的雄鼠，分別與無間隔的雄鼠、雌鼠進行交配后，其受孕率相比于沒有時間間隔的雌雄鼠亦有顯著下降。雌鼠胎間隔和雄鼠交配間隔越長，可能對實驗鼠的影響越大[21]。因此，胎間隔時間過長的雌鼠或交配間隔時間過長的雄鼠的生育能力低下，直接或間接導致雌鼠受孕率下降。還有研究表明，昆明小鼠的胎間隔時間在繁殖6～7胎后增加[22]，此時應及時更換種鼠。所以在生殖毒理實驗或者有雌鼠受孕要求的實驗中，應盡量避免使用胎間隔時間過長的雌鼠或交配間隔時間過長的雄鼠。

2 外界環境因素

2.1 墊料

實驗鼠生存環境中的多種因素會對其生殖性能產生一定影響。實驗室中用來飼養實驗鼠的墊料種類繁多，歐美等發達國家的實驗室動物多使用商品化的標準墊料，而我國實驗室動物所使用的墊料則多是如刨花、鋸末、玉米等木制品加工的下腳料。在探討松木刨花，楓木刨花、紙皮和稻草4種墊料對NIH小鼠繁殖性能及仔鼠生長發育的影響的實驗中發現，這4種墊料中松木刨花墊料對NIH小鼠的生長發育、繁殖性能指標有一定影響[23]。

2.2 物理因素

光照會對雌鼠的動情周期以及生長發育造成很大影響，從而影響雌鼠生理及生殖功能。不同的光照時間、光照波長以及色溫都會對實驗鼠的生理及生殖功能造成影響。有研究表明，光照可以促進雌鼠性激素的分泌，對雌鼠性周期產生一定影響[24,25]。實驗鼠動情周期與光線波長有關，光照的照度、光線的波長以及明暗交替時間都對影響到雌鼠的生長生殖和發育。有實驗表明，長光照通過刺激垂體—性腺軸的活動，引起內分泌活動的改變，從而使實驗鼠的生長發育和生殖功能增強。實驗室中通常通過人工調控光照，模擬自然日照，所以實驗室里通常采用12 h∶12 h明暗光照，如果每天維持14 h的光照，可以較好地促進雌鼠的繁殖能力，從而提高受孕率。

環境溫度會影響實驗動物的繁殖能力，溫度過高或者過低都會降低實驗動物鼠的受胎率，而且高溫會影響卵子受精以及受精卵的著床。除此之外，也有研究表明，在適宜條件下，雌鼠在夏季的受孕率高于其在春季的受孕率，所以選擇夏季作為繁殖季節也可以有效地提高雌鼠的受孕率[18]。

噪音會在很大程度上干擾人和動物的生理以及心理狀態，并且為此帶來負面傷害。國家標準（GB l4925－2010）《實驗動物環境及設施》規定，噪聲不得超過60 dB，超出該范圍將會對實驗動物的生殖能力產生影響[25]。

有研究標明低濕度可以降低雌鼠的受孕率[26]。所以實驗室里通常采用12 h∶12 h明暗光照；恒溫18℃～25℃，相對濕度40%～60%，噪音≤60分貝的相對穩定環境對實驗鼠進行飼養和繁殖。

3 社會心理學因素

柯立芝效應又稱為庫利奇效應，是指雄性動物交配之后又立即與新配偶交配的現象[27]。大多數哺乳動物在交配之后的一段時間內，即使原有的配偶就在身邊，也不再有性行為。這個階段稱為性不應期。其長短因動物的種類和周圍環境而異，如果在雄性動物交配之后，重新給它安排一個新雌性發情對象，它的性不應期則會大大縮短，甚至立即又出現交配行為。柯立芝效應在雄鼠中普遍存在。雄鼠容易產生性疲勞[28], 從而不利于雌鼠成功受孕，所以當雌雄鼠合籠一段時間，雌鼠仍未受孕，應及時更換雌鼠配偶，以提高雌鼠的受孕率。

有實驗研究發現，ICR小鼠在進行社會隔離飼養后，其動情前期和動情期延長，動情后期和動情間期幾乎不發生改變，動情周期整體延長，從該實驗結果中可以推斷，社會隔離延長雌鼠的動情前期和動情期，相當于延長其排卵時間，從而可以提高受孕率，這或許是對隔離應激的一種適應性反應[29,30]。由此可見，對雌鼠進行低群體密度飼養，或許可以提高種群的受孕率。

4 營養水平因素

實驗鼠的生長、發育、繁殖以及健康的生理狀態離不開營養物質的支持，營養物質的攝入水平可直接影響性激素的產生。營養水平低下會使雌鼠生殖功能降低；營養水平過高會使雌鼠過肥，進而影響其發情，而公鼠過肥，其生殖機能也會受到一定程度的影響，進而雌鼠與雄鼠交配困難，同樣也會影雌鼠的受孕率。因此維持正常且適宜水平的蛋白質、維生素以及礦物質攝入，對提高雌鼠的受孕率具有重要的意義。

5 超數排卵手段

為高效、穩定、大量地獲取實驗鼠種群數量，使用人為的藥物手段對雌鼠進行超數排卵操作是科學實驗和實驗動物繁育中常用的技術手段。超數排卵，簡稱“超排”，顧名思義，這是一種利用外源性促性腺激素誘發卵巢的多個卵泡發育，從而獲得更多胚胎的方法。目前科學實驗中超數排卵常用到的促性腺激素通常是孕馬血清促性腺激素（PMSG）與人絨毛膜促性腺激素（hCG）。有研究表明，孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）的使用劑量組合、注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）的時間間隔、給藥雌鼠周齡以及超數排卵雌鼠所處發情周期階段等都會對雌鼠超數排卵的結果產生影響[31,32]。并且，注射 10 IU 的孕馬血清促性腺激素（PMSG）和 10 IU 人絨毛膜促性腺激素（hCG）的劑量組合獲得受精卵最多，即雌鼠受孕率最高，效果最好；注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）的時間間隔為48 h時促排卵效果最好；不同品系的實驗鼠，其最佳的促排卵周齡不同，周齡過小或者周齡過大均會導致卵母細胞變少、卵母細胞異常受精率增高，從而導致雌鼠受孕率下降。在國外的實驗室，一般采用3～6周齡的雌鼠進行超數排卵；處于不同動情周期的雌鼠也會產生不同的超數排卵的效果，而超數排卵效果最好的動情周期是雌鼠的動情初期和動情間期，發情初期和發情間期的卵母細胞獲得數量和卵母細胞受精率明顯高于動情期和動情后期。除此之外，雌鼠的體重也在一定程度上影響著超數排卵的效果，體重過輕或者過重都會對雌鼠的超數排卵產生不利影響，而體重和雌鼠的周齡、營養水平和飼養條件密切相關，通常在適宜的營養供給狀態和飼養條件的基礎下，雌鼠4周齡左右時的體重能達到最好的超數排卵效果[31-33]。

6 結束語

在各種實驗動物種群中，實驗鼠由于管理飼養方便、可操作性強、妊娠周期短、經濟效益高等優點，在各類實驗研究中被廣泛使用。在進行實驗鼠繁殖培育工作或者動物實驗的過程中，雌鼠的受孕率直接或間接關系到實驗進度、實驗效率和實驗結果。因此，在雌雄鼠交配繁殖實驗中，要善于利用內在以及外在有利因素、規避不利因素。在實驗過程中，可以通過誘導雌鼠進入動情周期或直接選擇處于動情周期的雌鼠完成交配實驗；采用實驗條件下最適用的雌雄配比；選擇適宜日齡的雌雄鼠進行交配繁殖；適當延長合籠天數并且避免使用胎間隔時間過長的雌鼠和交配間隔時間過長的雄鼠；飼養過程使用材質安全、對實驗鼠繁殖性能影響較小的墊料；保證實驗鼠生活環境的溫濕度、光照、噪音等條件溫和且適宜；飼養過程中保證適宜的營養供給；及時更換雌鼠配偶、低種群密度飼養雌鼠等方法，達到提高雌鼠受孕率的目的，進而有效保證充足的實驗鼠來源以及穩定的實驗進度和效率。本綜述通過總結和探討提高雌鼠受孕率的方法，為歸納實驗鼠的生長生殖性能的影響因素、探索實驗鼠繁殖培育方式以及環境調控手段提供了新的理論依據，也為哺乳動物的飼養、繁育提供新了的思路和方法。

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Research Progress on Methods for Improving Pregnancy Rate in Female Rat

Laboratory rats are the experimental animals with the widest range and the largest number of applications in scientific experiments, as well as the most important research objects in life science research. The development and progress of the life sciences are inseparable from the development of laboratory zoology. In order to improve the accuracy, scientificity and statistical significance of experimental research, a large number of experimental animal models are often used in scientific experiments. Therefore, how to effectively improve the pregnancy rate of female rats to expand the population, promote experimental progress, and improve experimental efficiency has become an important issue in scientific research. This paper reviews the research progress of methods to improve the pregnancy rate of female mice by referring to relevant literature records in the database and combining with empirical rules in the laboratory.

female rat; pregnancy rate; estrous cycle

Q953

A

1008-1151(2022)12-0076-04

2022-09-06

廣西自然科學基金面上項目（2020GXNSFAA259011，2019JJA140246）；廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2021KY0291）；廣西一流學科建設開放課題（2019XK137）；廣西壯瑤藥重點實驗室子項目（GXZYKF2019-5，GXZYKF-201708）；2020年大學生創新創業訓練計劃項目（202010600018）；廣西中醫藥大學校級科研項目（2019MS001）；廣西一流學科建設項目重點課題（2018XK023，2018XK024）。

劉鑫（1993－），女，河北石家莊人，廣西中醫藥大學在讀碩士研究生，研究方向為中草藥防治相關疾病。

岑妍慧（1980－），女，廣西北海人，廣西中醫藥大學教授，研究方向為中草藥防治相關疾病。