纖維素降解菌的分離、鑒定與產酶條件探究

佀勝利，鄒莎莎，吳書云，王成湘

（凱里學院，貴州凱里 556011）

纖維素是植物細胞壁的主要成分之一，是自然界中現有數量最多且最低廉的資源，目前尚未得到充分合理的利用［1］。在自然狀態下，纖維素的生物降解主要通過微生物分泌的纖維素酶來完成，降解過程無污染、成本低，因而纖維素降解微生物的篩選一直受到研究者的關注［2-3］。自然界存在的產纖維素酶的微生物種類較多，對纖維素的降解能力差異較大，通過對其培養條件的優化可以有效提高產纖維素酶的效率和對纖維素的降解能力［4-6］。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

多年自然生長松樹林下充分腐熟的松針土，采集于貴州省鎮遠縣。

1.2 培養基

富集培養基：K2HPO41.00 g·L-1、NaCl 0.10 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.30 g·L-1、NaNO32.50 g·L-1、FeCl30.001 g·L-1、CaCl20.10 g·L-1。培養基按照每瓶50 mL 進行分裝，每個三角瓶中放入約0.50 g 濾紙條，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養基：（NH4）2SO42.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.50 g·L-1、K2HPO41.00 g·L-1、NaCl 0.50 g·L-1、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2.00 g·L-1、瓊脂20.00 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

含剛果紅的篩選培養基：在篩選培養基中加入2.00 g·L-1剛果紅。

發酵培養基：蛋白胨3.00 g·L-1、酵母粉0.50 g·L-1、（NH4）2SO42.00 g·L-1、KH2PO44.00 g·L-1、CaCl20.30 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.30 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

1.3 纖維素降解菌株的篩選

稱量1.00 g 土壤樣品，在30 ℃ 150 r·min-1富集培養基中振蕩培養至濾紙條完全裂解。用無菌水連續稀釋培養后的富集培養基，得到10-7稀釋液，取稀釋液200 μL 均勻涂布到含剛果紅的篩選培養基上，30℃恒溫培養，待菌落長出后，挑選培養特征不同且具有明顯透明圈的單菌落轉接到篩選培養基，純化后冷凍保存。將純化后的菌株轉接篩選培養平板，30 ℃恒溫培養24 h。用0.5%的剛果紅溶液染色60 min，再用1 mol·L-1NaCl 溶液褪色60 min，觀察染色后的透明圈大小。選擇透明圈直徑（D）/菌落直徑（d）比值較大的菌株，接入發酵培養基，30 ℃ 150 r·min-1培養72 h，測定培養液的羧甲基纖維素酶活性（CMCA），選擇CMCA 最高的菌株，進行下一步試驗。

1.4 纖維素降解菌株的鑒定

1）形態學鑒定。接種菌株到篩選培養基培養24 h，觀察菌落培養特征，進行革蘭氏染色。

2）分子生物學鑒定。將培養24 h 的純化菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行鑒定，利用細菌16S rDNA 通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGC TCAG-3'）、1492R（5'-TAGGGTTACCTT GTTACGACTT-3'）

對菌株16S rDNA 序列進行擴增，對PCR 產物純化回收后測序，利用BLAST 軟件將測序結果與GenBank中已有序列進行比對，使用MEGA-X 軟件構建系統發育樹，確定菌株的種屬。

1.5 發酵條件對纖維素降解菌株產纖維素酶的影響

1.5.1 單因素試驗

選取發酵時間、發酵初始pH 值和發酵溫度進行單因素試驗，研究各因素對篩選出的菌株產纖維素酶的影響。將篩選出的菌株接種到一定初始pH 值的發酵培養基中，在指定溫度下150 r·min-1振蕩培養一定時間，將發酵液3 000 r·min-1離心10 min，得粗酶液。測定單因素條件下粗酶液的CMCA 確定合適的正交設計參數。每個處理設3 個重復組。

1.5.2 正交優化

依據單因素試驗結果，選擇發酵時間、初始pH值和發酵溫度，設計3 因素3 水平正交試驗，采用L9（33）正交表。

1.6 纖維素酶活性的測定

纖維素酶活性用DNS 法進行測定［6］。在特定條件下，1 mL 粗酶液1 min 轉化產生1μg 還原糖所需的酶量規定為1 個酶活力單位（U）。取0.50 mL 粗纖維素酶溶液、1.00 mL 檸檬酸緩沖液（pH=4.8）和1.50 mL CMC-Na 溶液充分混勻，50 ℃ 150 r·min-1酶解180 min，之后加入3.00 mL DNS 溶液，充分混勻后沸水浴5 min，冷卻后加入3.00 mL 蒸餾水，充分混勻后在540 nm 處測定吸光值。同時，設置底物空白和酶空白。

1.7 葡萄糖標準曲線的制作

向干燥試管中分別加入1.00 mg·mL-1標準葡萄糖溶液0.00 mL、0.30 mL、0.60 mL、0.90 mL、1.20 mL、1.50 mL，再分別加蒸餾水至體積為1.50 mL，加入DNS試劑3.00 mL，混勻，沸水浴5 min 后冷卻，最后用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后測定在540 nm 的吸光值。以葡萄糖濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標，得到葡萄糖標準曲線方程為y=1.290 8x+0.059 4（R2=0.999 1）。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌株的篩選

將富集液稀釋后涂平板，共分離純化得到12 個產生明顯降解圈的纖維素降解菌株。對轉接后的菌株進行剛果紅染色，如圖1 所示。通過測定透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），菌株DT10、DT13、DT14 的透明圈直徑比值（D/d）較大。測定3 個菌株發酵所得粗酶液的CMCA，如表1 所示，DT13 的酶活最高，作為進一步研究的菌株。

表1 纖維素降解菌株D/d 值與羧甲基纖維素酶活性

2.2 纖維素降解菌株的鑒定

DT13 菌株在篩選培養基上生長24 h 的菌落呈白色、圓形、濕潤無皺褶，如圖1（a）所示。經革蘭氏染色后顯微觀察，菌體為細桿狀，呈紫紅色，為革蘭氏陽性菌，如圖1（b）所示。該菌株經DNA 提取、PCR 擴增獲得長度為1 434 bp 的16S rDNA 片段，通過BLAST 序列比對，菌株DT13 與枯草芽孢桿菌（B.subtillis）相似度在99.7%以上；選擇相似度較高的代表菌株構建系統發育樹，見圖2，DT13 與枯草芽孢桿菌的進化關系較近，可靠性較高，確定菌株DT13為枯草芽孢桿菌（B.subtillis）。

圖1 菌株DT13 的形態特征與革蘭氏染色圖

圖2 菌株DT13 系統發育樹圖

2.3 發酵條件對菌株DT13 產纖維素酶的影響

2.3.1 發酵條件對纖維素酶產量影響的單因素試驗

將菌株DT13 在30 ℃ 150 r·min-1條件下進行纖維素酶發酵144 h，自發酵開始每隔24 h 取出一次樣品測定其纖維素酶粗酶液的CMCA。結果如圖3（a）所示，CMCA 隨著發酵時間的增加呈增加趨勢，在96 h 時達到最高，為4.86 U·mL-1；菌株DT13 接種在不同初始pH 值的發酵培養基中，在30 ℃ 150 r·min-1條件下發酵96 h，發酵后粗纖維素酶液的CMCA 如圖3（b）所示，CMCA 隨著pH 值的增加而增大，至pH 值7.5 時達到最大，為5.31 U·mL-1；菌株DT13接種在初始pH值為7.5 的發酵培養基中，在不同溫度150 r·min-1條件下發酵96 h，發酵后粗纖維素酶液的CMCA 如圖3（c）所示，CMCA隨著溫度的增加而增大，至40 ℃時達到最高值，為6.56 U·mL-1，溫度繼續增加CMCA 呈下降的趨勢。綜合試驗結果，菌株DT13 發酵產纖維素酶的較合適的單因素條件分別為發酵時間96 h、初始pH 值7.5、發酵溫度40 ℃。

圖3 菌株DT13 發酵試驗單因素對纖維素酶CMCA 的影響圖

2.3.2 正交試驗設計結果

根據單因素試驗結果，選擇A發酵時間（84 h、96 h、108 h）、B初始pH值（7.0、7.5、8.0）、C發酵溫度（37 ℃、40 ℃、43 ℃）設計3 因素3 水平正交試驗。發酵結束后，測定各組合得到的粗酶液的CMCA，試驗結果如表2 所示。影響發酵產纖維素酶CMCA 的3 個因素排序為初始pH 值（B）＞發酵溫度（C）＞發酵時間（A），產酶的最佳組合為A2B1C2。

表2 菌株DT13 產纖維素酶CMCA 正交試驗結果分析表

2.3.3 驗證試驗

正交極差分析表中，A3B1C2培養組合所產的CMCA值最高，選取A2B1C2、A3B1C2發酵組合進行驗證試驗，結果如表3 所示，組合A2B1C2所產生的粗酶液的CMCA 約為6.69 U·mL-1，顯著高于組合A3B1C2。因此，確定菌株DT13 的最佳培養組合為A2B1C2，即初始pH值7.0、發酵溫度40 ℃，發酵時間96 h。

表3 正交設計組合驗證試驗結果表

3 結論

本研究從森林腐熟土壤中篩選出一株產纖維素降解菌DT13，經形態學、革蘭氏染色和分子生物學鑒定確定DT13 為枯草芽孢桿菌（B.subtillis）。通過單因素試驗和正交試驗設計，對菌株DT13 發酵產纖維素酶的條件進行研究，確定菌株DT13 的最佳發酵條件為初始pH 值7.0、發酵溫度40 ℃、發酵時間96 h。