鴨病毒性腸炎的研究進展

陳玉珍 永安市動物疫病預防控制中心 福建永安 366000

鴨病毒性腸炎（DVE）是由鴨瘟病毒（DPV）引起的一種急性發熱性傳染病，通過接觸傳播，與敗血癥相關，以血管損傷、組織出血、消化道黏膜損傷和腸黏膜病變為特征。傳播迅速，發病率和病死率都很高[1]。全球DP于1923年在荷蘭首次暴發。隨后DP于1973年在南達科他州暴發，43 000羽鴨和鵝陸續發病、死亡，流行病學調查表明野生鳥類和農場家禽不僅攜帶相同DPV，且病毒學和血清學均為陽性，荷蘭和南達科他州DP的暴發并不是該區域所特有，在世界范圍內皆有發生，如英國、印度和加拿大等[2]。1957年我國首次DP發生于廣東省，之后武漢、上海、浙江、江蘇、廣西、湖南和福建等地陸續發現，至20世紀80年代傳播到東北各省[3]。值得注意的是，除鵝和鴨外，自由放養的水禽也是DPV感染攜帶者，之前的研究對132個野外分離株的分析中發現，在96羽禽類中存在DPV（72.7%），包括野鴨（Anas platyrhynchos）、疣鼻天鵝（Cygnus olor）、灰背雁（Anser anser）、苔 原 豆 雁（Anser fabalis）和 灰 鷺（Ardea cinerea）[4]。隨著傳染源不斷擴增，對DP的防治顯得尤為重要。

1 DPV基因組結構和分子生物學研究

1.1 DPV基因組結構DVE的病原是DPV或Anatid herpesvirus-1。根據國際病毒分類委員會（ICTV）最近的分類，DPV被分類為Mardivirus屬，與HSV-1（單純皰疹病毒1型）同屬于皰疹病毒科的a-皰疹亞科[5]。DPV有囊膜，遺傳物質為雙股DNA，呈對稱的二十面體，具有典型a-皰疹病毒的特征。病毒基因組大小為158～162 kb，由一個唯一的長獨特區（UL）、一個唯一的短獨特區（US）和兩個倒置重復序列（IRS和TRS）[6]組成。共有78個ORF編碼潛在的功能蛋白，在這些ORF中，由10個和68個ORF分別編碼結構蛋白和非結構蛋白。相對于皰疹病毒科其他成員來說，DNA復制的持續時間長是DPV的特征之一，說明它們在宿主細胞內持續性繁殖。皰疹病毒通過病毒體糖蛋白尖峰附著在宿主細胞受體上，DPV進入宿主細胞內時，會涉及多種糖蛋白[7]。結合后，包膜與宿主細胞的質膜融合，核衣殼進入宿主細胞的細胞質。DNA和蛋白質復合物從核衣殼中分離出來，進入細胞核。然后它會迅速關閉宿主細胞的大分子合成。逐步開始感染，DPV基因組開始三個階段依次表達，即：即刻早期（IE）、早期和晚期。與DPV同屬的HSV-1的即可早期轉錄是由反式作用因子VP16介導的，與即早（IE，α）基因啟動子上游的特定順式作用元件結合，促進IE基因的轉錄，即α-TIF。近期發現其同源物pUL48被確定為DPV的α-TIF。并且pUL46和pUL47顯著促進pUL48的轉錄激活，從而增強pUL48的轉錄激活功能，協同促進病毒基因表達[8]。之后IE基因在感染時立即轉錄。早期基因在病毒DNA復制之前以IE蛋白依賴的方式轉錄，晚期基因的轉錄始于DNA和病毒蛋白的合成開始后。病毒DNA的復制發生在細胞核中，新合成的DNA盤繞成預先形成的未成熟衣殼。病毒粒子DNA的成熟是通過核衣殼和核包膜內層的衣殼化發生。隨后，病毒粒子通過核膜出芽而完全包裹。成熟后，病毒粒子在宿主細胞的細胞質內積聚，并通過細胞溶解或胞吐作用釋放[9]。

1.2 DPV分子生物學研究 對DPV的研究相對緩慢，與皰疹病毒科其他成員的研究仍有較大差距。Plummer等[10]用HindⅢ消化DPV，得到一個約1.95 kb的DNA片段，發現該片段與水痘帶狀皰疹病毒UL6和UL7基因部分同源。隨后，郭霄峰等[11]發現鴨瘟病毒北京株的UL6和UL7基因在不同的毒株中高度保守。隨著技術的發展，多個DPV基因已被成功克隆并進行序列分析：張馨月等[12]通過對鴨瘟強弱毒株TK基因及相鄰UL24基因進行克隆、測序及分析，發現鴨瘟病毒強毒株和弱毒株TK基因和UL24基因5′端982 bp核苷酸序列均完全一致，與其他鴨瘟病毒毒株的同源性達99.4%以上，表明鴨瘟病毒TK基因高度保守，研究結果為構建鴨瘟病毒TK基因缺失的轉移載體奠定了基礎，同時也為建立重組DP活載體疫苗創造了條件。程安春等[13]應用鳥槍法成功構建了DPV基因文庫，獲得大于100 bp的ORF共187個，并初步克隆和鑒定DPV的核衣殼蛋白基因。羅丹丹等[14]利用靶基因步移PCR法獲得DPV部分基因的完整ORF，研究結果均指向DPV UL47、UL28應歸類為a-皰疹病毒亞科的禽類皰疹病毒科。李玉峰等[15]分別用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI 5種限制性內切酶消化鴨瘟病毒基因組DNA，獲得5個UL片段基因，分別為UL33、UL34、UL45、UL46和UL47，經比較發現它們與α-亞科皰疹病毒其他成員相應基因具有不同程度的同源性。隨著對DPV基因組的深入研究，對其所發揮的功能也逐漸完善。張樹棟[16]利用原核表達系統表達了DPV gB抗原優勢區（N端111-190aa），該重組蛋白質具有抗原性，可作為DVE抗體檢測的候選抗原；同時制備了相應的兔源多克隆抗體。藺萌[17]發現DPV gN基因288 bp具有特異性，可以作為區別DPV與其他病毒的特異基因，同時建立了基于DPV gN基因的PCR擴增檢測方法，并應用于DVE的臨床診斷（最低可以檢測到0.1 ng/μL）。崔立虹等[18]在對DPV-gC糖蛋白胞外區的優勢抗原表位、對DPV-gC基因進行分段克隆并構建重組表達載體，發現DPV-gC糖蛋白優勢抗原表位為第73～88位氨基酸，為DPV-gC糖蛋白具體功能區的研究、診斷試劑及表位疫苗的研制奠定了基礎。

2 DPV的流行現狀

鴨瘟于1923年在荷蘭首次被發現，隨后，DP在世界范圍內廣泛流行。DPV可感染所有年齡段家鴨，發病率和病死率在5%～100%。DP的潛伏期為3～8 d，家鴨在感染后的臨床癥狀為抑郁、共濟失調、呼吸困難、眼瞼腫脹、頭頸部腫脹、腹瀉、糞便白綠色、泄殖腔黏膜水腫、綠色假膜覆蓋物等。病理組織樣本發現患鴨頭部和頸部腫脹的皮膚中觀察到淡黃色透明液體，免疫器官有出血點、壞死灶和潰瘍，腦部有血管套等典型特征[19]。DPV傳播能力廣泛，可通過直接和間接途徑傳播，家鴨與野生水禽在傳播DPV上具有雙向性[20]。由于水禽生存在水生環境中，因此DPV主要通過水傳播；大多數家鴨的DP暴發區域，通常是在野生水禽的開放水域附近，患鴨感染后可經糞便和口分泌物長期排毒[21]，從而使得整個環境受到DPV污染，且DPV難以徹底消滅。威斯康星州一處鴨場暴發DP四年后，對該鴨場的家鴨泄殖腔拭子進行檢測，仍然可以檢測到DPV[22]。不僅如此，自由飛行的鳥類也是DPV的傳播途徑之一，據調查，當H5N1亞型禽流感病毒向西部傳播時，鳥類在疫情暴發期間，死亡率14%～81%，成年鳥類死亡率較高，隨即對當地的水禽進行鴨瘟病毒測試，發現鴨和鵝的器官均分離出皰疹病毒，并被確定為DPV[22]。鴨、鵝康復后，DPV可潛伏在三叉神經節、外周血淋巴細胞和淋巴組織中，可攜帶DPV長達4年，充分說明DP潛伏期持續時間長，難以根除該病的發生。近幾年，DP在我國各地起伏性發生，通過長期監測該病一年四季均可發生，尤其在春秋兩季多發，說明DP還可通過其他途徑傳播感染。此外，空氣傳播和垂直傳播也是該病的主要傳播方式[23]。

3 DPV與宿主天然免疫應答

先天性免疫是以天然免疫的方式抵抗外來病毒的入侵。可非特異性對病原的識別受體（PRR）誘導產生I型干擾素（IFN）和炎性細胞因子，使機體在發育過程中逐漸形成一系列的防御體系。其中，PRR包括Toll樣受體（TLR）、NOD樣受體（NLR）和RIGI樣受體（RLR）等。不同位置PRR所發揮的功能不同，TLR是跨膜蛋白I家族的成員，位于細胞表面和內膜中，負責識別配體；NLRs是PRR家族另一組受體，位于細胞質中，識別直接入侵或者間接進入細胞內的病原。RLRs大多位于體內的細胞質中，也有研究表明RLR可能位于細胞核，負責識別機體內引起的絕大多數病毒感染[24]。在鴨中發現的TLRs，包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR15。體內試驗表明，DPV感染1 d后，TLR2在大腦中增加了132.6倍，TLR21在脾臟增加100倍以上，激活的TLR21和TLR2募集接頭蛋白，分別誘導MyD88在腦和脾中表達量升高，激發下游信號通路，產生Ⅰ型干擾素，抵御DPV感染。此外，TLR21在調節宿主對外來入侵的防御起重要作用，是哺乳動物TLR9的功能同源物[25]。TLR21可以識別未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤寡脫氧核苷酸（CpG-ODN），并激活NF-κB免疫信號通路。而TLR9在小鼠中也可以通過由單個CpG基序組成的CpG-ODN激活。綜上所述TLR9和TLR21均在DPV感染的宿主防御中發揮重要作用。RLR家族的3個成員RIG-I、MDA5和LGP2在大多數組織中表達，當DPV感染鴨胚成纖維細胞（DEF）時，DPV感染持續時間和細胞內病毒DNA不斷增加，與此同時，IFN-β和RIG-I也不斷上調，體內和體外都激活IFN-β和RIG-I[26]。RIG-I抑制了DPV感染，同時在MDA5過度表達的DEF細胞中，DPV感染被顯著抑制，而siRNA對MDA5的擊倒顯著增強了DPV的生長。DPV感染后，MDA5的轉錄水平在體內和體外都受到上調。在抗病毒信號傳導方面，MDA5與LGP2之間存在聯系，LGP2在MDA5特異性增強和干擾之間充當濃度依賴開關。這些結果表明，MDA5限制了DPV復制，LGP2在MDA5介導的抗DPV活性中起著關鍵作用[27]。以上研究發現，RIG-1、MDA5和LGP2參與了宿主對DPV的天然免疫應答。MAVS的過度表達顯著降低DPV的復制，敲除MAVS，則IFN-β、OAS和IL-2下調，表明MAVS顯著降低調節細胞因子的激活[28]，除了TLR和RLR外，其他PRRS在應對微生物感染方面也起著至關重要的作用。

4 DP的診斷與防控

病毒分離與鑒定是診斷病毒性疾病的核心標準，通常采取患鴨血液、肝、脾或腎作為分離病毒的樣品，經研磨、離心、過濾后接種到雞胚或鴨胚，或者CEF、MDEF、DEF細胞系中進行培 養。其中，DEF細胞對鴨病毒性腸炎疫苗株分離率最高[29]。強毒性DPV會產生明顯的細胞病變，通過電鏡超薄切片檢查細胞培養物，發現接種病毒12 h后，在細胞漿內可觀察到帶囊膜的成熟病毒粒子，且染色檢查發現大量核內包涵體[30]。隨著分子生物學技術的發展，已開發出大量的病原學（ISH、PCR、LAMP和PCRDHPLC技術等）和血清學（HCT、IFA、ELISA、GICA等）檢測方法，其中PCR技術是廣泛應用的病原檢測方法，適用于流行病學調查和臨床診斷。近幾年，常結合多種方法檢測DPV，如從DPV基因組中根據不同目的選擇基因片段，采用原核表達技術獲得重組蛋白并制備相應抗體，再利用IFA或HCT技術檢測組織中的DPV[31]，隨著診斷方法不斷完善，鴨瘟也將會得到更好控制。由多殺性巴氏桿菌引起的禽霍亂和鴨瘟病毒引起的鴨瘟，已被認識和研究多年，但仍然是影響鴨的重要疾病。對此，疫苗接種是預防和控制DP的主要手段，疫苗分為滅活苗和弱毒苗兩大類，通常國內使用弱毒苗對鴨群進行免疫接種。但潛伏期和間歇性排毒是弱毒苗使用中最重要的制約因素之一，完全避免病毒基因組DNA是解決該問題的唯一可能方法。病毒載體疫苗的優勢，是能夠區分受感染與接種疫苗的宿主[32]。gD DNA和蛋白質組合的小鼠模型中對DPV攻擊感染后產生中和抗體，誘導了淋巴細胞增殖反應及IL-4、IL-12和IFN-g產生，為DP的低疫苗接種率和減少鴨DP暴發提供了很好的解決方案。另外，含有多發性巴氏桿菌菌株X-73重組外膜蛋白H（rOmpH）和鴨瘟減毒活疫苗的組合疫苗，不僅不會影響鴨群的抗體反應，同時保護鴨群免受實驗性多球菌感染[33]。但應防止細菌或病毒基因組不穩定，導致難以產生重組病毒。通過NHEJ/CRISPR-Cas9系統對DPV基因組進行編輯，以在UL55-LORF11和UL44/44.5中包含和表達特定的細菌抗原ompH-V5基因插入且穩定該基因，不僅保護鴨免受病毒和細菌的侵害，還有一定的預防其他疾病的防護作用，有助于控制和防止鴨發生病毒與細菌共感染[34]。對于開發DPV載體重組疫苗，需要進一步進行動物試驗，以評估該重組疫苗的功效和保護作用。

5 展 望

長期以來，皰疹病毒感染和潛伏期一直是防控DPV感染最重要的問題，隨著DP疫苗的上市，病毒傳染源和傳播途徑得到有力控制。但在全國范圍內DPV出現零星性流行并伴隨發生基因組變異，對DPV毒株全基因組測序分析發現，臨床上出現多株新的變異毒株。重組DNA會成為DP疫苗研究的新技術，但對變異毒株是否具有免疫保護力，還需要進一步研究。此外，DPV的潛在宿主可能是長期病毒攜帶者，容易將感染延續到環境中，徹底去除傳染源也是要攻克的難題，同時潛伏感染與細胞凋亡之間是否存在關聯也需要進一步研究。