黑果枸杞 LrPIP1基因的克隆鑒定及外施水楊酸對(duì)其在干旱脅迫下表達(dá)的影響

馬永慧，李 進(jìn)，可 靜

(1.新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830054；2.烏魯木齊市十三中學(xué)，烏魯木齊 830000)

水通道蛋白(Aquaporins，簡(jiǎn)稱(chēng)AQPs)即水孔蛋白，是主要內(nèi)在蛋白(membrane intrinsic proteins, MIPs)超家族的成員之一[1]，正調(diào)控水分和其他小分子物質(zhì)如甘油、CO2、NH3、尿素、硼和H2O2等的跨膜運(yùn)輸[2-3]。目前在煙草(NicotianatabacumL.)、白沙嵩(ArtemisiasphaerocephalaKrasch.)、水稻(OryzasativaL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、番茄(SolanumlycopersicumMill.)等植物中均證實(shí)了水通道蛋白的存在[4-6]。植物體內(nèi)水分的長(zhǎng)距離運(yùn)輸、細(xì)胞滲透平衡的調(diào)控和氣孔運(yùn)動(dòng)等過(guò)程都有水通道蛋白的參與[7]。AQPs誘導(dǎo)氣孔閉合推測(cè)是通過(guò)改變植物葉細(xì)胞的內(nèi)外滲透勢(shì)，如煙草NtAQP1基因在質(zhì)膜以及葉綠體內(nèi)膜上表達(dá)，對(duì)CO2電導(dǎo)率有一定影響[8]；向日葵(HelianthusannuusL.)保衛(wèi)細(xì)胞中SunTIP7基因的表達(dá)量隨著氣孔關(guān)閉而增多[9]。在植物生命進(jìn)程中，水通道蛋白有其獨(dú)特的表達(dá)模式響應(yīng)非生物脅迫，如通過(guò)過(guò)量表達(dá)AQPs基因提高植物的抗旱耐鹽性[10-11]。

黑果枸杞為茄科枸杞屬落葉小灌木，是優(yōu)秀的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，可作為水土保持植物廣泛種植，其果實(shí)富含花色苷、總黃酮、多糖等物質(zhì)，具有降血脂、抗氧化等作用，并已有相關(guān)提取工藝報(bào)道[12]。黑果枸杞漿果資源已具有出一定的市場(chǎng)潛力，但黑果枸杞生長(zhǎng)環(huán)境嚴(yán)苛，對(duì)其生態(tài)保護(hù)較少，加之人們過(guò)度開(kāi)采等嚴(yán)重限制了黑果枸杞的生長(zhǎng)、結(jié)實(shí)，人工種植也同樣面臨環(huán)境以及技術(shù)方面相關(guān) 問(wèn)題。

前期研究顯示干旱脅迫會(huì)破壞黑果枸杞葉細(xì)胞中葉綠體和線粒體內(nèi)膜致使氣孔關(guān)閉[13]，外源SA可緩解干旱脅迫造成的生理傷害，這些宏觀指標(biāo)的變化是否與其中PIP1基因表達(dá)量的變化有關(guān)？基于該問(wèn)題，本研究從黑果枸杞葉片中克隆PIP1基因，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析PIP1基因在干旱脅迫以及施加外源水楊酸下的表達(dá)情況，以期為探索黑果枸杞耐旱分子機(jī)理及耐旱性改良等提供理論 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)種子采自新疆博湖縣，試驗(yàn)材料于新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)。

選用飽滿成熟種子置于40 ℃水浴鍋內(nèi)預(yù)種，進(jìn)行48 h的打破種子休眠處理，消毒后的種子放置適宜環(huán)境(12 h光照/12 h黑暗，25 ℃晝溫/ 15 ℃夜溫)培育成幼苗，每盆5株進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。黑果枸杞幼苗長(zhǎng)至15 cm左右，分別對(duì)其進(jìn)行干旱脅迫與外施水楊酸誘導(dǎo)處理。

干旱脅迫處理：每個(gè)處理花盆內(nèi)均有烘干土壤1 kg，土壤體積質(zhì)量1.23 g·cm-3，田間持水量為20.16%。根據(jù)水分梯度設(shè)計(jì)4個(gè)水平，分別是正常對(duì)照CK(85%～90%)、輕度干旱脅迫D1(RWC 60%～65%)、中度干旱脅迫D2(RWC 40%～45%)、重度干旱脅迫D3(RWC 20%～25%)，干旱脅迫處理持續(xù)28 d，每個(gè)水平均設(shè)定3次重復(fù)。黑果枸杞幼苗均在同一環(huán)境下，維持正常的光照以及空氣流通。干旱脅迫采取不澆水自然消耗法，達(dá)到設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)后，干旱脅迫處理開(kāi)始。于每天的20:00稱(chēng)量，待土壤持水量達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，摘取黑果枸杞葉片迅速進(jìn)行液氮速凍處理，-80 ℃保存，備用。水楊酸處理：水楊酸(salicylic acid, SA)為分析純，處理濃度為 0.1、0.5 mmol·L-1。試驗(yàn)第1、3、5天的 20:00，處理組分別噴施20 mL的0、0.1、0.5 mmol·L-1SA藥液[13]，每個(gè)處理3次重復(fù)，共36個(gè)處理。

1.2 方 法

1.2.1PIP1基因的克隆 根據(jù)文獻(xiàn)獲知的PIP1基因序列，將其保守域在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，獲得一個(gè)與植物中PIP1基因序列同源性較高但功能未知的mRNA序列。使用軟件Primer premier 5設(shè)計(jì)引物，(5′-F:CGCTCTGTTTCTTTCACTGCC-3′; R:5′-GGGGTGGTTGATAACACTTGCT-3′)；使用OMEGA公司的Plant RNA Kit試劑盒提取黑果枸杞葉片總RNA；使用OMEGA公司的Gel Extraction Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；PCR擴(kuò)增以黑果枸杞葉片cDNA為模板進(jìn)行，退火溫度設(shè)定為 55 ℃。產(chǎn)物經(jīng)回收后連接至pMD-18T載體(TaKaRa)，送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2LrPIP1生物信息學(xué)分析 使用NCBI網(wǎng)站提供的在線分析工具ORF Finder(http:// ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對(duì) LrPIP1蛋白進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析，確定序列的起始密碼子、終止密碼子和開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度，確保是完整的LrPIP1基因；使用BLAST功能對(duì)黑果枸杞LrPIP1基因翻譯出的氨基酸序列進(jìn)行分析，使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì) LrPIP1蛋白進(jìn)行特性預(yù)測(cè)分析；使用ProtScale(http://web.xpasy.rg/protscale/)對(duì)其親疏水性序列譜進(jìn)行繪制，圖像可直觀地反映出水環(huán)境下 LrPIP1蛋白質(zhì)的折疊情況；使用軟件KinasePhos對(duì)其磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；使用NetNES分析信號(hào)肽位點(diǎn)；使用NPSA在線分析工具(http://npsa-prabi.ibcp.fr/)中MRLC方法對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析及同源建模，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 表達(dá)模式分析 根據(jù)黑果枸杞PIP1基因序列設(shè)計(jì)引物，F(xiàn):5′-GCATTTCTGGCGGTCACA-3′; R:5′-TGTAACCA GGTGCCACAAAGT-3′。以18sRNA作為內(nèi)參(F:5′-GCGAAATGCGATAA GTAGTGTG-3′; R:5′-GCAA TGTGCGTTCAAAGATTC-3′)[14]。不同處理下的黑果枸杞葉片cDNA為模板，反應(yīng)體系為2 × Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1的PCR特異引物F 0.5 μL，10 μmol·L-1的PCR特異引物R 0.5 μL，加水至總體積為18 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s(收集熒光)。為建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，待擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按95 ℃ 10 s；60 ℃ 60 s； 95 ℃ 15 s；并從60 ℃緩慢升溫到99 ℃(儀器自動(dòng)進(jìn)行-Ramp Rate為0.05 ℃·s-1)。每個(gè)反應(yīng)3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，并計(jì)算PIP1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析及圖表處理 使用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算整理以及圖表制作，采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同脅迫間進(jìn)行One Way ANOVA和Duncan’s多重比較 (P<0.05)以及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞 LrPIP1基因的克隆與序列分析

使用同源克隆的方法，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，從黑果枸杞葉片中獲得一個(gè)功能未知的PIP1基因，命名為L(zhǎng)rPIP1(GenBank登錄號(hào)為KY230166)，該基因完整的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為852 bp。使用Prot-Param軟件對(duì) LrPIP1蛋白保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明在101～109氨基酸處含有1個(gè)與MIPs蛋白家族保守信號(hào)序列HINPAVTFG相匹配的序列及植物質(zhì)膜水通道蛋白的特征序列GGGANFVQPG和TGI，研究發(fā)現(xiàn) LrPIP1蛋白有6個(gè)跨膜域，是典型的水通道蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，證明 LrPIP1蛋白為跨膜蛋白且具有典型的水通道蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 黑果枸杞 LrPIP1基因保守域分析

使用CDD軟件分析黑果枸杞LrPIP1基因序列的保守域[15]，結(jié)果如圖1所示，黑果枸杞LrPIP1基因具有水通道蛋白結(jié)構(gòu)域，其中核酸結(jié)合區(qū)域較為保守，是水通道蛋白，屬于MIPs大家族。

圖1 LrPIP1基因保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of conserved domain prediction of L. ruthenicum LrPIP1

2.3 黑果枸杞 LrPIP1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和親疏水性分析

使用ProtParam軟件分析發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞LrPIP1基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C1401H2163O364S11，分子質(zhì)量為30 268.46 u，理論等電點(diǎn)pI為9.36，LrPIP蛋白含有15個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp + Glu)和22個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(Arg + Lys)，消光系數(shù)為41 035。脂肪指數(shù)為102.72。總平均親水性為0.506，證明 LrPIP1蛋白是疏水性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)為31.87，證明 LrPIP1蛋白穩(wěn)定性較好。使用ProScale工具預(yù)測(cè) LrPIP1蛋白的親水性和疏水性，其他設(shè)置采用默認(rèn)，選信號(hào)最顯著的Kyte & Doolittle氨基酸標(biāo)度值，表明LrPIP1有9個(gè)低分值峰，是疏水蛋白。

圖2 黑果枸杞 LrPIP1蛋白親水性和疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of hydrophobicity and hydrophily of L. ruthenicum LrPIP1

2.4 黑果枸杞 LrPIP1蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

應(yīng)用KinasePhos對(duì)黑果枸杞 LrPIP1蛋白進(jìn)行磷酸化分析，結(jié)果如圖3，表明黑果枸杞 LrPIP1蛋白在第18位含有一個(gè)酪氨酸，絲氨酸位于第98、117、194、278位，推測(cè)其可能是LrPIP1的潛在磷酸化位點(diǎn)。

圖3 黑果枸杞 LrPIP1蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Putative phosphorylation sites of L. ruthenicum LrPIP1 by KinasePhos prediction

2.5 黑果枸杞 LrPIP1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)和分析

使用基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(Neural Networks models)和隱馬可夫模型(Hidden Markov Models)的NetNES1.1 server，對(duì) LrPIP1蛋白中富含亮氨酸的核輸出信號(hào)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[16]。結(jié)果如圖4所示， LrPIP1蛋白于序列第56位有富含亮氨酸的核輸出信號(hào)。

圖4 黑果枸杞 LrPIP1蛋白核輸出信號(hào)預(yù)測(cè)Fig.4 Pediction of nuclear export signal of L. ruthenicum LrPIP1

2.6 黑果枸杞 LrPIP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用NPSA在線分析工具提供的MRLC方法對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示(圖5)，該蛋白由43.46%的 α 螺旋，14.13%的 β 折疊和42.40%的無(wú)規(guī)則卷曲3種形式構(gòu)成。其N(xiāo)端主要由無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)分布，C端主要由 α 螺旋分布。

圖5 黑果枸杞LrPIP1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted secondary structure of L. ruthenicum LrPIP1

2.7 黑果枸杞LrPIP1三級(jí)結(jié)構(gòu)模型分析

使用SWISS-MODEL對(duì) LrPIP1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)做同源建模[17]，建模方式采用自動(dòng)方式。首先將蛋白質(zhì)序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示LrPIP1與數(shù)據(jù)庫(kù)中Spinach aquaporin SoPIP2;1的結(jié)構(gòu)最相似(82.92%)；其次對(duì)目標(biāo)序列和模板序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，將完全一致的氨基酸序列區(qū)域建立一致的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并將其疊和；根據(jù)網(wǎng)絡(luò)綜合服務(wù)器算法構(gòu)建蛋白質(zhì)模型，先找出主鏈結(jié)構(gòu)，再進(jìn)行側(cè)鏈建模，并通過(guò)能量計(jì)算優(yōu)化結(jié)構(gòu)，最后使用全局法中的QMEANscore4記分值估算該模型的建模質(zhì)量。

構(gòu)建的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)如圖6所示，可信度值較高為0.56，模板序列方法使用X-ray，分辨率為2.10 ?，比對(duì)的范圍在第23～277個(gè)氨基酸，覆蓋度達(dá)到99%。

圖6 LrPIP1蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.6 Three-dimensional structure model of LrPIP1

2.8 同源性分析和基因樹(shù)構(gòu)建

將 LrPIP1蛋白質(zhì)序列與馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、煙草(NicotianatabacumL.)等茄科植物和擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、蘋(píng)果(MalusdomesticaB.)、葡萄(VitisviniferaL.)等雙子葉植物，以及水稻(OryzabrachyanthaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)、甘蔗(SaccharumofficinarumL.)等單子葉植物的水通道蛋白PIPs進(jìn)行多序列比對(duì)。BLAST同源性分析結(jié)果顯示(圖1)，黑果枸杞LrPIP1基因編碼氨基酸序列與多種植物相比均具有較高的同源性，其中與馬鈴薯的同源性高達(dá)99%；使用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，選取比對(duì)結(jié)果中保守區(qū)段較為相近的22種蛋白質(zhì)序列進(jìn)行構(gòu)建基因樹(shù)的準(zhǔn)備；使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；對(duì)于參數(shù)選項(xiàng)設(shè)置：為了確保基因樹(shù)分枝的穩(wěn)定，選擇“Bootstrap method”的檢驗(yàn)方法，其他設(shè)置采用默認(rèn)，重復(fù)1 000次。如圖7所示，這22種不同物種的水通道蛋白基因大致聚合為4大類(lèi)群，其中黑果枸杞LrPIP1與同為枸杞屬的馬鈴薯親緣關(guān)系最近，聚為一類(lèi)，與擬南芥、甘蔗的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖7 不同植物PIPs蛋白質(zhì)序列基因樹(shù)Fig.7 Phylogentic tree constructed by PIPs protein sequence in plant

2.9 黑果枸杞 LrPIP1基因干旱脅迫和施加外源水楊酸響應(yīng)的Real-time PCR分析

本試驗(yàn)探究黑果枸杞LrPIP1基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況，檢測(cè)LrPIP1基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)量。以黑果枸杞葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，18S作為內(nèi)參基因。結(jié)果如圖8所示，干旱脅迫下黑果枸杞LrPIP1基因相對(duì)表達(dá)量在不同處理下具有明顯差異。輕度干旱脅迫可誘導(dǎo)LrPIP1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào) (P<0.05)，LrPIP1基因的快速上調(diào)，推測(cè)可能是黑果枸杞響應(yīng)干旱脅迫從而大量表達(dá) LrPIP1蛋白，以此攝入更多水分從而適應(yīng)干旱，增強(qiáng)抗旱性；中度脅迫D2時(shí)，LrPIP1基因的相對(duì)表達(dá)量較CK有一定程度的上調(diào)，但相較于D1表現(xiàn)為顯著下降(P<0.05)；重度脅迫D3時(shí)，LrPIP1基因相對(duì)表達(dá)量較D2有顯著性上升(P<0.05)。前有研究證明外源SA可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)H2O2積累，誘導(dǎo)PIP1在細(xì)胞內(nèi)在化定位進(jìn)行重定位，調(diào)節(jié)質(zhì)膜滲透性從而應(yīng)答環(huán)境脅迫[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源0.1 mmol·L-1SA時(shí)，隨著脅迫程度加深，LrPIP1基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)線性遞增且差異顯著(P<0.05)；外源噴施0.5 mmol·L-1SA時(shí)，LrPIP1基因相對(duì)表達(dá)量較CK顯著增加 (P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明LrPIP1基因的相對(duì)表達(dá)受到外源SA的影響，推測(cè)外源SA可引起LrPIP1基因在細(xì)胞內(nèi)的重定位，使其在重度脅迫下大量表達(dá)。綜合表明，輕度脅迫下黑果枸杞具有一定的耐逆性，重度脅迫下外源SA可誘導(dǎo)LrPIP1基因大量表達(dá)，增強(qiáng)黑果枸杞的抗旱性。

不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

3 討 論

干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響黑果枸杞的生長(zhǎng)、結(jié)實(shí)，從而對(duì)黑果枸杞的產(chǎn)量與品質(zhì)有一定影響。因此，探究黑果枸杞抗逆基因，培育抗逆性良好的黑果枸杞品種至關(guān)重要。干旱脅迫影響黑果枸杞的生長(zhǎng)發(fā)育的原因在于能夠引起黑果枸杞細(xì)胞失水，水是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要因子，水通道蛋白特異的水分運(yùn)輸?shù)耐ǖ溃瑢?duì)于植物體內(nèi)水分的長(zhǎng)距離運(yùn)輸和細(xì)胞水分的跨膜運(yùn)輸具有一定促進(jìn)作用，可調(diào)節(jié)植物體內(nèi)和細(xì)胞間水分平衡。因此，研究PIP在黑果枸杞響應(yīng)干旱脅迫方面具有重要意義。

該研究通過(guò)同源克隆的方法，從黑果枸杞葉中克隆獲得黑果枸杞水通道蛋白基因LrPIP1(登錄號(hào)：KY230166)，預(yù)測(cè)其蛋白的保守域顯示，LrPIP1基因有6個(gè)跨膜區(qū)，并且含有MIPs蛋白家族保守信號(hào)序列和質(zhì)膜水通道蛋白的特征序列，這是MIPs大家族和質(zhì)膜水通道蛋白的最基本特征。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，LrPIP1基因位于質(zhì)膜上，推測(cè)可能是與細(xì)胞水分運(yùn)輸功能有關(guān)，使其更高效地進(jìn)行細(xì)胞水分的調(diào)控。LrPIP1與其他植物PIPs蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性很高，證明 LrPIP1蛋白為質(zhì)膜水通道蛋白。在LrPIP1的N端和C端都分布著高度保守的NPA序列，這種高度保守的結(jié)構(gòu)是水通道蛋白家族的基序，是其功能密切相關(guān)的[19]。

LrPIP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其是由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示 LrPIP1蛋白以4個(gè)單體形成同源四聚體的形式存在，這種高度保守的結(jié)構(gòu)對(duì)保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及高效準(zhǔn)確地行使功能具有重要生物學(xué)意義。蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后重要的修飾方式，在調(diào)控蛋白質(zhì)的活力與功能、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中具有重要作用。Maurel等[20]、Van Wilder等[21]研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化是生物體內(nèi)AQPs調(diào)節(jié)活性的方式，植物體內(nèi)的AQPs磷酸化主要發(fā)生在位于N端或C端的絲氨殘基上。在本研究中， LrPIP1蛋白磷酸化位點(diǎn)結(jié)果分析顯示其主要分布在絲氨酸上，有4個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，推測(cè)其可能是蛋白質(zhì)磷酸化的作用位點(diǎn)。

聚類(lèi)分析結(jié)果表明，黑果枸杞LrPIP1基因與同科的馬鈴薯PIPs遺傳距離最近，而與單子葉植物甘蔗、玉米等親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，此聚類(lèi)結(jié)果符合遺傳進(jìn)化的關(guān)系，親緣關(guān)系近的物種同源性較高，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的物種同源性則較低。

前有研究證明水通道蛋白可調(diào)控植物水分運(yùn)輸，水分脅迫誘導(dǎo)PIPs的上調(diào)表達(dá)也可抑制表達(dá)[22]。Barrieu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在輕度干旱脅迫下，花椰菜(BrassicaoleraceaL. var.BotrytisL.)細(xì)胞中水通道蛋白BobTIP26-1基因在失水、復(fù)水中都具有調(diào)控作用；Mahdieh等[24]研究發(fā)現(xiàn)，煙草NtPIP1;1和NtPIP2;1基因的轉(zhuǎn)錄水平在干旱脅迫下明顯下調(diào)，而NtAQP1基因的轉(zhuǎn)錄水平則有所上調(diào)；干旱脅迫下5種蘋(píng)果矮化砧木的水通道蛋白基因PIPs(MpPIP1;1 、MpPIP2;1)，既有上調(diào)表達(dá)，也有下調(diào)表達(dá)[25]；干旱脅迫誘導(dǎo)黃瓜葉細(xì)胞中質(zhì)膜水通道蛋白表達(dá)上調(diào)[26]。香蕉(MusaacuminataL.)葉和根中，MaPIP1;1基因相對(duì)表達(dá)量隨著土壤含水量的減少呈遞增的趨勢(shì)，但在重度脅迫下表達(dá)量下降，低于輕、中度脅迫處理但高于對(duì)照[27]，這與本試驗(yàn)中LrPIP1基因在干旱脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化情況相同。研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞LrPIP1基因在輕度脅迫D1下顯著上調(diào)表達(dá)，中度D2、重度脅迫D3下LrPIP1基因表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照CK。

已有眾多研究證明，植物激素(包括脫落酸、生長(zhǎng)素、水楊酸和赤霉素)可以調(diào)控水通道蛋白的表達(dá)。例如：水稻OsPIP2;6基因表達(dá)受到GA、IAA、ABA的誘導(dǎo)[28]，白樺幼樹(shù)葉中FPS在MeJA和SA處理下表達(dá)上調(diào)[29]。已有研究表明，水楊酸可作為信號(hào)分子協(xié)助AM真菌促進(jìn)水稻多胺代謝，提高水稻低溫抗性[30]；張靜等[31]發(fā)現(xiàn)，外源SA處理下，水稻葉中OsAQP基因表達(dá)上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量是正常對(duì)照CK的2.93倍。目前關(guān)于干旱脅迫下黑果枸杞PIPs基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)外源水楊酸的響應(yīng)相關(guān)研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)外源SA處理可誘導(dǎo)LrPIP1基因的相對(duì)表達(dá)，在輕度脅迫下，外源噴施SA誘導(dǎo)LrPIP1基因表達(dá)下調(diào)，在中、重度脅迫下，SA可誘導(dǎo)LrPIP1基因表達(dá)量上調(diào)，且重度脅迫下上調(diào)最多；與無(wú)外源SA處理情況下干旱脅迫誘導(dǎo)LrPIP1基因表達(dá)量結(jié)果不同，推測(cè)可能是黑果枸杞可以抵御輕度的干旱脅迫，而外源SA誘導(dǎo) LrPIP1蛋白的重定位導(dǎo)致結(jié)果不同，但其具體的調(diào)控機(jī)理還待進(jìn)一步研究。

綜上所述，輕度干旱脅迫下黑果枸杞具有一定的抗旱性，上調(diào)LrPIP1基因以適應(yīng)逆境脅迫；但在中、重度脅迫下，黑果枸杞葉細(xì)胞中LrPIP1基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；外源SA處理可誘導(dǎo)黑果枸杞葉LrPIP1表達(dá)上調(diào)，水楊酸誘導(dǎo)H2O2積累導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生去極化導(dǎo)致細(xì)胞膜的透性改變，引起電導(dǎo)率升高、氣孔關(guān)閉，然而PIPs有轉(zhuǎn)運(yùn)H2O2的能力，從而增強(qiáng)黑果枸杞的耐旱性。關(guān)于水通道蛋白調(diào)控機(jī)理，運(yùn)動(dòng)軌跡以及水楊酸對(duì)其表達(dá)量變化的直接作用機(jī)理等仍需進(jìn)一步研究，以期為該基因在響應(yīng)水分虧缺等非生物脅迫中的深層次機(jī)制提供重要的前期參考。

致謝:感謝新疆師范大學(xué)“十三五”校級(jí)重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)學(xué)科資助。該研究得到新疆師范大學(xué)沙漠藻研究院的大力支持和幫助，在此表示衷心的感謝。