生防菌K3對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的防治效果

梅雪麗，曹 樂，梁玉蓓，李佳珈，曹翠玲

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，合肥 230036)

根結(jié)線蟲(Meloidogyne) 是一種分布范圍廣，多寄生性，對(duì)農(nóng)業(yè)造成極大危害的植物寄生蟲[1]，現(xiàn)已成為世界性主要病原物[2]。根結(jié)線蟲會(huì)導(dǎo)致植物生產(chǎn)成本增加，效益下滑，感染嚴(yán)重時(shí)可造成農(nóng)作物70%的減產(chǎn)，每年損失高達(dá)幾十億美元[3-4]。植物受到根結(jié)線蟲侵害后，出現(xiàn)植株矮小、枝葉萎縮或黃化及生長(zhǎng)發(fā)育不良，甚至導(dǎo)致植株枯萎死亡[5]。

施用化學(xué)藥劑為目前防治根結(jié)線蟲的主要措施，盡管其效果較為顯著，但是長(zhǎng)期大量使用易使根結(jié)線蟲產(chǎn)生抗性，同時(shí)破壞生態(tài)，危害人、畜健康[6-7]。近年來尋求生物防治代替化學(xué)防治成為國內(nèi)外的大趨勢(shì)。陳芳等[8]利用生物有機(jī)肥在田間對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的防治效果進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)施用生物有機(jī)肥后甜瓜根結(jié)線蟲的發(fā)病率明顯降低。梁建根等[9]以番茄為對(duì)象，從浙江大學(xué)農(nóng)場(chǎng)蔬菜大棚分離鑒定出巨大芽孢桿菌K-8菌株，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)番茄感染的南方根結(jié)線蟲的防治效果優(yōu)于化學(xué)藥劑，抑制根結(jié)線蟲的同時(shí)還擁有促進(jìn)植株生長(zhǎng)的作用。高亮等[10]利用粉狀畢赤酵母菌AS2.2514生產(chǎn)出生物菌劑，使得土壤中南方根結(jié)線蟲數(shù)量明顯減少，根系中根結(jié)比率降低。戴梅等[11]發(fā)現(xiàn)，多粘芽孢桿菌、B697菌株、巨大芽孢桿菌和A135菌株等根圍促生細(xì)菌對(duì)南方根結(jié)線蟲的防效分別達(dá)65.4%、68.2%、53.8%和53.8%。關(guān)于根結(jié)線蟲的生物防治，國內(nèi)外有較多的研究成果，但研究對(duì)象大多以黃瓜、番茄等經(jīng)濟(jì)作物為主，對(duì)甜瓜的研究較少，且研究時(shí)關(guān)注較多的是生防菌劑的施用密度，對(duì)生防菌施用的具體時(shí)期研究較少。

謝惠琴[12]研究發(fā)現(xiàn)，生防菌K3能夠促進(jìn)甜瓜生長(zhǎng)，提高果實(shí)品質(zhì)，防治甜瓜根結(jié)線蟲。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，通過研究對(duì)比生防菌K3不同施用量及在甜瓜不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期施用對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的抑制效應(yīng)，以期尋找可以產(chǎn)生最大抑制效應(yīng)的施用量與施用時(shí)期，為生產(chǎn)中如何更加高效地防治根結(jié)線蟲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

生防菌K3由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院曹翠玲教授實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定并保存[12]。K3菌劑有效活菌數(shù)為3.01×1010cfu/g。甜瓜品種為‘西農(nóng)早蜜1號(hào)’(為根結(jié)線蟲敏感型)。

試驗(yàn)于2018年10月-2019年6月在西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。甜瓜種子用1% NaClO消毒5 min，再用75%酒精浸泡 5 min，蒸餾水沖洗3次，平鋪在培養(yǎng)皿中，蓋上潤(rùn)濕紗布，30 ℃下催芽，種子露白后，挑取長(zhǎng)勢(shì)一致的種子，點(diǎn)播在基質(zhì)土中。待甜瓜長(zhǎng)至一葉一心期時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移入不同處理的土壤中，每盆一株甜瓜幼苗。25 ℃、16 h光照/8 h黑暗下培養(yǎng)。試驗(yàn)所用土壤前茬為小麥土，每袋 1 kg干土。裝盆時(shí)，將基肥(硝酸鉀和過磷酸鈣用量分別為0.054 g/kg、0.94 g/kg)拌入土壤，攪拌均勻。移苗30 d后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 根結(jié)線蟲懸液制備 將長(zhǎng)有大量根結(jié)的甜瓜病根用流水沖洗干凈，1%的NaClO浸泡消毒3 min，無菌水漂洗3遍后，切成0.05 cm塊狀，置于無菌培養(yǎng)皿中，加無菌水漫過根部組織塊，30 ℃下孵化24 h后，雙層紗布過濾，收集濾液中的根結(jié)線蟲[13-14]。2 000 r/min離心5 min，制成約1 000條/mL根結(jié)線蟲懸液。在甜瓜移苗3 d后用注射器將根結(jié)線蟲懸液接種至甜瓜根際(2 mL/株)，作為接種處理。

1.2.2 K3不同施用量對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的抑制效應(yīng) 試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，分別為：土壤中不施用菌劑與根結(jié)線蟲(CK0)；土壤中僅接種根結(jié)線蟲(CK1)；土壤中施用K3菌劑4 g/kg并接種根結(jié)線蟲(K3L)；土壤中施用K3菌劑 8 g/kg并接種根結(jié)線蟲(K3H)。每處理重復(fù)3次。K3菌劑在甜瓜移苗前拌入土壤，根結(jié)線蟲接種方法同 “1.2.1”，接種量均為2 000條/株。

1.2.3 K3不同施用時(shí)期對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的抑制效應(yīng) 試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，分別為：土壤中不施用菌劑與根結(jié)線蟲(CK0)；僅接種根結(jié)線蟲(CK1)；接種根結(jié)線蟲并在甜瓜幼苗期(一葉一心期)施用K3菌劑8 g/kg(K3S)；接種根結(jié)線蟲并在甜瓜伸蔓期(四葉一心期)施用K3菌劑8 g/kg(K3V)。每處理重復(fù)3次。根結(jié)線蟲接種方法和接種量同“1.2.2”。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)及方法 甜瓜形態(tài)學(xué)指標(biāo)：選取各處理甜瓜植株，用清水洗凈葉片及根部的泥土，將植株在平臺(tái)上完整展開，測(cè)量株高、根長(zhǎng)、葉面積、地上鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量。每處理重復(fù)3次。

甜瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)：選擇每個(gè)處理完整的根，根據(jù)公式計(jì)算感染率(Infection，I)、根結(jié)指數(shù)和相對(duì)防效，每株植株的根結(jié)線蟲侵染分為 4個(gè)等級(jí)(0：I=0%；1：I=1%～25%；2：I= 26%～50%；3：I=51%～75%；4：I=76%～100%)[15]。

感染率=根結(jié)感染的側(cè)根數(shù)/總側(cè)根數(shù)×100%

根結(jié)指數(shù)=Σ(疾病等級(jí)×相應(yīng)等級(jí)的植株數(shù)量)/(4×植株總數(shù))×100%

相對(duì)防效=(對(duì)照組根結(jié)指數(shù)-處理根結(jié)指數(shù))/對(duì)照根結(jié)指數(shù)×100%

植株抗性酶活性、根系活力：甜瓜幼苗葉片苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、多酚氧化酶(PPO)活性參考曹翠玲等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2007 和SPSS 23對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以LSD 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 K3施用量與施用時(shí)期對(duì)接種根結(jié)線蟲甜瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

甜瓜幼苗在接種根結(jié)線蟲后，其生長(zhǎng)受到抑制(圖1～圖2)。對(duì)甜瓜幼苗的生物量和農(nóng)藝性狀分析表明，在施加K3菌劑并接種根結(jié)線蟲后，甜瓜幼苗株高、根長(zhǎng)、葉片數(shù)、最大葉面積、地上鮮質(zhì)量均降低，而根鮮質(zhì)量顯著增加(表1、表2)，原因?yàn)楦Y(jié)線蟲侵染甜瓜幼苗形成根結(jié)，并且施加K3菌劑后，甜瓜根系較為發(fā)達(dá)，表明K3菌劑能夠促進(jìn)甜瓜根系生長(zhǎng)，從而使根鮮質(zhì)量增加。與CK1相比，甜瓜幼苗株高、根長(zhǎng)、葉片數(shù)、最大葉面積、地上鮮質(zhì)量隨K3菌劑施用量的增加而提高，且K3H處理最高(表1)。在K3施用量為8 g/kg時(shí)，相比于伸蔓期，在甜瓜幼苗期施用K3菌劑對(duì)甜瓜幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)效果較好(表2)。

CK0.對(duì)照；CK1.接種根結(jié)線蟲；K3L.施用K3菌劑4 g/kg并接種根結(jié)線蟲；K3H.施用K3菌劑8 g/kg并接種根結(jié)線蟲。下表1、3、5同此

CK0.對(duì)照；CK1.接種根結(jié)線蟲；K3S.接種根結(jié)線蟲并在甜瓜幼苗期施用K3菌劑；K3V.接種根結(jié)線蟲并在甜瓜伸蔓期施用K3菌劑。下表2、4、6同此

表1 K3不同施用量下甜瓜幼苗的農(nóng)藝性狀及生物量Table 1 Agronomic traits and biomass of melon under different K3 application amounts

表2 不同時(shí)期施加K3后甜瓜農(nóng)藝性狀及生物量Table 2 Agronomic traits and biomass of melon under application of K3 in different periods

2.2 K3施用量與施用時(shí)期對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲防治效果

K3菌劑施用量對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲防治效果試驗(yàn)結(jié)果表明，施加K3菌劑后，甜瓜根系的生長(zhǎng)較發(fā)達(dá)(圖3)，在K3施用量較高時(shí)(8 g/kg)對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的防治效果達(dá)66.7%(表3)，K3H對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的抑制效果明顯強(qiáng)于K3L。而在K3施用量為8 g/kg時(shí)，K3菌劑在甜瓜幼苗期和伸蔓期施用對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲防治效果均為100%(表4)，對(duì)甜瓜幼苗根系的生長(zhǎng)也有明顯促進(jìn)作用(圖4)。

圖3 K3不同施用量下甜瓜幼苗根系生長(zhǎng)情況Fig.3 The effect of different K3 application amounts on the growth of melon seedlings roots

表3 K3不同施用量對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的防治效果Table 3 Control effect of K3 application amounts on melon root-knot nematode

表4 不同時(shí)期施加K3對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲的防治效果Table 4 Control effect of K3 application against melon root-knot nematode in different periods %

2.3 K3施用量與施用時(shí)期對(duì)接種根結(jié)線蟲甜瓜幼苗抗性酶活性的影響

由表5可知，甜瓜葉片中PAL、PPO和CAT活性隨K3施用量的增加而增強(qiáng)。由表6可知，幼苗期和伸蔓期接種根結(jié)線蟲后，甜瓜葉片PAL、CAT和PPO酶活性高于CK1，且K3S中PAL和CAT酶活性高于K3V，說明不同時(shí)期施加K3均可在一定程度上提高甜瓜葉片中抗性酶活性，但在幼苗期施加K3促進(jìn)作用更強(qiáng)。

表5 K3不同施加量下甜瓜葉片抗性酶活性Table 5 Melon leaf resistance enzyme activities under different K3 application amounts

圖4 不同時(shí)期施用K3后甜瓜幼苗根系生長(zhǎng)情況Fig.4 Effects of applying K3 in different periods on melon roots growth status

表6 不同時(shí)期施加K3后甜瓜葉片抗性酶活性Table 6 Melon leaf resistant enzyme activities under application of K3 in different periods

3 討 論

根結(jié)線蟲侵染甜瓜后，甜瓜的生長(zhǎng)受到明顯抑制，根系不發(fā)達(dá)且植株矮小。根結(jié)線蟲由土壤間隙侵入甜瓜根部并形成根結(jié)，破壞根系結(jié)構(gòu)，從而影響甜瓜的正常生長(zhǎng)。作為新型防治手段之一的生物防治，其環(huán)境友好，有廣泛的應(yīng)用潛力，近年來受到國內(nèi)外的普遍關(guān)注。K3能夠促進(jìn)甜瓜幼苗的生長(zhǎng)[12]，在本研究中K3不僅促進(jìn)甜瓜的生長(zhǎng)，還在一定程度上抑制根結(jié)線蟲侵入及根結(jié)形成，施加K3后，甜瓜株高、根長(zhǎng)、葉片數(shù)、最大葉面積、鮮質(zhì)量均有較明顯增加，根結(jié)線蟲的感染率和根結(jié)指數(shù)也明顯降低。對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果研究與陳芳等[8]利用生物有機(jī)肥對(duì)甜瓜根結(jié)線蟲田間防治效果研究結(jié)果一致，而根鮮質(zhì)量卻與其研究結(jié)果不一致，原因?yàn)镵3能夠明顯的促進(jìn)甜瓜根系生長(zhǎng)[12]，施加K3后甜瓜根系較為發(fā)達(dá)，根鮮質(zhì)量顯著增加。在幼苗期和伸蔓期施加K3，由于并未在甜瓜根部發(fā)現(xiàn)根結(jié)，僅說明K3可有效抑制根結(jié)線蟲侵入甜瓜根部，K3是否還能直接殺死根結(jié)線蟲，尚需進(jìn)一步研究。

植物體內(nèi)的防御體系是一個(gè)復(fù)雜的體系，包括多種防御酶及抗病物質(zhì)，而這些不同的因素并不是單獨(dú)的發(fā)揮著作用，而是通過相互協(xié)調(diào)、作用以共同抵御各類脅迫[17-20]。植株受根結(jié)線蟲侵染后會(huì)產(chǎn)生某些生理生化反應(yīng)抵御侵害，主要表現(xiàn)為活性氧含量增加、抗性酶系活性增強(qiáng)、次生代謝物質(zhì)和病程蛋白(PR)產(chǎn)生等[21]。植物體內(nèi)的抗性酶系包括POD、PAL和PPO等。本研究測(cè)定PAL、CAT和PPO活性，在接種根結(jié)線蟲后，甜瓜處于生物脅迫下，甜瓜葉片中PAL和PPO活性增強(qiáng)[22]，直接增強(qiáng)植物抗性，而CAT活性降低[23]。

PAL、CAT和PPO 3種酶于不同時(shí)期在甜瓜防御系統(tǒng)的不同位置發(fā)揮不同作用，而K3對(duì)PAL、PPO和CAT的活性也有不同影響。幼苗期和伸蔓期施加K3后甜瓜葉片PAL、PPO和CAT活性均提高。而在幼苗期施加不同濃度的K3時(shí)，PAL和PPO活性升高，CAT活性降低。研究發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌提高了黃瓜幼苗PAL、PPO活性及多酚含量，表明接種AM真菌可提高黃瓜幼苗對(duì)根結(jié)線蟲侵染的抗性[24]。商桑等[25]發(fā)現(xiàn)，穿刺巴斯德芽菌接種后根系中SOD與POD活性逐漸下降，而CAT活性迅速下降，說明穿刺巴斯德芽菌能夠使保護(hù)酶活性升高和下降的幅度變緩，降低膜脂過氧化作用。叢枝菌根真菌和植物根圍促生細(xì)菌組合菌劑能夠提高與黃瓜抗逆性相關(guān)的SOD、POD和CAT活性，從而提高對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲抗性[26]。本研究結(jié)果表明，在甜瓜幼苗期施加K3菌劑8 g/kg能較好地誘導(dǎo)甜瓜抗性增強(qiáng)。