改良柱前熒光胺衍生化-高效液相色譜法測(cè)定豬肉中11 種磺胺類(lèi)藥物殘留

王曉茵，宋翠平，孫曉亮，李木子，曹旭敏，秦立得，王淑婷，隋金鈺，王玉東，趙思俊

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032）

磺胺類(lèi)藥物是一類(lèi)以對(duì)氨基苯磺酰胺為基本母核結(jié)構(gòu)的合成抗菌藥物，具有廣譜抗菌性，而且價(jià)格低廉，作為預(yù)防、治療細(xì)菌感染性疾病的藥物被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中。然而，由于在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中存在不合理使用甚至濫用藥物的情況，極易導(dǎo)致其在畜禽產(chǎn)品中的殘留，對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生極大的威脅和危害，為此，我國(guó)規(guī)定動(dòng)物組織中磺胺類(lèi)藥物總最大殘留限量為100 μg/kg。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)磺胺類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法開(kāi)展了廣泛研究，包括液相色譜技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、免疫學(xué)分析法和毛細(xì)管電泳法等，其中，液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其高分辨率和高靈敏度被普遍應(yīng)用。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠同時(shí)分析多種物質(zhì)，方法的準(zhǔn)確性和靈敏度高，但儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，且對(duì)操作人員要求較高。而采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于大多數(shù)磺胺類(lèi)藥物的最佳紫外吸收波長(zhǎng)為270～280 nm，但是該波長(zhǎng)范圍選擇性較低，而且動(dòng)物組織中的蛋白（最大吸收波長(zhǎng)為280 nm左右）及其他共萃取物極易對(duì)分析過(guò)程產(chǎn)生干擾，容易造成誤判現(xiàn)象。

磺胺類(lèi)藥物分子中磺酰胺的對(duì)位氨基（伯胺）活潑性高，可與衍生試劑熒光胺進(jìn)行反應(yīng)，生成具有熒光特性的磺胺衍生物，而非伯胺類(lèi)化合物不發(fā)生類(lèi)似反應(yīng)。通常，在酸性條件下，熒光胺中的氧原子被質(zhì)子化后，帶有正電荷，向相鄰環(huán)的碳原子吸引電子，削弱了C－O鍵，內(nèi)酯環(huán)開(kāi)環(huán)，使碳原子帶有部分正電荷，溶液中的水進(jìn)攻碳正離子，然后失去氫離子，得到環(huán)氧化合物繼續(xù)質(zhì)子化、異構(gòu)化，得到中間體羰基化合物；然后磺胺中活潑的伯氨基與中間體化合物的羰基發(fā)生縮合反應(yīng)，成環(huán)，最終得到磺胺衍生物（圖1）。

圖1 磺胺類(lèi)藥物與熒光胺可能的反應(yīng)機(jī)理Fig. 1 Possible reaction mechanism between sulfonamides and fluorescamine

熒光胺與磺胺類(lèi)藥物發(fā)生衍生化反應(yīng)，產(chǎn)物具有很高的熒光強(qiáng)度，利用熒光檢測(cè)器測(cè)定，可有效降低其他組分的干擾，提高檢測(cè)的靈敏度和可靠性。但由于該衍生化產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定，會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸分解，需要在短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定，否則容易影響定量的準(zhǔn)確性，這對(duì)批量檢測(cè)樣品工作帶來(lái)極大不便。鑒于熒光衍生產(chǎn)物易分解，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確、批量檢測(cè)工作不方便等原因，針對(duì)目前磺胺類(lèi)藥物多殘留檢測(cè)的實(shí)際需要，本研究根據(jù)磺胺類(lèi)藥物與熒光胺可能發(fā)生的反應(yīng)機(jī)理，對(duì)影響衍生化反應(yīng)的各個(gè)因素系統(tǒng)地進(jìn)行選擇、優(yōu)化，確定維持衍生化反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性的方法。對(duì)豬肉樣品的磺胺-熒光胺衍生產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，大大提高了方法的準(zhǔn)確度和實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50 份豬肉樣品，均隨機(jī)購(gòu)自青島市各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

熒光胺（純度≥99%） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；KHPO（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺二甲異嘧啶（sulfisomidine，SM2’，純度94.0%）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD，純度99.1%）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SM2，純度99.4%）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM，純度98.0%）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ，純度99.3%）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（sulfamethoxydiazine，SMD，純度98.0%）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDO，純度99.1%）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，SMZ，純度99.5%）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM，純度99.4%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；磺胺甲氧吡嗪（sulfamethoxypyrazine，SMPZ，純度98%） 加拿大TRC公司；磺胺曲沙唑（sulfatroxazole，STX，純度99.8%） 澳大利亞國(guó)家計(jì)量研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀（配備Waters 2475熒光檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；Centrifuge 5804 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；MilliQ超純水儀 美國(guó)Millipore公司；N-EVAP 112氮吹儀美國(guó)Organomation公司；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）：精密稱(chēng)取各磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，－20 ℃保存?；前奉?lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.0 μg/mL）：準(zhǔn)確量取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，混勻，并用甲醇稀釋定容至刻度?；前奉?lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1 μg/mL）：準(zhǔn)確量取1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，混勻，并用甲醇稀釋定容至刻度。－20 ℃保存。

提取溶液（0.1 mol/L KHPO）：取KHPO6.80 g，用超純水溶解并定容至500 mL。

衍生溶液（0.1 mol/L KHPO，pH 3.0）：取KHPO0.68 g，超純水溶解，并用0.1 mol/L HPO溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，最后用超純水定容至50 mL。

衍生試劑（0.3 mg/mL熒光胺）：精確稱(chēng)取熒光胺7.50 mg，丙酮溶解并定容至25 mL。

1.3.2 樣品前處理

取豬肉樣品，經(jīng)勻漿制備成肉糜狀，準(zhǔn)確稱(chēng)取（5.00±0.01） g于50 mL具塞離心管中，加入提取液10 mL，多管渦旋儀渦旋5 min，8 000 r/min離心8 min后倒出上清液；重復(fù)提取1 次，合并上清液，混勻；取5 mL合并后的上清液，加入經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB固相萃取柱，分別用3 mL水和3 mL體積分?jǐn)?shù)20%甲醇水溶液淋洗，真空抽干后用3 mL甲醇洗脫，45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

1.3.3 衍生化反應(yīng)

經(jīng)前處理后的樣品，加入0.1 mol/L KHPO（pH 3.0）溶液0.8 mL渦旋溶解，再加入0.3 mg/mL熒光胺溶液0.2 mL，混合均勻后，4 ℃條件下反應(yīng)40 min，待測(cè)。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)405 nm，發(fā)射波長(zhǎng)495 nm；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序如下：0～3.0 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)66%；3.0～15 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)線(xiàn)性變化至60%；15～30 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)保持60%；30～33 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)線(xiàn)性變化至66%；33～35 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)保持66%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

折線(xiàn)圖采用Graphpad Prism 5軟件繪制；色譜圖采用Waters Empower 2工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理，自動(dòng)計(jì)算擬合線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化

磺胺類(lèi)藥物中含有芳香伯氨基，在酸性溶液中加入一定濃度的熒光胺衍生試劑，11 種磺胺類(lèi)藥物都顯示出良好的反應(yīng)活性，室溫下反應(yīng)40 min衍生產(chǎn)物峰面積最大，并基本穩(wěn)定，但是，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，衍生產(chǎn)物會(huì)發(fā)生降解，24 h后基本衰減完全，嚴(yán)重影響準(zhǔn)確定量。為了更好地應(yīng)用于日常檢測(cè)工作，本研究根據(jù)衍生化反應(yīng)可能發(fā)生的反應(yīng)機(jī)理，對(duì)該衍生化反應(yīng)條件加以?xún)?yōu)化。主要從衍生溶液pH值、衍生反應(yīng)時(shí)間、熒光胺質(zhì)量濃度等方面進(jìn)行研究，以期得到最優(yōu)反應(yīng)條件。

2.1.1 衍生溶液pH值對(duì)峰面積的影響

根據(jù)磺胺與熒光胺的反應(yīng)機(jī)理，衍生溶液的pH值對(duì)衍生化反應(yīng)的影響至關(guān)重要，分別對(duì)不同pH值條件下（pH 3.0、7.0、10.0）衍生化產(chǎn)物峰面積進(jìn)行比較。在堿性條件下（pH 10.0），衍生化產(chǎn)物幾乎沒(méi)有響應(yīng)；在中性條件下（pH 7.0）響應(yīng)很微弱，而在酸性條件下（pH 3.0）響應(yīng)明顯增強(qiáng)。

為進(jìn)一步確認(rèn)最佳溶液pH值，在pH 2.0～7.0做加密測(cè)試，由圖2可知，在pH 2.0～5.0范圍內(nèi)均可獲得較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，而且低pH值條件可降低熒光產(chǎn)物的衰減速率，因此，選擇pH 3.0的KHPO緩沖溶液。

圖2 衍生溶液pH值（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）和熒光胺質(zhì)量濃度（C）對(duì)峰面積的影響Fig. 2 Effect of pH value (A)， reaction time (B) and fluoramine concentration (C) on the peak areas

2.1.2 衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)峰面積的影響

比較衍生化反應(yīng)0～100 min產(chǎn)物的峰面積，由圖2可知：反應(yīng)時(shí)間0～40 min時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，峰面積增大；40～80 min峰面積趨于穩(wěn)定，80 min后衍生產(chǎn)物峰面積開(kāi)始下降，因此，選擇40 min作為衍生化反應(yīng)時(shí)間。

2.1.3 熒光胺質(zhì)量濃度對(duì)峰面積的影響

不同質(zhì)量濃度熒光胺溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）對(duì)衍生反應(yīng)有影響。由圖2可知，隨著熒光胺質(zhì)量濃度的升高，衍生化產(chǎn)物峰面積逐漸增大，當(dāng)熒光胺質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL時(shí)，峰面積達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定，因此，選用0.3 mg/mL熒光胺溶液。

2.1.4 衍生產(chǎn)物的反應(yīng)條件對(duì)峰面積的影響

磺胺-熒光胺衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性差，室溫下長(zhǎng)時(shí)間放置衍生產(chǎn)物會(huì)逐漸衰減，對(duì)準(zhǔn)確定量造成影響。為此，衍生化后的樣品分別在室溫和4 ℃下避光保存，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、10.0、12.0、15.0、18.0 h測(cè)定。室溫條件下，衍生產(chǎn)物在80 min內(nèi)穩(wěn)定，隨后開(kāi)始降解（圖2和圖3）；而在4 ℃條件下，衍生產(chǎn)物在12 h內(nèi)維持穩(wěn)定，未出現(xiàn)顯著衰減情況（圖3）。因此，本方法采用低溫條件進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)批量樣品的篩查分析。

圖3 室溫（A）和4 ℃（B）下放置時(shí)間對(duì)峰面積的影響Fig. 3 Effect of storage time at room temperature (A) and 4 ℃ (B) on the peak areas

2.2 色譜條件優(yōu)化

11 種磺胺類(lèi)藥物具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，且SMM與SMD、SDO與SDM互為同分異構(gòu)體，增加了液相色譜分離的難度?？疾靀Bridge Shield RP 18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Symmetry C（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Symmetry C（4.6 mm×150 mm，5 μm）3 種色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，3 種色譜柱均能有效保留11 種化合物，但XBridge Shield RP 18和Symmetry C（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離效果不好，色譜峰得不到完全分離。而Symmetry C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）在35 min內(nèi)可有效分離11 種磺胺類(lèi)藥物。圖4為該色譜柱條件下空白豬肉樣品和空白豬肉添加11 種磺胺類(lèi)藥物后的色譜圖。

圖4 空白豬肉（A）和空白豬肉添加11 種磺胺類(lèi)藥物（2.0 μg/kg）（B）的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of blank pork (A) and 11 sulfonamides added to blank pork samples at 2.0 μg/kg (B)

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

配制不同質(zhì)量濃度（1、5、10、20、50、100、200 μg/L）的11 種磺胺類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3節(jié)方法衍生化后，經(jīng)高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，以各藥物峰面積（）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（，μg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

由表1可知，11 種磺胺類(lèi)藥物在1～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系（≥0.999 4）。分別以3 倍和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，計(jì)算本方法測(cè)定豬肉樣品中磺胺類(lèi)藥物的檢出限和定量限，其中SM2’、SD、SM2、SMM、STZ和SMD的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為0.8 μg/kg，SMPZ、SDX、SMZ和STX的檢出限為0.4 μg/kg，定量限為1.2 μg/kg，SDM的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.6 μg/kg。

表1 11 種磺胺類(lèi)藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations and correlation coefficients (R2) of the 11 sulfonamides

2.3.2 準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

在空白豬肉中添加11 種磺胺類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加標(biāo)量分別為2、50、100 μg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，考察方法的加標(biāo)回收率、日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。由表2可知，11 種磺胺類(lèi)藥物的平均加標(biāo)回收率為62.0%～108.0%，日內(nèi)RSD為2.0%～8.8%，日間RSD為1.8%～8.6%。

表2 空白豬肉中11 種磺胺類(lèi)藥物的平均加標(biāo)回收率、日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Average recoveries， intra-day and inter-day relative standard deviation (RSD) of the 11 sulfonamides in blank pork samples %

2.4 方法比較

本研究比較了高效液相色譜-紫外法、柱前和柱后衍生高效液相色譜-熒光法測(cè)定豬肉中磺胺類(lèi)藥物殘留量的方法，其中，高效液相色譜-紫外法選擇性低，雜峰干擾明顯，信號(hào)峰弱；柱后衍生法是在線(xiàn)衍生，從進(jìn)樣器吸取樣品到檢測(cè)器檢測(cè)到信號(hào)，磺胺類(lèi)藥物不能在短時(shí)間內(nèi)完全反應(yīng)，熒光響應(yīng)值明顯低于柱前衍生法?；前放c熒光胺反應(yīng)得到的衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性差，有文獻(xiàn)報(bào)道要在1 h內(nèi)完成測(cè)定，否則會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性；而在本研究中，4 ℃條件下衍生化產(chǎn)物維持12 h不發(fā)生衰減。綜上，在本研究條件下，方法的定量限低（0.8～1.6 μg/kg）、雜質(zhì)干擾程度低、信號(hào)峰響應(yīng)高、重現(xiàn)性好，提高了方法的準(zhǔn)確性和批量操作的可靠性。

2.5 方法應(yīng)用

使用GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和本方法對(duì)青島市各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽取的50 份豬肉樣品中磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，有1 份樣品SM2為陽(yáng)性，2 種方法測(cè)定得到樣品中SM2的殘留量分別為190、192 μg/kg，無(wú)明顯差異，表明本方法準(zhǔn)確、可靠，可用于基層豬肉樣品中磺胺類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

根據(jù)磺胺類(lèi)藥物與熒光胺可能發(fā)生的反應(yīng)機(jī)理，對(duì)衍生化反應(yīng)條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，建立熒光胺柱前衍生-高效液相色譜檢測(cè)豬肉中11 種磺胺類(lèi)藥物殘留的分析方法。該方法靈敏度高、重復(fù)性好而且對(duì)儀器設(shè)備要求不高，操作快速簡(jiǎn)便，可用于畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)，如批量樣品中磺胺類(lèi)藥物殘留的篩查和確證工作，為基層一線(xiàn)的實(shí)際檢測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。