畜禽肉中源成分檢測技術研究進展

2022-03-18 06:26:04張亞麗牛立沙黃云霞孟志娟范素芳

肉類研究 2022年2期

張亞麗，牛立沙，黃云霞，孟志娟，張巖，范素芳，李強

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北石家莊 050227）

畜禽肉種類繁多，蛋白質含量較高，營養價值豐富，同時富含B族維生素和不飽和脂肪酸，是人體蛋白質和微量元素的重要來源。2013年我國肉類年產量達8 536 萬t，成為全球第一的肉制品生產大國。畜禽肉及其制品在我國占據很大的消費市場，在肉制品的高需求下，也滋生出許多畜禽肉制品的摻假問題，引起消費者的高度重視。全球的肉制品安全問題在2013年“馬肉風波”中便引起高度重視。用低價肉或非肉成分經處理后冒充高價肉，用非原產地產品冒充原產地產品等，在獲得暴利的同時嚴重侵害消費者權益。

為了嚴厲打擊肉制品摻假事件，各個國家和地區在不同程度上規定了肉制品的標識，包含全部成分及其凈含量。歐盟定量成分聲明詳細規定了肉制品所有成分及其凈含量的計算方法，還規定了蛋白和脂肪等成分需要單獨列出以及其最高含量。如豬肉脂肪最高限量為30%、結締組織蛋白限量為25%，鳥類和兔肉的脂肪限量為15%、結締組織蛋白限量為10%，其他哺乳動物純肉及其混合肉制品脂肪含量和結締組織蛋白限量為25%。我國已于2011年發布GB 7718—2011《食品安全國家標準預包裝食品標簽通則》，作為食品檢驗的依據。為保障相關系列規定的有效實施，需要科學的檢測方法做支撐，畜禽肉源成分檢測技術的發展顯得至關重要。因此，建立肉制品源成分定性及定量方法對檢測肉制品質量、辨別肉質真偽具有重要意義。動物源性成分檢測技術的研究對象為食品中的蛋白質、DNA、脂肪酸等，關鍵技術手段主要包括酶聯免疫、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、電泳、色譜、生物傳感分析及新興的蛋白組學-質譜技術，以不同的分子結構、DNA序列或特異性組成等作為分析依據。本文針對畜禽肉源成分檢測技術的研究進展及其應用進行綜述，著重介紹不同肉類相互摻假問題以及不同肉類的分析和檢測手段，總結常用方法的優缺點，并對檢測技術的發展趨勢進行展望。

1 基于蛋白質的檢測方法

蛋白質是組成生命物質的主要成分之一，參與生物組織構成，維持機體正常新陳代謝，為生命活動提供能量。蛋白質的氨基酸序列具有種內相似性和種間特異性的特點，蛋白質因其特殊結構，常被用于不同物種和不同物質的鑒別，基于蛋白質的檢測方法逐漸成為一種非常有效的鑒假手段。目前有很多用于鑒別肉制品摻假的技術及方法，主要是利用蛋白質的特性進行鑒別。例如，以蛋白質條帶特征為基礎的凝膠電泳分析法、利用蛋白質直接酶解原理的免疫分析法及直接使用蛋白質溶劑提取沉淀的色譜分析方法等。王百龍等利用蛋白質電泳法發現，短尾海蛾魚蛋白質比飛海蛾魚少1 條條帶，為2 種魚類的種間鑒別提供了新方法。凝膠電泳分析法以雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的分離蛋白效果最優。Montowska等利用2-DE法檢測在生肉中觀察到的肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）同種型表達的種間差異是否保留在肉制品中，通過2-DE分析肉糜混合物中的MLC（16 種變體）、法蘭克福香腸和由牛肉、豬肉、雞肉、火雞肉、鴨肉和鵝肉制成的香腸（15 種產品）中的MLC，實現對牛肉、豬肉、雞肉、火雞肉、鴨肉和鵝肉6 種肉源的物種鑒別，發現在一級結構上存在較大差異的一些蛋白質，可以用來作為肉制品認證的標記。胡文彥等利用熱處理技術加速蛋白質酶解，從牛肉、雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉5 種肉類中篩選出14 種特異性多肽標記物，適用于生肉和熟肉的摻假鑒別，建立了基于物種特異性多肽標記物的無標記定量方法，省略了合成多肽標準品步驟。此方法對生肉和肉制品源性檢測的測定限為1%，檢測可在2 d內完成。

對于不同物種的檢測，電泳法是將不同的可溶蛋白進行分離，這些不同的指示蛋白產生獨特的電泳條帶，根據電泳條帶鑒別物種之間的差異。但是當物種混雜多樣時，例如肉糜摻假檢測實驗，混合蛋白質的指示條帶相對復雜，單一的電泳法難以達到鑒別要求。因此需要電泳法與其他方法聯合檢測，從而達到檢測含有不同物種混合樣品的目的。Sotelo等通過深入研究十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）技術，通過對電泳法的改進，發明了一種有效鑒別海產品中魚類的方法。Hsieh等基于SDS-PAGE圖譜的特異性，對紅鯛魚進行深入研究，開發了一種用于鑒定其珍貴品種、替代品及劣質品的方法。Aristoy等基于等電聚焦電泳技術，針對混合碎肉中蛋白質圖譜進行分析，發明了一種鑒別技術，成功對牛肉、豬肉和火雞肉進行了區分。Simó等基于毛細管電泳-質譜技術，利用蛋白質中溶菌酶成分，提出了一種新的鑒別技術，可以實現雞肉和火雞肉的成功鑒別。

基于蛋白質大分子結構的免疫分析方法具有靈敏度高、操作簡單、高通量等優點，可以實現大批量樣品的快速檢測。免疫學方法有試管沉淀法、瓊脂擴散法、對流免疫電泳法、放射免疫法及酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法等，其中ELISA應用最為廣泛。Macedo-Silva等制備牛肉、雞肉、豬肉、馬肉中蛋白的抗血清，建立ELISA方法，用來鑒別漢堡中可能摻雜的廉價肉類成分，靈敏度達0.6%。Chen、Liu Lihua等采用單克隆抗體的ELISA技術，針對熱穩定肌肉蛋白進行分析，對生鮮豬肉、牛肉、羊肉等肉混合物中豬肉含量和飼料中的痕量豬肉進行鑒定，結果顯示，多種來源的肉類混合物中豬肉的檢測限為0.05%～0.50%。

不同物種的肉制品中蛋白質、氨基酸等組成也存在差異，因此通過色譜定性、定量分析等方法也可以對肉制品的摻假情況進行鑒定。Ashoor等提出了一種新的液相色譜方法，能夠定性檢測多種肉類成分，并且能夠定量檢測雞肉-火雞肉混合物成分。Schonherr提出了一種能夠對肉類成分進行定性鑒別的方法，該方法主要利用氨基酸二肽譜分析技術，結合高效液相色譜法，對肉制品進行定性分析，可以實現對豬肉、羊肉、雞肉或牛肉的準確檢測。

2 基于DNA序列特異性的鑒別技術

DNA是一種呈雙螺旋式結構、廣泛分布于細胞核、線粒體和葉綠體等細胞器中的生物分子，攜帶著生命體中最核心的遺傳信息，可以被用于肉制品鑒別。基于DNA序列特異性的分子生物學技術，因以動物種屬間遺傳信息的差異作為不同品種肉制品鑒別的檢測靶點而被廣泛應用。DNA分子和蛋白質具有種內相似性和種間特異性的特點。相比蛋白質，DNA克服了蛋白質遇熱變性的缺點，雖然其在加工過程中可能會造成一定程度的降解，但提取到的小片段DNA仍可被用于PCR分析。另外，DNA內部還存在非編碼區，因而能夠提供更多的遺傳信息用于鑒別，而且其還具有特異性高、靈敏度高、不受組織類別限制等諸多優點，在親緣關系較近的物種檢測時具有較高的分辨能力。通過對比基因組DNA或線粒體DNA序列差異，進而進行物種鑒定和定性分析是當前DNA分析法中最常使用的技術手段。

DNA雜交法是較早用于物種鑒別的DNA檢測方法，該方法的主要原理是DNA在受熱變性情況下打開雙鏈，溫度降低后，進行堿基互補配對，又恢復雙鏈狀態。DNA雜交過程必須使用探針，常使用純度較高的基因組片段，用放射性同位素標記作為基因探針。DNA探針技術又稱作核酸雜交技術，放射標記的基因在雜交表達過程中產生放射信號，根據信號有無可以進行動物源性成分的鑒別。例如，DNA雜交法應用于加工后豬肉和牛肉的鑒別上，效果非常顯著，識別率高。但后來這種方法在實際應用推廣過程中顯現出一些弊端，如實驗具有放射性、操作時間長，雜交實驗成功的前提通常對DNA的純度要求特別高，針對不同加工方式的肉類，腌制、熏制等生產加工工藝不同，對肉類鑒別實驗產生的干擾較大等。隨后出現的新型PCR技術，逐漸取代傳統DNA雜交方法，成為利用DNA特征序列來鑒別動物源性成分的主要技術手段。目前的主要技術手段集中于以PCR為基礎的各類分析方法，如PCR-電泳技術、PCR-測序技術、PCR-限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，PCR-RELP）技術、隨機引物擴增技術、實時熒光PCR技術、數字PCR技術等。PCR技術的主要工作原理是通過DNA序列擴增技術將檢測樣品中單拷貝的DNA片段達到指數倍擴增，將其應用于動物源性成分檢測技術后，極大提升了檢測靈敏度和結果可靠性。徐巖等開發出一種基于PCR-RFLP鑒別梅花鹿茸和馬鹿茸的快速檢測方法。Wang Lijuan等擴大推廣PCR-RFLP技術的應用，結合熒光標記技術，實現了對奶牛中脂肪含量和蛋白質含量的測定，該技術特點是將12S rRNA通用上游引物5’端標記FAM染料，下游通用引物5’端標記HEX染料，配合I和I 2 種限制性內切酶，通過熒光強度和條帶長度雙重信號判定結果，提高了RFLP法的靈敏度和準確性，并提供了快速鑒定食品中DNA成分來源的新途徑。Kesmen等提出一種基于PCR技術檢測熟香腸中低含量豬、馬、驢源性成分的方法，向牛肉餡、羊肉餡中添加0.0%、0.1%、0.5%、1.0%、5.0%馬肉、驢肉和豬肉進行實驗，結果表明，該方法的靈敏度可達0.1%。Ilhak等向牛肉、綿羊肉、山羊肉中添加5.0%、2.5%、1.0%、0.5%、0.1%豬肉、馬肉、貓肉、狗肉進行PCR擴增，得到439、322、274、271、225、212、157 bp的片段，增加循環數到35，該方法的靈敏度達0.1%。Behrens等提出一種基于多重PCR技術鑒別雞肉、火雞肉、牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、驢肉和馬肉的方法，結果表明，該方法在加熱和加工肉制品中的檢出限達1%。Bai Weibin等通過混合雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重引物，實現了在單一PCR反應中對物種特異性DNA的鑒別，檢測限達0.5 g/kg。

實時熒光定量PCR技術可以被分為兩大類。第1類被稱為Man實時熒光定量PCR，其原理是利用雙熒光標記探針的熒光基團解離產生熒光強度變化，進而進行成分鑒別；第2類是利用染料分子插入雙鏈DNA產生熒光變化的SYBR Green實時熒光定量PCR。Druml等提出一種基于熒光PCR技術的檢測方法，用于檢測肉類產品中鹿肉的摻假含量，雙重熒光PCR法檢測結果顯示，野生肉制品中可能含有的20 種動物源成分和43 種植物源成分沒有交叉反應；雙重熒光PCR檢測黇鹿肉和馬鹿肉檢出限為0.5%，梅花鹿肉為0.1%；而且通常含量的測定值與實際鹿肉含量誤差低于25%，相對標準偏差一般低于10%，說明該測定方法在重復性和精確性上表現良好。López-Andreo等提出一種基于SYBR Green實時熒光定量PCR的方法，用于鑒別牛肉、豬肉、馬肉和袋鼠肉，該方法的最低檢測限可達0.04 pg DNA，可以有效應用于檢測實驗室人工摻雜的肉制品，但之后進行的二重PCR檢測靈敏度有所降低。Soares等基于SYBR Green實時熒光PCR技術開發了一種檢測方法，可以實現對禽肉制品中摻雜的豬肉成分的定量分析。

數字PCR技術是近年來發展出的一種新型PCR技術，是對傳統PCR的一次改良，改進了傳統PCR低靈敏度的劣勢，通過對熒光信號進行分析，進而對肉類成分進行準確定性和定量。新型數字PCR技術可以實現對不同物種的識別，如同時分析肉糜中的牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉等；同時可以實現對食品來源、產地進行區分，如對新疆牛羊肉和冀中牛羊肉的鑒別。通過數字PCR技術建立不同的基因庫，與舊庫對比，新庫統計基因庫的搜索識別功能越來越強大，應用會越來越廣，通過數字PCR技術對肉類產地的區分能為肉類源成分的溯源分析提供依據。

環介導等溫擴增技術，是采用恒定溫度條件進行核酸片段的擴增。柳海賓等利用環介導等溫擴增技術結合免疫層析試紙法對羊肉中的鴨肉成分進行鑒別，不需要復雜的儀器設備，且僅需5 min即可出現可視化反應，相比于環介導等溫擴增結合電泳法，避免了培養專業操作者的成本，而且節約時間，相比于環介導等溫擴增技術結合熒光法，避免了加入熒光染料對樣品的干擾，排除了干擾因素，優點顯著。

3 基于脂肪酸的檢測方法

脂肪酸由飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸組成，脂肪酸組成是評判禽畜肉營養價值高低的重要指標。禽畜肉制品的摻假問題不僅包括肉成分的代替、肉來源的摻假，還包括肉類加工處理方式的改變。脂肪酸的含量和組成會因為食品加工方式的不同產生變化，脂肪酸含量也是影響肉制品風味和口感的重要因素。

禽畜肉中脂肪酸的檢測技術常常為色譜-質譜技術聯用，侯召華等基于脂肪酸檢測，結合氣相色譜-質譜分析，對不同加工處理方式的豬肉進行研究，對比冷鮮里脊肉和真空冷凍干燥里脊肉中脂肪酸的差異。趙佳等對豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5 種肉類，選取腿、胸、內臟等不同部位的脂肪酸進行檢測分析，發現豬肉中飽和脂肪酸含量最低，牛羊肉中飽和脂肪酸含量較高。皮立等建立一種基于脂肪酸檢測的氣相色譜-質譜技術，可以用于區分歐拉羊、高原羊和小尾寒羊。李朝陽等結合氣相色譜-質譜技術分析不同部位獅白鵝的脂肪酸含量，包括肝臟、前胸、腿部、腹部和血液，研究發現，油酸在腹部含量最高，花生四烯酸在肝臟含量最高，腹部含量為零。

由于脂肪酸的種類復雜，一種肉類可能包含幾十種脂肪酸，只有特定的一種或幾種脂肪酸可以區別某種禽畜肉，脂肪酸檢測的大部分結果顯示，脂肪酸組成差異與肉質類別間的相關性無統計學意義，因此基于脂肪酸檢測來區分不同物種的方法開發有一定的難度，推廣及應用的范圍相對較小。脂肪酸組分與含量的差異不僅影響風味，也是控制食品質量與檢測食品摻假的有效途徑，通過對不同部位脂肪酸的檢測分析，達到品質控制、建立更合理的膳食結構的目的。

4 色譜和質譜技術

色譜包括液相色譜和氣相色譜，原理是利用樣品的分子質量不同、疏水性和電負性，將目標物分開，而質譜可根據質荷比確定分子的種類，因而色譜-質譜聯用技術也廣泛應用于有機物和多肽的定性及定量分析。

色譜技術在膠類藥材上的應用很普遍，隨著現代生活水平的提高，人們對于保健食品的要求也逐漸提高，阿膠的原材料之一是驢皮，我國每年驢養殖量遠低于馬養殖量，用馬皮摻假驢皮制膠的現象屢禁不止，制膠過程中的高溫加工處理嚴重破壞了驢皮中的DNA和蛋白質，所以PCR技術和蛋白質技術無法實現對驢皮和馬皮的鑒別，高效液相色譜技術可以實現對阿膠中驢皮成分的鑒別，促進了對阿膠質量品質的把關，有助于規范保健品市場。

Chou等選取15 種生熟肉品，來源于牛、豬、山羊、鹿、馬、雞、鴨、鴕鳥、鮭魚、鱈魚、蝦、螃蟹、扇貝、牛蛙、短吻鱷等，采用高效液相色譜技術和電化學檢測技術測定，物種特異性標記顯示出可重復的峰值保留時間，變異系數不高于6%。Wissiack等根據離子電負性對陰離子進行色譜選擇，選取二極管陣列檢測器掃描416 nm波長處的特征峰，實現了對牛肉、羊肉或豬肉血紅蛋白的定量分析，實驗證明，對于混合肉樣中含量大于10%的成分能實現快速檢測，但由于共洗脫導致牛肉與羊肉較難區分。Giaretta等利用液相色譜法檢測生牛肉漢堡中的肌紅蛋白，來定量分析豬源性成分含量。由于實驗過程中需要將樣品與亞硝酸鈉作用，將不穩定的肌紅蛋白（氧合肌紅蛋白和脫氧肌紅蛋白）轉化為較穩定的高鐵肌紅蛋白，因此步驟繁瑣，耗時較長，最低檢測限可達5%。肉制品中蛋白質含量變化較大、干擾因素多，致使該類技術的靈敏度較低，容易產生假陽性結果。

現階段，將鳥槍法和質譜法相結合實現禽畜肉源成分鑒別成為新的研究熱點。Bargen等采用該方法鑒別牛肉中的馬肉和豬肉成分，以雞肉、羊肉和牛肉為陰性對照，篩選出馬肉和豬肉的特征肽，并確定牛肉中馬肉和豬肉的最低檢出限為0.55%。Montowska等采用電噴霧解吸電離質譜技術與液滴萃取表面分析質譜技術檢測牛肉、豬肉、馬肉、雞肉、火雞肉5 種肉類骨骼肌蛋白，根據信噪比和多元分析法成功鑒別了5 種肉類成分的特征肽。

5 結語

隨著人們生活水平的提高，消費者對畜禽肉制品摻假的問題越來越重視，針對不同肉的摻假鑒別技術亟需發展。現階段，針對不同禽畜肉摻假問題的檢測技術，最常見的是基于蛋白質、DNA、脂肪酸的檢測技術和色譜-質譜技術。基于蛋白質的肉類摻假技術操作相對簡單、靈敏度高，可以用于批量樣品的檢測，但只適用于已知具有特異性抗體的肉類檢測研究，實驗容易受到蛋白質易變性的影響。基于脂肪酸的檢測技術常與色譜-質譜聯合使用，檢測效率高，不同肉的脂肪酸含量存在明顯差異，實驗對樣品的處理較為簡單，但由于脂肪酸種類較多，對于多種混雜樣品的檢測，尋找可以區分不同肉類的脂肪酸較為困難，檢測準確度不高，容易出現假陽性。基于DNA序列特異性的檢測技術是當前被廣泛應用在肉制品摻假鑒別中的檢測方法，這種檢測技術的精確度高、重復性好、檢測效率高，適用于樣品的批量檢測，可以對摻假成分進行定量測定，為摻假鑒別提供較為準確的數據支持，但是檢測成本相對較高，需要的儀器耗材也相對昂貴。