氮磷養分對熒蒽污染土壤修復的應用研究

陳雪梅，張馥穎，朱雪竹，趙海燕，呂百韜

（南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095）

多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）主要來源于化石燃料的燃燒。隨著經濟的發展，環境中PAHs污染被多次報道。PAHs可以在環境中長期存在，并可通過食物鏈進入人體，從而增加人類患癌風險。由MA 等對某城市的土壤污染調查報道可知，該城市土壤中以熒蒽（14.4%）和芘（12.4%）等4 環和3 環PAHs 為主。YANG 等研究的某特大城市路邊農業表層土壤中16 種PAHs 的污染濃度為17.2~3 775.0 ng·g，工業區和居民區附近的農業土壤PAHs 污染最嚴重，熒蒽濃度為614 ng·g。張俊葉等的土壤調查表明，中國主要地區表層土壤中16 種PAHs 總量（中位值）為515.70 ng·g，和其他國家相比處于中等水平，其中熒蒽占總含量的10.39%。平新亮等對某工業區的土壤調查顯示，土壤中熒蒽的含量范圍為0~212.0 ng·g，均值為53.5 ng·g。

PAHs污染土壤的治理是目前亟需解決的環境問題之一。熒蒽作為一種4 環的PAHs，普遍存在于我國土壤中，尤其是經濟發達的長三角地區、珠三角地區和環渤海地區，是美國環境保護署優先控制有機污染物黑名單中典型的代表性PAHs。有調查顯示，熒蒽在燃燒產生的PAHs 中含量最高，其性質穩定、易在環境中沉積，因此常被作為環境中PAHs 污染物的指示化合物。

PAHs在環境中降解的限制因素有生物和非生物兩類，PAHs降解微生物為主要生物因素，利用微生物修復污染土壤具有成本低、效果好以及對環境二次污染小等優點。非生物因素通常為氮、磷、氧氣等營養因子和電子受體等，通過添加上述營養元素改善生物降解能力的方法稱為生物刺激法，該方法在實際的生物修復過程中具有易操作、效果顯著等特點。自然條件下，植被生長與施肥是影響微生物修復效果的兩個重要因素，土壤中的氮磷養分對微生物活力存在促進作用。

PAHs污染土壤修復中的關鍵問題是如何通過添加合適的氮磷養分從而達到高效去除土壤中PAHs污染的目的。土壤微生物量是土壤質量和酶活性的重要反映。脲酶活性與土壤有機氮的轉化能力、土壤無機氮的供應能力密切相關。土壤磷酸酶酶促反應能夠加速土壤有機磷的脫磷速度，在土壤的磷素循環中起重要作用，其活性的高低可直接影響土壤磷素有效化強度的強弱。多酚氧化酶是芳香族化合物氧化成醌的關鍵酶。

考慮到江蘇地區土壤以黃棕壤為主，因此本研究選擇黃棕壤為江蘇地區土壤代表，熒蒽為PAHs 代表污染物，分析外加氮磷對土壤中熒蒽的消除速率，以及對與PAHs 降解密切相關的土壤酶活性的影響，闡明氮磷養分促進黃棕壤中熒蒽消減的機理，以期為黃棕壤中PAHs污染土壤修復提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃棕壤采自南京市某農田表層（0~20 cm），土壤理化性質見表1。土樣風干后研磨過10目篩，向土樣中加入10 mg·mL的熒蒽丙酮溶液，制備熒蒽終濃度為100、200 mg·kg的污染土壤，老化備用。標準樣品熒蒽購自Sigma?Aldrich 公司，標準儲備液采用丙酮配制。

表1 供試土壤理化性質Table 1 Physicochemical properties of the tested soil

供試化肥：氮肥，通用名稱為尿素CO（NH），總氮≥46.4%，安徽金秋肥業有限公司。磷肥，通用名稱為過磷酸鈣CaPHO，有效磷≤12%，連云港新磷礦化有限公司。

1.2 試驗設計

本研究選擇熒蒽作為目標污染物，濃度設置為100 mg·kg和200 mg·kg，分別添加不同量的氮肥（以TN表示，總氮≥46.4%）和磷肥（以TP表示，有效磷≤12%）。具體試驗設計見表2。

表2 試驗設計（mg·kg?1）Table 2 Experimental design（mg·kg?1）

稱取200 g 污染土壤于250 mL 燒杯中，分別添加肥料混合均勻，調節水分至田間持水量（24.7%）的80%，即土壤最終含水率為19.76%。用保鮮膜封口，膜上用針扎小孔若干以保證通氣，然后置于（25±1）℃恒溫培養箱中黑暗培養，培養期間每日以稱質量的方法補充水分以維持試驗設定的含水量。分別在第7、15、30、60 d 整瓶取出培養樣品，采集土壤樣品，測定其中的熒蒽殘留量和土壤酶活性。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤中熒蒽殘留量的測定

測定方法參考文獻[16?17]。污染土壤樣品置于玻璃離心管中，加入二氯甲烷，超聲（80 Hz）1 h。以2 500 r·min離心10 min。取上清液過無水硫酸鈉?硅膠柱，再用正己烷和二氯甲烷混合溶液（體積比1∶1）洗脫。將洗脫液收集到50 mL旋轉蒸發瓶內，于40 ℃下恒溫旋轉蒸發濃縮至干。用乙腈定容至2 mL，過0.22 μm 濾膜后待液相測定。每個土樣設置3 個平行，兩種熒蒽污染濃度土壤各測定一組不加被測物質，而加入定量標準物質的空白對照的回收率，當土壤中熒蒽污染濃度分別為100、200 mg·kg時，回收率分別為85.5%~94.8%和86.0%~95.5%。

利用高效液相色譜法（Agilent1260型自動進樣高效液相色譜儀，美國安捷倫公司）測定土壤中熒蒽殘留量。色譜柱：ZORBAX Eclipse PAH 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。檢測條件：柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min，進樣量20 μL，紫外檢測器檢測波長230 nm。

1.3.2 土壤熒蒽消除速率常數及生物半衰期

將各土壤中測出的熒蒽濃度與時間進行擬合，即可得公式（1）：

式中：為初始濃度，mg·kg；為測定值，mg·kg；為消除速率常數，d；為培養時間，d。

生物半衰期根據公式（2）計算：

式中：為生物半衰期，d；為消除速率常數，d。

1.3.3 土壤中酶活性的測定

分別在土壤培養試驗的第7、15、30、60 d 采集新鮮的土壤樣品，測定分析相關酶活性。脲酶活性采用靛酚藍比色法進行測定，磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進行測定，多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚法進行測定。測定的每種酶均設置3 組平行，每份土壤樣品加做一個無基質對照，以等體積的蒸餾水代替基質，同時整個試驗設置無土對照，其他操作與樣品試驗相同，以檢驗試劑純度和基質自身分解量。

1.4 數據處理

采用Excel 2016 軟件進行數據統計，Origin 2019進行圖表繪制，SPSS 19.0 軟件進行雙變量（Pearson）方差顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 不同氮肥水平對土壤熒蒽殘留量的影響

氮肥的添加能夠顯著提高土壤中熒蒽的去除率（圖1），當污染土壤中氮的添加量為300 mg·kg（TN12、TN22）時，第7、15、30、60 d時污染土壤中熒蒽去除率均達到同期各處理組最高。各處理組土壤中熒蒽的去除率隨著培養時間的增加而增加。與無外加氮源的CK1 相比，TN11、TN12、TN13 和TN14 中熒蒽的去除率分別提高了1.88、2.26、1.69 倍和1.57 倍（圖1a）；與無外加氮源的CK2 相比，TN21、TN22、TN23 和TN24 土壤中熒蒽的去除率分別提高了4.11、4.27、1.38 倍和0.92 倍（圖1b）。以上結果表明，對于本研究中的兩個熒蒽污染程度，300 mg·kg氮添加量均使污染土壤的熒蒽去除率達到最高。ZHANG 等的研究也表明，適量施用無機肥（氮、磷）對土壤微生物的活性有著積極的影響，有利于土壤中污染物含量的降低。在相同外加氮源處理下，100 mg·kg熒蒽污染土壤中的熒蒽去除率比同期的200 mg·kg熒蒽污染土壤高了0.56~3.10 倍。江晴等對某市區表層土壤中PAHs和微生物量的調查結果表明，土壤中16種PAHs的含量為16~417 μg·kg，土壤中微生物量隨著PAHs 含量的增加基本呈指數形式減少。由此，本研究推測熒蒽污染的增加抑制了土壤中微生物的活力，從而導致外加氮源的促進效率降低。

圖1 外加氮對土壤熒蒽去除的影響Figure 1 Effects of additional nitrogen on the removal of fluoranthene in the contaminated soil

氮是植物根系和微生物代謝過程中必不可少的元素，陸地土壤中的活性氮量增加可以提高生物和非生物過程的PAHs 降解速率。楊曉東等報道了氮添加能提升土壤中營養物質的可利用性、植物根系和土壤微生物的活性，有利于降解土壤中的PAHs。王月等報道了單施氮肥、氮磷肥、氮磷鉀肥等均可顯著提高土壤微生物量碳、氮的含量。本研究的污染土壤中熒蒽的去除速率隨著外加氮量的增加而逐漸穩定，推測是由于外加氮源為微生物提供更多的氮源，降低了黃棕壤中C/N。隨著外加氮源的增加，氮已不是土壤中有機碳降解的限制因素，因此黃棕壤中熒蒽的去除率上升趨勢變緩。

2.2 不同磷肥水平對土壤熒蒽殘留量的影響

外加磷有效提高了污染黃棕壤中熒蒽的消除速率，100 mg·kg熒蒽污染狀態下外加磷對熒蒽消除的促進作用優于200 mg·kg熒蒽污染狀態（圖2）。與無外加磷源的CK1 相比，處理組TP11、TP12、TP13 和TP14 土壤中熒蒽的去除率分別提高了2.37、2.33、1.95 倍和1.70 倍（圖2a）；與無外加磷源的CK2 相比，處理組TP21、TP22、TP23 和TP24 土壤中熒蒽的去除率分別提高了6.48、6.40、5.68 倍和5.32 倍（圖2b）。兩種熒蒽污染程度的土壤中，150、300 mg·kg磷添加組中熒蒽的去除率達到相同熒蒽污染組中較高值。

圖2 外加磷對土壤熒蒽去除的影響Figure 2 Effects of additional phosphorus on the removal of fluoranthene in the contaminated soil

在相同磷肥處理下，100 mg·kg熒蒽污染土壤中的熒蒽去除率比200 mg·kg熒蒽污染土壤高了0.25~2.41 倍。胡星明等的研究表明，添加磷肥可改善污染土壤質量，促進植物和土壤微生物的生長。廖朝選等的研究也表明，施磷肥能顯著提高不同品種大豆土壤中微生物的數量，有效改善土壤生態環境，提高土壤肥力。周宏偉等的研究表明，濕地底泥中本底濃度的氮和磷已經能夠滿足3 環和4 環PAHs 的降解，外加氮磷對5 環的苯并[a]芘的降解具有顯著的促進作用。

2.3 不同氮磷水平對土壤熒蒽去除速率的影響

根據消除速率常數與半衰期數據，本研究推薦在熒蒽污染土壤中最佳氮、磷添加量范圍皆為150~300 mg·kg。外加氮顯著降低了污染黃棕壤中熒蒽的消除速率常數值，顯著縮短了熒蒽在黃棕壤中的（表3）。熒蒽消減隨著氮的增加呈先上升后下降的趨勢，氮添加量在150~300 mg·kg范圍時，可大幅縮短熒蒽在污染土壤中的殘留時間。300 mg·kg氮添加組中（TN12）對熒蒽消減促進作用最大，值最大，達到0.156 d，比CK1（0.034 d）提高了358.8%，值最小（4.4 d），比CK1（20.4 d）減少了78.4%。外加磷對土壤中熒蒽的去除速率有顯著影響，其值明顯高于對照，同時顯著縮短。熒蒽消減隨著磷的增加呈不斷下降的趨勢，在150 mg·kg磷添加組（TP11）中，值達到0.154 d，比CK1（0.034 d）提高了352.9%，值最小（4.5 d），比CK1（20.4 d）減少了77.9%。

表3 土壤中熒蒽殘留的消除速率常數和半衰期Table 3 Elimination rate constant and half life of fluoranthene residue in soil

2.4 土壤酶活性對氮磷養分的響應

2.4.1 外源氮磷養分對脲酶活性的影響

外加氮源均顯著提高了污染黃棕壤中脲酶活性（圖3）。100 mg·kg熒蒽污染黃棕壤中，外加氮源對脲酶活性提高較多。馬昱萱等的研究結果也表明施入氮肥能夠提高脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶的活性。李瑞瑞等的研究發現氮的添加對土壤脲酶有促進作用，但作用不顯著（＞0.05），脲酶活性（以NH計）在0.176 mg·g時出現最大值。氮肥對土壤中脲酶活性的促進作用明顯高于對照，這是由于施用的氮肥為土壤微生物提供了豐富的氮源，從而提高了土壤全氮和速效氮含量。

圖3 外加氮磷養分對土壤中脲酶活性的影響Figure 3 Effects of additional nitrogen and phosphorus on the urease activity in the contaminated soil

各外加磷處理組污染土壤中脲酶活性并不一致，在100 mg·kg熒蒽污染土壤中添加磷肥，前期（7~15 d）磷對土壤中的脲酶呈現抑制作用，相比CK1降低了0.69%~20.59%，TP13處理組脲酶活性下降最多；后期（15~60 d）外加磷顯著提高了土壤脲酶活性，相比CK1 提高了27.34%~50.57%。在200 mg·kg熒蒽污染土壤中，前期（7~30 d）外加磷處理組的脲酶活性顯著低于CK2，降低了1.31%~23.67%；后期（60 d）外加磷處理組的脲酶活性高于CK2，提高了1.67%~7.91%。TP21 處理組脲酶活性下降最少，TP22、TP23、TP24 處理組酶活性變化沒有顯著差異，這與上述磷對土壤中熒蒽消除速率的影響一致。污染土壤中，外加磷對脲酶活性主要表現為先抑制再促進的作用，賀根和等的研究結果表明，磷肥能降低根際和非根際土壤的脲酶活性，這與本研究結果不盡一致。

土壤脲酶直接參與土壤中氮元素的生態循環，可將有機物中的C—N鍵水解生成氨、二氧化碳和水，促進有機氮向礦質氮的轉化，其活性與土壤微生物數量、有機質含量和全氮含量呈正相關。陳悅的研究表明，氮的增加能夠增強土壤中脲酶、脫氫酶與過氧化氫酶的活性，同時能夠較好地減少土壤中萘2環與苗屈的含量，在總PAHs 的去除效果中也存在一定的正效應。

2.4.2 外源氮磷養分對磷酸酶活性的影響

各外加氮處理組污染土壤中磷酸酶活性反應并不一致，在100 mg·kg熒蒽污染土壤中添加氮肥，各處理組的磷酸酶活性高出CK1 組2.39%~23.09%（圖4a）；在200 mg·kg熒蒽污染土壤中添加氮肥，外加氮對土壤磷酸酶活性既有促進作用也有抑制作用（圖4b）。李瑞瑞等的研究發現，不同施氮量對酸性磷酸酶的影響顯著（＜0.05），隨施氮量的增加，磷酸酶活性呈增加的趨勢。外加磷可顯著提高熒蒽污染土壤中磷酸酶活性（圖4c和圖4d）。污染黃棕壤中磷酸酶活性隨著磷肥的增加而增加，TP14 處理組磷酸酶提高最多。土壤磷酸酶在土壤磷的循環中起重要作用，是評價土壤肥力狀況的重要水解酶，其可以將土壤中的復雜有機磷水解成可被生物直接吸收的無機磷，從而緩解了土壤磷的限制。外加磷提高了熒蒽污染土壤中的磷酸酶活性，促進了土壤中微生物對磷的利用。

圖4 外加氮磷養分對土壤中酸性磷酸酶活性的影響Figure 4 Effects of additional nitrogen and phosphorus on the phosphatase activity in the contaminated soil

2.4.3 外源氮磷養分對多酚氧化酶活性的影響

外加氮磷均可顯著提高污染黃棕壤中多酚氧化酶的活性，且隨著培養時間的延長，外加氮磷對多酚氧化酶活性的作用更顯著（圖5）。污染黃棕壤中多酚氧化酶在不同外加氮磷處理組的變化趨勢與土壤中熒蒽消除速率變化趨勢一致。在氮添加組中，當外加氮含量為150、300 mg·kg時，多酚氧化酶活性相對較高；在磷添加組中，外加磷含量為300 mg·kg時，多酚氧化酶活性相對較高。李瑞瑞等報道了外加氮可提高土壤多酚氧化酶活性。馮程程等的研究報道土壤多酚氧化酶對PAHs 污染的響應大多表現為激活效應，建議將多酚氧化酶作為土壤PAHs 污染的監測指標。多酚氧化酶為土壤中主要的木質素降解酶，能催化PAHs 開環，生成較易降解的中間產物，在PAHs降解過程中起著關鍵作。

圖5 外加氮磷養分對土壤中多酚氧化酶活性的影響Figure 5 Effects of additional nitrogen and phosphorus on the polyphenol oxidase activity in the contaminated soil

2.5 土壤酶活性與熒蒽去除的相關性

相關性分析表明，污染黃棕壤中多酚氧化酶活性與熒蒽的去除率呈極顯著正相關（r=0.850，P＜0.01），與黃棕壤中熒蒽的半衰期呈顯著負相關（r=?0.612，P＜0.01）。該結果與梁小翠等的研究報道一致，樟樹幼苗土壤多酚氧化酶活性與PAHs 去除率呈顯著正相關（r=0.360，P＜0.05）。氮磷添加通過提高土壤多酚氧化酶活性，促進了污染黃棕壤中熒蒽的去除。由劉世亮等研究土著微生物對苯并[a]芘在土壤中的降解作用可知，多酚氧化酶活性與土壤中苯并[a]芘的降解速率相關，即多酚氧化酶活性增長越快，土壤中苯并[a]芘的降解率越高。WANG 等研究了PAHs污染土壤的生物修復及其對土壤酶活性的影響，結果也表明根際土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性與PAHs 濃度顯著相關，可作為土壤PAHs 的降解指標。ZHU等的研究表明，PAHs 污染對土壤酶活性的影響較大，多酚氧化酶和磷酸酶對土壤反應敏感，多酚氧化酶可以作為修復過程中土壤環境質量的指示者。研究結果同時表明多酚氧化酶、酸性磷酸酶和脲酶間存在一定的顯著相關關系，如多酚氧化酶與脲酶呈顯著正相關（r=0.292；P＜0.05），這也說明微生物的各種生理代謝間存在一定的關聯。

3 結論

（1）通過在污染土壤中添加氮磷養分可顯著提高污染土壤中的多酚氧化酶活性，從而促進熒蒽的消除。

（2）本研究中通過外加氮磷可將土壤中的熒蒽半衰期最大縮短約78.4%。

（3）污染土壤中外加氮150~300 mg·kg、磷150~300 mg·kg時可達到較好的去除熒蒽的效果。