紫泥田水稻土細菌群落對不同農藝調控措施的響應

鐘俊杰，李曉鏡，尹澤潤，盛浩，聶三安

（湖南農業大學資源環境學院，長沙 410128）

稻田生態系統與人類關系密切。水稻是全球最大的糧食作物，養活了超過50%的人口。我國水稻種植面積占全國耕地總面積約25%，其產量約占全國糧食產量的1/2，水稻土是具有重大經濟意義的土壤資源，其生產力的穩定輸出對我國糧食生產和安全至關重要。湖南省是我國水稻的重要產區，其中紫泥田水稻土是湖南省的稻田土壤類型之一，其土壤黏粒含量較高、鹽基飽和度高、保水保肥能力較好、pH較低，某些地區重金屬鎘背景值較高。

土壤微生物是反映土壤質量的敏感性指標。土壤細菌是土壤微生物中占比最高的類群，具有繁殖周期短、數量多等特點，在土壤物質循環和能量流動的關鍵環節中發揮重要作用。袁紅朝等發現紅壤性水稻土細菌優勢種群為變形菌門和放線菌門，施肥和秸稈還田提高了變形菌種群豐度，土壤pH 和有機碳是影響細菌群落結構的主要環境因子。黃泥田水稻土單施氮磷鉀降低了土壤細菌數目，影響細菌群落結構的主要因子為鹽度、孔隙度和總氮，而土壤pH影響較小。黃棕壤性水稻土細菌優勢種群為綠彎菌門、變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，有機肥對細菌群落α多樣性影響較小，但單施化肥能提高土壤細菌群落豐富度?？梢姡就良毦郝涫苁┓屎陀袡C物料的影響，但其對農藝措施改良鎘污染稻田時的響應鮮有報道。

已有研究表明，鎘對土壤微生物組成與多樣性具有一定影響。隨著土壤鎘含量的增加及污染時間的延長，土壤微生物群落數量呈明顯減少趨勢，且高濃度鎘污染顯著抑制土壤微生物的生長；鎘含量和活性組分對物種群落具有較大影響，土壤細菌豐度和多樣性與鎘污染程度呈負相關。常用調控土壤鎘的農藝措施有施石灰、施肥和土壤改良技術等。石灰可提高土壤pH，增加陽離子交換能力，降低土壤中交換態鎘含量；有機肥能夠提高土壤有機質含量，促進土壤中的鎘由交換態向其他形態（如有機態）轉化；土壤調理劑能夠調節土壤的物理、化學和生物學性狀，活化礦質養分，進而降低鎘的有效性。然而，這些農藝調控措施對紫泥田稻田土壤微生物群落結構產生何種影響及不同處理之間的差異情況還有待探索。

因此，本研究擬選擇位于湖南省的紫泥田水稻土，設置石灰、有機肥和土壤調理劑3 種處理方式，研究不同農藝調控措施對紫泥田水稻土微生物群落組成、多樣性及群落物種差異，并分析菌群和環境因子之間的關系，研究結果可為紫泥田水稻土肥力保育與質量演變提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地位于湖南省株洲市株洲縣紫泥田典型區域，該地區地貌為湘江中游典型低丘崗地，是典型的中亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫17.5 ℃，年平均降雨量1 389 mm。試驗地土壤由紫色板、頁巖風化物發育而來，屬于紫泥田土種，該土種占湖南省土壤面積的7.86%。該地區水稻種植超過50 a，長期精耕細作，種植制度為雙季稻?冬閑。農田水利基礎設施良好，排灌方便。試驗區水稻土亞類為發育良好的潴育性水稻土，土壤剖面氧化還原交替作用強烈，土體構型為典型A?P?W1?W2型，水耕熟化度高。供試土壤試驗前表層土（0~20 cm）的基本理化性質見表1。

表1 試驗地0~20 cm表土的初始理化性質Table 1 Initial physiochemical properties in the studied paddy field sites（0~20 cm）

1.2 試驗設計

試驗始于2015年3月，在所選種植樣區內選擇形狀較為規整的9 塊稻田作為試驗田，每個試驗田面積0.1~0.3 hm，從中間隔開，分別設置對照組和處理組。共3 個處理，分別為商品有機肥、石灰和土壤調理劑，各處理3 次重復。有機肥采自長沙綠豐源生物有機肥料有限公司，主要原料為雞糞（有機質含量≥45%、N+PO+KO≥5%），總鎘含量0.28 mg·kg；石灰CaO含量約為76%，總鎘含量0.26 mg·kg；土壤調理劑為無機型產品（N+PO+KO=8%、有效鈣≥20%、有效鎂≥12%），pH10~12，呈堿性，總鎘含量0.25 mg·kg。在早、晚稻翻耕時，人工施撒石灰、商品有機肥和土壤調理劑，其中商品有機肥和石灰用量為2.25 t·hm，土壤調理劑用量為3 t·hm。為防止串灌，各處理修筑獨立的排、灌水溝，耕作、水肥和病蟲害處理方式同大田生產。早稻品種為湘早秈17 號，種植密度為35×10株·hm；晚稻品種為天優華占，種植密度為28×10株·hm。養分總投入量折算成純N、PO和KO后分別為142.5、30.0 kg·hm和87.0 kg·hm，其中基肥施用復合肥（N∶P∶K=18∶5∶7），用量為600 kg·hm，追肥為尿素和氯化鉀，均在分蘗期施用75 kg·hm。

1.3 樣品采集與分析

樣品采集于2020年10月，采用自制非金屬土鉆，采用“S”取樣法，在18 個小區內采集耕層（0~20 cm）混合土壤樣品，每個小區5 個采樣點。土壤樣品帶回室內，除去土壤異物，風干后研磨，分別過10、60 目和100 目尼龍篩用于理化性質指標的測定。成熟期在各處理小區內隨機選取5 個樣點采集耕層（0~20 cm）的新鮮土壤帶回室內，迅速剔除礫石、動植物殘體等土壤異物，混勻后于冰箱（?20 ℃）中避光保存，用于土壤微生物指標的測定。

土壤相關理化性質分析參照《土壤農業化學分析方法》。其中，土壤pH 采用電位法（水土比=2.5∶1）測定；陽離子交換量（CEC）采用1 mol·L乙酸銨交換法測定；有效態鎘采用DTPA 浸提，火焰原子吸收分光光度計法測定；總鎘采用硝酸?鹽酸?高氯酸?氫氟酸消解，石墨爐原子吸收分光光度法測定；有機碳（SOC）采用高溫外加熱重鉻酸鉀氧化?容量法測定；全氮（TN）采用凱氏定氮法測定；全磷（TP）采用酸溶?鉬銻鈧比色法測定；土壤全鉀（TK）采用氫氧化鈉熔融法測定；土壤微生物量碳（MBC）采用氯仿薰蒸?KSO（0.5 mol·L）浸提法測定。

微生物組成、多樣性等指標送至北京百邁客生物科技有限公司測定。首先用PowerSoil DNA 試劑盒（MoBio Laboratories，美國）提取土壤總DNA，用80 μL DES 溶解后，通過Agarose Gel DNA 試劑盒（Takara Bio Inc，日本）進行純化，超微量紫外分光光度計Nanodrop ND?2000 進行濃度檢測。采用16S V4 區515F和806R為引物進行PCR擴增，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并經GeneJETGel Extraction 試劑盒（Thermo Scientific，美國）純化后進行文庫構建，質檢合格的文庫用PacBio Sequel測序。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2013 處理數據，用SPSS 23.0軟件進行顯著性檢驗（Duncan法）。細菌16S rRNA指標從原始數據中導出CCS 序列進行Barcode 識別，得到有效序列；質控后的序列進行OTU 劃分，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析，獲得各樣品在門分類學水平上的群落豐度圖；通過α多樣性分析研究單個樣品內部的物種多樣性，在97%相似度水平下進行多樣性指數（Ace、Chao1、Shannon 及Simpson 指數）分析；通過β 多樣性分析比較不同樣品在物種多樣性方面（群落組成及結構）存在的差異大小。主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）通過CANOCO 5.0（Microcomputer Power，Ithaca，美 國）進 行 限 制 性 排序。高通量測序多樣性指數等在百邁客生物云平臺運行（www.biomarker.com.cn）。

2 結果與分析

2.1 不同農藝措施對土壤理化性質的影響

由表2 可知，不同處理與相應對照相比，僅石灰處理顯著提高了土壤pH（P＜0.05）。石灰、有機肥和調理劑處理CEC、有效態鎘、總鎘、SOC、TN、TP、MBC無顯著性差異，但石灰和調理劑處理pH 顯著高于有機肥處理；調理劑處理TK 含量顯著高于石灰和有機肥處理。以上結果表明，5 a 的農藝調控措施在一定程度上改變了土壤主要理化性質。

表2 不同處理土壤基本理化性質Table 2 Basic physical and chemical properties of soil under different treatments

2.2 不同農藝措施對土壤微生物群落結構的影響

2.2.1 細菌OTU豐度及多樣性

由表3可知，在相同的田間管理下，各對照細菌α多樣性指數具有一定的差異，說明紫泥田水稻土田塊的異質性對細菌α 多樣性的影響較大。各處理和相應對照之間細菌α 多樣性指數均無顯著差異。ACE和Chao1指數表現為有機肥＞石灰＞調理劑，且有機肥與調理劑處理之間的差異達到顯著水平（P＜0.05）；有機肥和石灰處理的土壤細菌Shannon 和Simpson 指數差異不顯著，但顯著高于調理劑處理。以上結果表明，與對照相比，不同處理并未顯著改變紫泥田水稻土細菌α 多樣性，但各處理之間影響不同，田塊本身的異質性是造成細菌群落α多樣性差異的重要原因。

表3 不同處理土壤α多樣性指數（n=3）Table 3 Soil α diversity index of different treatments（n=3）

2.2.2 土壤細菌群落組成

根據土壤樣品OTU 中代表序列的物種注釋結果，選取相對豐度前10 的物種（門水平）生成柱狀圖（圖1）。石灰、有機肥和調理劑處理土壤細菌的主要菌群均為變形菌門（28.92%~43.15%）、酸桿菌門（6.40%~21.00%）、硝化螺旋菌門（5.18%~16.30%）、綠彎菌門（5.43%~16.48%）、擬桿菌門（4.03%~14.35%）和疣微菌門（4.45%~9.59%），累計相對豐度超過80%；另外還有相對豐度較低的浮霉菌門（1.61%~5.58%）、髕骨菌門（0.77%~6.28%）、芽單胞菌門（0.37%~3.48%）和己科河菌門（0.66%~2.50%）?？梢园l現，盡管各對照田間管理相對一致，但其土壤細菌的群落分布仍具有一定差異，說明田塊本身的異質性對紫泥田水稻土細菌群落物種相對豐度的影響較大。與對照相比，有機肥和調理劑處理提高了酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度，但降低了變形菌門、硝化螺旋菌門及擬桿菌門的相對豐度；石灰處理提高了變形菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門相對豐度，但降低了綠彎菌門和擬桿菌門的相對豐度。從不同處理方式上看，變形菌門的相對豐度排序為石灰＞有機肥＞調理劑；酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度排序為有機肥＞調理劑＞石灰；硝化螺旋菌門和擬桿菌門的相對豐度排序為石灰＞調理劑＞有機肥?？梢姡┯檬?、商品有機肥和土壤調理劑對紫泥田水稻土的細菌群落組成產生了不同影響。

圖1 不同處理土壤微生物群落組成（門水平，n=3）Figure 1 Soil microbial community composition under different treatments（Phylum，n=3）

2.2.3 各處理土壤細菌群落結構的PCA聚類分析

基于OTU 分類水平，采用PCA 聚類分析研究不同處理對紫泥田水稻土細菌β 多樣性的影響。根據各組對照和處理的結果（圖2a），主成分1（PC1）與主成分2（PC2）對各處理土壤細菌群落差異的解釋程度分別為44.27%和15.07%，合計59.34%?？梢钥闯?，盡管各對照田間管理相對一致，但其土壤細菌的群落分布仍具有一定差異，說明紫泥田水稻土細菌群落結構主要受田塊本身異質性的影響。從不同處理方式上看，調理劑處理與石灰和有機肥處理差異較大，且與對照相比具有一定差異；石灰和有機肥處理較為相近，說明石灰和有機肥處理后，紫泥田水稻土細菌群落結構未發生明顯變化。從對照組和處理組看（圖2b），對照組和處理組細菌群落結構相差較大，說明經石灰、有機肥和土壤調理劑處理后，紫泥田水稻土細菌群落結構發生了一定的變化。

圖2 不同處理土壤微生物群落結構β多樣性分析結果Figure 2 β diversity analysis results of soil microbial community composition in different treatments

2.2.4 土壤細菌群落的RDA分析

由圖3可知，RDA 分析中，第一排序軸（RDA1）和第二排序軸（RDA2）分別解釋25.16%和6.69%的變異。蒙特卡羅檢驗顯示，pH（=0.012）與TK（=0.028）對細菌群落結構改變效應顯著（＜0.05），CEC、TP、有效態鎘、TN、MBC 和SOC 對細菌群落結構改變效應不顯著（＞0.05）。在第一軸上，調理劑和調理劑對照細菌群落結構與pH、TK、CEC 和TP 呈正相關關系。有機肥處理細菌群落結構土壤理化因子集中分布在第一排序軸負半軸，它們的相關性依次為有效態鎘、TN、MBC 和SOC。石灰、石灰對照和有機肥對照細菌群落結構與已選取的理化因子相關性較小。由以上可知，pH 和TK 為紫泥田水稻土細菌群落結構的主要影響因子。

圖3 不同處理土壤微生物群落特征與環境因子的RDA排序圖（屬水平，n=3）Figure 3 RDA ranking diagrams of soil microbial community characteristics and environmental factors under different treatments（Genus level，n=3）

3 討論

3.1 不同農藝措施對土壤菌群組成、結構及多樣性的影響

細菌多樣性受土壤多種因素的影響。由于稻田生態系統受人為因素影響較大，田間土壤異質性在很大程度上影響了細菌α多樣性。本研究中，細菌多樣性分析結果表明，不同對照、對照與處理之間細菌α 多樣性發生了不同程度的變化，但總體上有機肥和調理劑處理提高了細菌α 多樣性。施用有機肥調控土壤pH 和可利用碳/氮源，在一定程度上能夠提高土壤微生物對碳源的利用能力，提高其代謝多樣性，進而提高細菌α 多樣性。土壤調理劑中的有機質可為微生物生命活動提供能源物質，也會影響微生物的代謝活動。本研究發現施用石灰降低了細菌α 多樣性。石灰本身對土壤具有一定的滅菌作用，且提高土壤pH 也可能會對原有微生物的生長造成影響；同時，長期施入石灰加速土壤有機質分解，腐殖質不易積累，致使土壤結構變壞，造成土壤板結，從而對微生物的生長不利。因此，不同農藝調控措施對紫泥田水稻土細菌群落多樣性的影響不同，且受田塊異質性影響較大。

高通量測序表明，3 種處理紫泥田水稻土細菌主要為變形菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和疣微菌門，這些是供試紫泥田水稻土的優勢菌群，這與劉昌等對黃泥土的研究結果相似，說明這些細菌在土壤養分循環過程中發揮重要作用。有機肥和調理劑處理中綠彎菌門的相對豐度高于對照，原因可能是有機肥和調理劑的輸入增加了土壤有機質含量，有利于綠彎菌門的繁殖。王立夫等研究表明變形菌門豐度與pH 呈正相關，綠彎菌門豐度與pH 呈負相關。蘭玉書等發現施用石灰降低了綠彎菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度。本研究發現，石灰處理變形菌門相對豐度有所提高，而有機肥和調理劑處理變形菌門相對豐度低于對照，可能原因是有機肥和調理劑處理提高了SOC 含量，而較高SOC 含量提高了某些微生物與變形菌門的競爭，從而不利于變形菌門的生長和繁殖。然而，石灰處理SOC 增加較少，且土壤pH 顯著增加，較高的pH 可能有利于變形菌門的生長。酸桿菌門在pH 較高的環境中生存困難，但本研究中3 種農藝措施處理后土壤酸桿菌門相對豐度較對照均有所提高，這很可能是因為pH 不是影響其生長的主要因素。研究發現擬桿菌門的豐度與土壤理化性質呈負相關，本研究3 種處理均一定程度上提高了土壤理化性質，擬桿菌門的相對豐度均低于對照，說明石灰、有機肥和調理劑的施入不利于擬桿菌門的生長和繁殖。主成分分析發現，農藝調控措施能夠改變紫泥田水稻土細菌群落結構。添加石灰、有機肥和復合調理劑可提高土壤肥力水平，增加有機質含量，改變土壤中微生物群落結構。綜上，農藝調控措施可以改變紫泥田水稻土細菌群落組成。

3.2 土壤理化性狀與土壤細菌群落結構的相關性

土壤理化性質和重金屬等環境因素會影響土壤微生物群落結構。本研究發現土壤pH 和TK 與細菌群落結構顯著相關。相關研究也表明pH是影響土壤細菌群落的重要環境因子，土壤pH 的變化會影響某些微生物（如酸桿菌門）的生長和代謝活動。本研究中，不同處理改變了酸桿菌門的相對豐度，且有機肥處理高于石灰和調理劑處理，可能原因是酸桿菌為嗜酸菌，本研究中石灰處理和調理劑處理的pH顯著高于有機肥處理，較高的pH可能在一定程度上抑制了酸桿菌門的生長。土壤TK也是影響紫泥田微生物群落結構的重要因素。有研究表明，鉀含量與植煙土壤細菌群落結構顯著相關，鉀能夠提高赤紅壤微生物活性，進而改變微生物群落結構，由于不同處理鉀含量差別較大（表2），進而可能對土壤微生物群落產生不同影響。

本研究著重研究石灰、商品有機肥和土壤調理劑對鎘污染紫泥田水稻土細菌群落結構的影響，在一定范圍內揭示了紫泥田水稻土細菌群落結構和多樣性對不同處理的響應機制。基于現代的微生物分子生態學技術，如宏基因組文庫技術、熒光原位雜交技術及Biolog?ECO 微平板法等將有助于深入闡明稻田微生物對農藝調控措施的響應。由于土壤系統的復雜性和異質性，對細菌與土壤關鍵因子的響應機制有待深入研究。

4 結論

（1）紫泥田水稻土壤細菌優勢種群為變形菌門和酸桿菌門；石灰、商品有機肥和土壤調理劑處理均能提高酸桿菌門的相對豐度；石灰處理增加了變形菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度，但降低了綠彎菌門的相對豐度。

（2）3 種農藝調控措施對土壤細菌α 多樣性無顯著影響，但改變了細菌β多樣性。施用石灰和有機肥處理的土壤細菌OTU 數目和α 多樣性顯著高于土壤調理劑處理。

（3）土壤pH 和全鉀是影響紫泥田水稻土細菌群落結構變化的主要因子。