改性核桃殼生物炭對枯草芽孢桿菌SL?44的吸附

鄧子禾，田飛，武占省，*，陶治東，孫琳琳，楊帆，李海杰

（1.石河子大學化學化工學院，新疆 石河子 832000；2.西安工程大學環境與化學工程學院，西安 710000）

近年來，由于土地的不合理開發利用，越來越多的農田遭到破壞，土壤污染日益嚴重，耕地土壤質量問題尤為突出。據報道，我國16.1%的土壤未達到土壤環境質量標準，其中11.2%的土壤受到嚴重污染。因此，對污染土壤進行修復是當前研究的熱點。微生物修復由于具有效率高、成本低、產品無害等優點，應用越來越廣泛。影響生物修復的關鍵因素是微生物數量和活性，以及土壤養分和氧氣狀況。然而，被污染土壤通常不利于微生物的存活，因而能夠提升微生物適應性及穩定性的固體菌劑制備成了當前研究的熱點。吸附法由于操作簡單且對微生物活性影響較小，成為制備微生物菌劑的常用方法。有研究表明，載體種類在菌劑制備中尤為重要。生物炭由于含碳量高、穩定性好、表面官能團豐富、孔隙發達、具有較高的比表面積和陽離子交換量，可以為微生物的存活提供營養和有效庇護，同時具有改善土壤肥力和固碳的潛力。因此以生物炭為載體吸附微生物制備炭基菌劑，是提高菌體儲藏存活率、增強協同改良土壤效果的一種可靠方法。

吸菌量是評價載體性能的關鍵性指標，對生物炭進行改性的主要方向之一就是提高其對菌體的吸附能力，制備效果更好、性能更優的生物炭基菌劑。生物炭的吸附能力與其表面積、孔徑分布、表面官能團、陽離子交換能力等理化性質直接相關。化學改性能夠增加生物炭的表面積和吸附位點，以增強其對菌體的吸附性能。草酸等弱酸可通過酯化作用將羧基引入生物炭表面，不僅為菌體黏附提供吸附位點，還能夠有效降低土壤pH，促進環境中磷的溶解，使其易于被植物吸收。堿改性可以增加生物炭的正電性，減少生物炭與菌體之間的靜電斥力，另外氨基修飾可以為植物和微生物提供氮源，增加土壤的肥力，促進作物的生長。因此增加生物炭上氧氮官能團含量，既能增強生物炭與菌體的協同能力，用于改良土壤，還能增加生物炭的吸菌量。課題組前期從根際土壤中篩選獲得了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SL?44，已被證明能夠促進植物生長，具有固氮、溶磷、分泌IAA、緩解土壤鹽危害、生物防治和吸附重金屬等功效。另外SL?44優越的產孢性能對固體菌劑制備具有良好的適配性。但是，如何提高載體對菌體的吸附性能仍然是目前亟待解決的問題。

基于此，本文使用草酸和氨水對生物炭進行改性，探究生物炭性能變化對其吸附菌體的影響，揭示載體物理化學性質及環境對吸附菌體的影響規律，探究生物炭與SL?44的黏附位點及結合方式，為制備高效穩定的生物炭基菌劑提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料

菌 株：SL?44 經 課 題 組 篩 選 獲得。由于SL?44 在培養4 d 左右時達到最大生長量及芽孢產率，故選取培養4 d 的菌液，其芽孢產率達60%，OD值為（1.00±0.05）。核桃殼生物炭（CW）購自河南眾邦環保科技有限公司。

1.1.2 培養基

在LB 培養基中添加0.05%的MnSO·HO 作為產孢劑，然后將培養基的pH調節至7.0。

1.2 生物炭改性

稱量CW 各10.0 g，分別裝于50 mL 錐形瓶中，酸改性為分別加入30 mL配制好的5%、10%、15%草酸，氨水改性為分別加入30 mL 配制好的5%、10%、15%的氨水，放置于40 ℃、70 r·min的恒溫水浴搖床，振蕩12 h 后取出，用去離子水沖洗至pH 值不變。酸改性生物炭和氨水改性生物炭分別按照濃度從低到高標 記 為CCW5、CCW10、CCW15 和NCW5、NCW10、NCW15。

1.3 材料表征與分析

對CW 及酸堿改性的生物炭進行表征分析：pH使用酸度計（雷磁PHS?3C）測定；pH采用零點電荷法測定，即ΔpH=0所對應的pH；采用Beohm滴定法測定生物炭的表面官能團含量；利用X射線光電子能譜（XPS Thermo ESCALAB 250XI）測定生物炭表面C、N、O 元素占比；采用有機元素分析儀（Vario EL cube）測定生物炭中C、H、O、N、S的含量；根據Brunner?Emmet?Teller（BET）與Barrett?Joyner?Halenda（BJH）理論，使用全自動氣體吸附分析儀（Automated Gas Sorption Anlyzer，Autosorb?IQ）測定生物炭比表面積、孔徑及孔體積；采用Zetasizer Nano 測定3 種生物炭及SL?44 在pH=7 時的zeta 電位；采用掃描電鏡（SEM，Flex-SEM1000）對生物炭、SL?44 及炭基菌劑進行表面形貌特征分析；采用紅外光譜儀（FTIR，Nicolet 50）對材料進行表面官能團的測定。

1.4 實驗設計

1.4.1 標準曲線測定

待測SL?44 菌液經6 000 r·min離心、1∶1 重懸后，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用稀釋涂布平板法，測定對應活菌數。隨后取對應含量的菌液于100 ℃下裂解30 min，用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。繪制OD?蛋白含量（μg·mL）、蛋白含量（μg·mL）?活菌數（×10CFU·mL）、OD?活菌數（×10CFU·mL）的標準曲線，分別為：=119.3（=0.994***）、=0.406 4（=0.997***）、=48.49（=0.995***），***表示＜0.001。

1.4.2 吸附實驗

取出培養4 d 的SL?44 菌液，6 000 r·min離心后按1∶1重懸，根據1.4.1方法測定初始濃度。

取CW 及酸、堿改性的CW 樣品各0.1 g 加入100 mL 的錐形瓶中，在每個錐形瓶中加入50 mL 的重懸液（0.002 g·mL），調節pH=7，置于170 r·min搖床中吸附2 h。將吸附后的生物炭分別記為CW?SL、CCW?SL、NCW?SL。隨后測定生物炭材料的吸附平衡濃度，為提升菌體與生物炭的分離效果，采用密度梯度離心法：取上清液1 mL 覆蓋在60%的蔗糖溶液上，經1 500 r·min離心15 min 使生物炭與游離菌分離，取蔗糖上層液體100 ℃水浴30 min，根據1.4.1方法測定平衡濃度。由公式（1）計算吸附量：

式中：為平衡時的吸附量，CFU·g；、分別為初始、平衡時的濃度，CFU·mL；為溶液體積，mL；為吸附劑質量，g。

1.4.3 吸附動力學實驗

將50 mL SL?44 菌液分別與0.1 g CW 和不同處理的CCW、NCW 混合，調節pH=7，在28 ℃、170 r·min的水浴搖床中進行吸附。采樣時間點設為5、10、15、20、30、40、60、80、100 min，引入了兩種傳統的動力學模型對吸附進行擬合，如公式（2）、公式（3）所示：

式中：、q分別為平衡與時刻吸附量，CFU·g；和分別為擬一級和擬二級速率常數，CFU·g·min。1.4.4 吸附等溫線及熱力學分析

將SL?44 菌液配制為初始濃度的100%、80%、60%、40%、20%，另設置不含菌液的對照，各取50 mL，分別加0.1 g 的CW、CCW、NCW 進行吸附性能研究，調節pH 為7，在28、38、48 ℃的水浴搖床中（170 r·min）吸附2 h，測定載體和溶液當中菌體含量。吸附模型分別選取Langmuir模型和Freundlich模型：

式中：為平衡時溶液中菌體的濃度，CFU·L；、分別為平衡、飽和吸附量，CFU·g；為Langmuir 常數，L·CFU；和為Freundlich模型的經驗常數。

實驗中使用的熱力學參數包括吉布斯自由能變化、焓變和熵變，實驗溫度28、38、48 ℃。3 個熱力學參數通過熱力學方程（6）~（8）計算。

式中：為無量綱平衡常數，由×10L·CFU×轉化系數4.068×10CFU·mg×體系系數2 000 mg·L得到；為常數；為理想氣體常數，8.314 J·mol·K；為熱力學溫度，K；Δ為吉布斯自由能變，kJ·mol；Δ為焓變，kJ·mol；Δ為熵變，kJ·mol·K。

1.4.5 菌劑菌體存活性能

取CW、CCW15、NCW15 各0.1 g 與0.5 mL 的SL?44 重懸液混合，于50 ℃烘箱中烘干，隨后在室溫下保存，于第0、30、60、90、120 d 加入2 mL 去離子水重懸10 min，用稀釋涂布平板法記錄菌劑活菌數。

2 結果與討論

2.1 改性劑濃度對生物炭的影響

2.1.1 改性劑濃度對生物炭化學性能的影響

生物炭的pH 會影響其在土壤中的適用性，所以對改性生物炭的pH 進行了測定。CW、CCW5、CCW10、CCW15、NCW5、NCW10、NCW15 的pH 值分別為7.12、3.20、3.07、3.01、8.28、8.29、8.32。由此可知未改性生物炭為中性，草酸改性生物炭為酸性，氨水改性生物炭為弱堿性，改性前后生物炭的pH 值差異明顯，但相同類型不同濃度改性劑對pH 值的影響差異較小。調節土壤pH是改良酸堿土壤的常用方法之一，因此草酸改性生物炭適用于堿性土，氨水改性生物炭適用于酸性土。

研究表明，pH值越小，材料表面負電荷越多。如圖1所示，CW 的pH值在7左右，酸改性生物炭的pH值為6~7，堿改性生物炭的pH值為7~8。改性前后生物炭的負電性排序為CCW15＞CCW10＞CCW5＞CW＞NCW5＞NCW10＞NCW15。

圖1 不同濃度酸堿改性生物炭的pHPZCFigure 1 The pHPZC of modified biochar by different concentrations of acid or base

生物炭的pH 和表面電荷含量的差異，可能會引起生物炭表面官能團含量的變化。由表1 可知，草酸改性生物炭表面的總酸性官能團含量隨著草酸濃度的增加而上升，羧基的含量也隨之上升，但酚羥基的含量隨草酸濃度的增加而下降。氨水改性生物炭表面的總堿性官能團含量隨著氨水濃度增加而增加。兩種改性生物炭的官能團含量均有所增加，且酸改性生物炭官能團含量大于氨水改性生物炭。

表1 不同生物炭材料表面官能團的含量測定（mmol·g?1）Table 1 The surface functional groups of different biochars（mmol·g?1）

2.1.2 改性劑濃度對生物炭吸附性能的影響

為了研究改性劑對生物炭吸附菌性能的影響，在常溫下進行吸附實驗。由圖2 可知，生物炭負載SL?44 的數量排序為NCW15＞CCW15＞NCW10＞NCW5＞CCW10＞CCW5＞CW，總體上氨水改性生物炭的吸附性能略強于草酸改性生物炭，且生物炭對菌的吸附能力隨著改性劑濃度的增加而增加。CW 負載菌體數量 為1.041 9×10CFU·g，性 能 最 優 的NCW15 與CCW15 的菌體負載量分別為1.539 6×10CFU·g和1.493 5×10CFU·g。由此可以得出草酸和氨水改性均可顯著提高生物炭對菌體的吸附能力，草酸改性可提高43.34%，氨水改性可提高47.77%。后續對CW及改性生物炭中表現最優、代表性最強的NCW15 和CCW15這3 種生物炭進行深入探究。

圖2 不同生物炭吸附平衡時負載菌體量Figure 2 The adsorption equilibrium of biochars

2.2 表征分析

2.2.1 元素組成及BET表征分析

生物炭元素組成與其芳香性和炭化程度有關。如表2 所示，3 種生物炭含C 量均高于60%，與CW 相比，草酸與氨水改性分別提高了生物炭O 元素及N 元素的含量。O、N 含量的提高，意味著與CW 相比，CCW15 及NCW15 在土壤中被微生物利用的效率提高。

表2 生物炭元素組成Table 2 The composition of biochar elements

表面積、孔徑、孔容等性能是影響生物炭吸附能力的關鍵因素，因此對CW、NCW15 和CCW15 進行BET 表征。圖3（a）為炭材料的N吸附?脫附曲線，圖中3 種生物炭的吸/脫附曲線呈現相似趨勢。吸附速率先增加后穩定隨后再增加，為Ⅱ型等溫線（S 形等溫線），在低相對壓力區有拐點，而在蒸氣壓飽和時，吸附層數無限大，這表明炭材料以中孔為主，與葛欣宇等的研究結果相似。圖3（b）為炭材料的孔容分布曲線，由圖可知，CCW15 在3.7 nm 孔徑處，孔容出現增長，這可能是由于高濃度草酸使其微孔結構發生細微改變，使生物炭3.7 nm孔徑處的孔洞結構有所增加。CW、CCW15、NCW15 的比表面積為562~566 m·g，孔容為0.463~0.468 m·g，孔徑為3.28~3.34 nm，3 種材料的BET 總測試結果差異不明顯，表明這兩種改性方式對原始生物炭的物理結構改變較小。VITHANAGE等的研究也表明草酸改性對生物炭形貌的影響十分有限。改性生物炭材料均有較大的比表面積和較多的孔結構，證明其為合適的菌劑載體。同時，由于形貌結構無顯著差異，推測圖1 中吸附的差異可能是由炭材料化學性質的改變引起的。

圖3 N2吸附?脫附曲線及孔容分布曲線Figure 3 The N2 adsorption?desorption curve and the pore volume distribution curve

2.2.2 XPS分析

表3 生物炭表面C、N、O元素百分比（%）Table 3 Percentage of elements C，N and O in surface of biochar（%）

圖4 改性前后生物炭XPS圖Figure 4 XPS diagrams of biochars before and after modification

2.2.3 表面形貌

通 過SEM 對 負 載SL?44 前 后CW、CCW15、NCW15 的形貌結構進行觀察。改性前后均可觀察到生物炭的孔洞結構以及片層結構，且表面均有被侵蝕的痕跡（圖5），這表明氨水和草酸改性均未改變生物炭的表面形貌結構，與BET 測試結果一致。圖5（d）~圖5（f）顯示生物炭負載的SL?44 是橢圓形短棒狀結構，直徑約0.5~1.0 μm，且3 種生物炭表面均有大量SL?44 負載，這說明CW、CCW15、NCW15 均為適合的菌劑載體。

圖5 CW、CCW15、NCW15吸附菌體前后的掃描電鏡圖（×5 000倍）Figure 5 Scanning electron microscopy of CW，CCW15 and NCW15 before and after adsorption of SL?44（×5 000 times）

2.3 生物炭吸附菌體的機理研究

2.3.1 靜電力對菌體吸附的影響

官能團的改變會對生物炭的電負性產生影響，羧基會增加材料表面的電負性，而氨基可以使生物炭擁有更多的正電荷。為了研究靜電力對生物炭吸附SL?44的影響，測定了CW、CCW15、NCW15以及菌SL?44 在pH=7 時的zeta 電位，結果顯示，SL?44、CCW15、CW和NCW15的zeta電位分別為?30.3、?17.9、?15.6 mV 和?12.2 mV，與pH的測定結果相符。由于生物炭與SL?44 的zeta 電位值均為負值，在吸附過程中菌與炭之間會產生靜電斥力，且NCW15＜CW＜CCW15。由此可知，NCW15 的zeta 電位對吸附最有利，而CCW15 的zeta 電位對吸附最不利。但CCW15對菌劑的吸附性能強于CW，因此推測生物炭表面的化學基團對吸附產生了一定的影響。

2.3.2 表面官能團對菌體吸附的影響

圖6 SL?44與不同生物炭吸附SL?44前后的FTIR光譜圖Figure 6 FTIR of SL?44，and different biochars befor and after the absorption of SL?44

2.3.3 吸附動力學

通過吸附動力學研究生物炭吸附菌體的速率快慢，從而探討吸附過程的速率控制步驟。對CW、CCW15、NCW153 種代表性生物炭進行動力學分析，如表4 和圖7 所示，3 種生物炭達到吸附平衡的時間均在20 min 左右。擬一級動力學平衡吸附量為1.003 2×10~1.527 4 ×10CFU·g，擬二級動力學平衡吸附量為1.055 4×10~1.440 8×10CFU·g，兩者接近，且均與吸附實驗中測定的吸附量相近。CCW15 的吸附動力學常數最大，且最先達到吸附平衡，這可能與其表面含氧官能團數量最多，更易與菌結合有關。動力學模型擬合結果表明，擬一級動力學模型的決定系數為0.985~0.991，擬二級動力學模型模擬的值為0.983~0.985，所以擬一級動力學模型更符合炭對菌的吸附過程。動力學實驗表明生物炭對菌的吸附過程主要受液膜擴散的影響，與LIU等的研究結果相類似。3 種生物炭擬合所得值與實驗測定值近似，且擬一級、擬二級動力學常數皆大于0.95，說明兩種動力學模型均有較好的擬合度。擬二級動力學方程的擬合結果較好，表明吸附過程包括電子共享或電子得失等化學反應，表明3 種生物炭對SL?44 的吸附過程化學結合也發揮了非常重要的作用。

表4 生物炭吸附SL?44動力學模型參數Table 4 The kinetic model parameters of biochar adsorption for SL?44

圖7 3 種生物炭吸附SL?44的動力學曲線Figure 7 Adsorption kinetics curves of the three biochar for SL?44

2.3.4 吸附等溫線

通過吸附等溫線來研究吸附過程的界面平衡，以更深入地了解生物炭對SL?44 的吸附性能。由圖8可知，生物炭的平衡吸附能力隨菌液初始濃度的增加而增大。3 種生物炭的最大吸附量排序為NCW15＞CCW15＞CW，這表明改性使生物炭的平衡吸附量與最大吸附量均得到提升。對比表5 中與2可知，與Freundich 模型相比，Langmuir 模型能更好地擬合SL?44 在生物炭上的細菌吸附，這說明生物炭上的活性位點分布較為均勻，且吸附過程以單層吸附為主。隨著溫度的升高，3 種炭材料的值與值減小，說明反應的親和力減小，困難度變大，該結論與LIU等和WU 等的研究結果相類似。Freundlich 等溫線的1/小于1，說明該吸附反應易于發生，且1/越低表明生物炭與菌體越易結合。表5 中1/值與圖8 均說明，在28 ℃和38 ℃時生物炭吸附菌體能力為NCW15＞CCW15＞CW，且28 ℃時各平衡吸附量之間的差值大于38 ℃時。在48 ℃時CW 的吸附能力高于NCW15 的吸附能力。但常溫下生物炭對菌體的吸附量均遠大于48 ℃時，其中CW相差1.064×10CFU·g（提升10.0%）、CCW15 相差4.994×10CFU·g（提升48.5%）、NCW15 相 差6.002×10CFU·g（提 升61.6%），改性后的生物炭更適合在常溫下對SL?44進行吸附。

圖8 3 種生物炭在不同溫度下對SL?44吸附等溫線圖Figure 8 The adsorption isotherm of three biochars at different temperatures for SL?44

表5 生物炭吸附SL?44的Freundlich與Langmuir參數Table 5 Freundlich and Langmuir parameters of SL?44 adsorbed on biochar

2.3.5 吸附熱力學

吉布斯自由能、焓和熵是熱力學中常用的參數，如表6 所示，Δ＜0 說明生物炭對菌體的吸附反應可以自發進行，Δ＜0說明吸附為放熱反應，溫度升高會使反應的難度加大，且Δ的絕對值小于40 kJ·mol，說明吸附過程以物理吸附為主，這與吸附動力學分析結果相吻合。焓變的絕對值越大，溫度改變對吸附的影響越大，表中Δ＞Δ＞Δ，且差值較大，說明溫度升高對這3 種生物炭吸附菌的影響程度不同，且CW＜CCW15＜NCW15。除此以外，吸附焓變的絕對值隨著吸附質濃度的增加而變大，這說明吸附過程中，吸附質會優先占據有利的吸附位點，隨著吸附的進行，吸附的難度會變大，這表明了吸附劑的不均一性，擁有利于吸附的表面結構。CW、CCW15、NCW15 的Δ有正有負，但總體變化較小，這是由于吸附過程往往伴隨著溶劑分子的脫附，雖然被吸附的分子其運動被束縛，但脫附分子的運動趨于無序，當脫附分量子大于被吸附的SL?44的量時，體系的混亂程度增加，反之則減小。

表6 在不同溫度下生物炭吸附SL?44的熱力學參數Table 6 Thermodynamic parameters of SL?44 adsorption by biochar at different temperatures

2.3.6 吸附過程解析

圖9 生物炭改性及吸附過程Figure 9 Modification and adsorption process of biochar

2.3.7 菌劑菌體存活性能

如圖10 所示，活菌數隨著保藏時間的增加而下降。CW、CCW15、NCW15 的初始活菌數分別為4.19×10、4.47×10、5.28×10CFU·g，在保存120 d 后活菌數分別為2.14×10、2.33×10、3.44×10CFU·g。氨水改性生物炭與未改性相比，其活菌數提高26.01%，保藏4個月后，存活率分別為51.1%、65.2%，氨水改性使存活率亦提高14.1 個百分點，保藏前后活菌數均為NCW15＞CCW15＞CW，與生物炭載體的吸菌能力相吻合，然而3 種載體中NCW15 的活菌數遠高于CCW15與CW，這與在對載體吸菌能力的探究中，NCW15 與CCW15 的負載量相近且遠高于CW 不符。研究表明枯草芽孢桿菌的適宜pH 在6.79 左右，當pH＜5.5 或＞8.5 時，將對其生長存活不利，CW、CCW15、NCW15的pH 值分別為7.12、3.01、8.32，其中CW 的pH 與枯草芽孢桿菌的最適pH相近，而CCW15的pH值對SL?44 的存活不利。因此，雖然CCW15 的吸菌量遠大于CW，但兩者最終保存性能相似。

圖10 生物炭菌劑菌體存活性能Figure 10 Survivability of biochar bacteria

3 結論

（1）草酸改性在生物炭表面引入羧基、醛基、酮基官能團，氨水改性在生物炭表面引入氨基官能團，官能團的變化使生物炭的性能發生改變。草酸改性使生物炭電負性升高，氨水改性則使其電負性降低。改性前后生物炭的形貌結構得到保留，比表面積沒有降低，均在565 m·g左右。兩種改性均提升了生物炭的吸附能力，且隨著改性劑濃度的增加，吸菌量增加。與CW 相比，CCW15 和NCW15 的菌體吸附量提升了40%以上。

（2）生物炭吸附SL?44的過程雖然以物理吸附為主，但化學反應在吸附過程中也占有重要比重，且吸附過程主要為單分子層吸附，影響吸附的主要步驟是液膜擴散步驟。生物炭表面的羥基、羧基、醛基、酮基以及氨基官能團增加了化學吸附位點，在吸附過程中與菌體的羧基、氨基、磷酸基團以及酰胺結合，提升了生物炭在常溫下的吸附性能。

（3）生物炭吸附SL?44 的過程可自發進行，吸附過程是放熱行為，溫度升高會使吸附的難度加大。常溫更有利于改性生物炭對菌體的吸附。