醋糟生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄系統(tǒng)抗性的影響

裴廣鵬，李俞昕，朱宇恩，劉偉，李華*

（1.山西農業(yè)大學資源環(huán)境學院，山西 太谷 030801；2.山西大學環(huán)境與資源學院，太原 030006；3.山西省科技情報與戰(zhàn)略研究中心，太原 030024）

集約化作物生產系統(tǒng)中長期連作所引起的土傳病害對作物產量和農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的限制問題日益突出，農民的經濟利益因此遭到重大損失。同時，土傳病害的日益嚴重使得作物生產對農藥依賴程度越來越大，而農藥的大量使用又造成環(huán)境污染。其中，由尖孢鐮刀菌番茄專化型（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici Snyder and Hansen，以下簡稱尖孢鐮刀菌）引起的枯萎病是番茄的主要病害之一。目前，對于番茄枯萎病的防治方法主要包括物理防治、化學防治及生物防治，但是這些防治方法均存在不同程度的局限性。近年來，生物質炭作為集吸附劑、肥料和修復劑于一身的新型富碳材料在土傳病害防治方面的作用受到廣泛關注。生物質炭所具有的物理、化學和微觀結構等特性對防治土傳病原菌、提高作物抗病能力和產量等都具有顯著效果。

相對于由地上病原菌引起的病害，生物質炭對土壤環(huán)境中的病原菌及其引發(fā)的植物病害的抑制機制更加多樣化。這是因為生物質炭和土傳病原菌都存在于土壤中，二者之間存在直接和間接的相互作用。生物質炭抑制由土傳病原菌引起的植物病害的機制可能包括：（1）改善土壤養(yǎng)分含量和可利用性；（2）改良土壤理化特性；（3）吸附致病酶和毒性代謝物；（4）改變土壤微生物群落結構和多樣性；（5）誘導植物抗病性。其中，生物質炭誘導植物抗性的介導因子可能是生物質炭含有的化學物質或誘導的微生物。誘導植物的先天防御系統(tǒng)可以降低其對包括土傳病原菌在內的多種病原菌和寄生蟲引起的疾病的易感性。目前對生物質炭對植物抗性的影響研究僅有草莓灰霉病和白粉病、大豆葉枯病及番茄灰霉病和根腐病，關于生物質炭介導下的番茄系統(tǒng)抗性對枯萎病的作用效果還鮮有報道。另外，現有研究結果證實了生物質炭可以通過誘導植物抗性而降低其發(fā)病率，但其機理仍需進一步深入研究。因此，本研究旨在探討生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄體內抗氧化酶活性和非酶類抗氧化分子含量的變化及信號分子（水楊酸、茉莉酸和乙烯）相關基因表達的影響，為生物質炭在防治土傳病害中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗土壤采自山西省晉中市某農田表層土壤，土樣自然風干、去除雜質過篩后備用。土樣基本理化性質如下：土壤類型為粉砂質壤土，成土母質為沖積母質，土壤pH 7.95，陽離子交換量19.04 cmol·kg，有機質含量21.00 g·kg，全氮含量1.14 g·kg，速效磷含量47.01 mg·kg，速效鉀含量353.06 mg·kg。

番茄枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌由山西農業(yè)大學農學院提供。醋糟由山西省晉中市某醋廠提供。供試番茄品種為維也納二號。

1.2 生物質炭的制備

生物質炭的制備：以去除雜質后的醋糟為原料，將其置于真空氣氛爐中（SX2?12?10Q，武漢亞華電爐有限公司），在700 ℃且無氧環(huán)境下（通入氮氣）持續(xù)熱解2 h使醋糟完全炭化，冷卻至室溫，即得醋糟生物質炭。將生物質炭混合均勻后過100 目篩，貯于干燥器中備用。該生物質炭基本性質如下：pH 9.98（m∶V=1∶20），比表面積10.13 m·g，元素組成C 67.18%、H 1.49%、O 27.91%、N 3.10%、S 0.32%。

1.3 病原菌制備及接種

將尖孢鐮刀菌在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上進行活化和培養(yǎng)。在26 ℃下培養(yǎng)5 d 后，使用滅菌后的打孔器（6 mm）在菌落邊緣取菌餅6 個加入到100 mL 馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)于26 ℃、200 r·min下振蕩培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結束后將菌液離心濃縮（10 000 r·min，5 min），去掉上清液，然后將剩余菌液重懸在蒸餾水中，使用血球計數板對其進行計數。按每克土含有7.89×10個尖孢鐮刀菌孢子進行土壤尖孢鐮刀菌的接種，接種完成后培養(yǎng)一周備用。

1.4 盆栽試驗

番茄苗培育：挑選外形大小相近、無損傷且種粒飽滿的番茄種子，將其用1.5%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5 min，然后用蒸餾水反復沖洗5 次。將消毒后的番茄種子播種到育苗盤中，育苗基質為泥炭和凝灰?guī)r混合物（∶=7∶3）。待番茄苗長出4~5片真葉后用于后續(xù)盆栽試驗。

盆栽試驗在溫室大棚中進行。試驗共設4 個處理，分別為：（1）未經處理的土壤（CK）；（2）土壤接種尖孢鐮刀菌（FC0）；（3）土壤接種尖孢鐮刀菌后施加生物質炭，施加量為1%（FC1）；（4）土壤接種尖孢鐮刀菌后施加生物質炭，施加量為3%（FC3）。每個處理設置3 個重復，共計12 盆。每盆（盆口和底部直徑分別為16.0 cm 和13.0 cm，高17.5 cm）裝相當于2 kg干土質量的新鮮土壤（過3 mm篩）。將各處理土壤裝入盆中，選擇生長大小一致的番茄苗進行移栽，每盆移栽1 株番茄苗，然后將盆放入溫室大棚中培養(yǎng)，并按需澆水和除草。番茄生長60 d后，采取一部分番茄葉片分別測定光合色素和丙二醛含量、抗氧化酶活性、還原型和氧化型谷胱甘肽含量，同時，將一份番茄葉片經液氮速凍后存于?80 ℃冰箱，用于信號分子（水楊酸、茉莉酸和乙烯）相關基因、、、、、、、和的相對定量分析。

1.5 測試指標及方法

1.5.1 番茄枯萎病發(fā)病級別鑒定

觀察記錄番茄葉片黃化和枯萎情況，收獲后縱向剖開莖部記錄維管束褐變程度。番茄枯萎病分級標準如表1所示。

表1 番茄枯萎病分級標準Table 1 Classification standard of tomato Fusarium wilt

1.5.2 光合色素含量的測定

葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和類胡蘿卜素（Caro）含量采用95%乙醇提取?分光光度法（Cary 60 UV?Vis，Agilent，美國）測定（以鮮質量計）。葉綠素含量[Chl（a+b）]由Chl a和Chl b含量相加所得。

1.5.3 丙二醛含量的測定

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定（以鮮質量計）。

1.5.4 抗氧化酶活性的測定

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定分別采用氮藍四唑比色法、愈創(chuàng)木酚比色法和高錳酸鉀滴定法。抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽S?轉移酶（GST）活性分別采用試劑盒A123?1?1、A062?1?1、A004?1?1（南京建成生物工程研究所）進行分析，具體測試步驟參照說明書。其中，GR 和GST活性采用比活力表示，即每克蛋白質所具有的酶活力單位數；其余酶活性以每克鮮質量所具有的酶活力單位數表示。

1.5.5 非酶類抗氧化分子含量的測定

還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量的測定分別采用試劑盒A006?1 ?1、A061?2?1（南京建成生物工程研究所），具體測試步驟參照說明書。GSH 和GSSG 含量采用每克蛋白質所含有的質量表示。

1.5.6 基因表達量的測定

（1）總RNA的提取與cDNA合成

采 用OmniPlant RNA Kit（DNase I）試 劑 盒（CW2598S，北京康為世紀生物科技有限公司），根據說明書方法提取各樣品總RNA。然后采用HiScript Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（R123?01，南京諾唯贊生物科技有限公司）進行反轉錄。

（2）內參基因檢測cDNA模板質量

以反轉錄得到的cDNA 作為模板，加入PCR 反應體系中，體系如表2 所示，內參基因為。反應條件為50 ℃逆轉錄反應15 min，然后80 ℃2 min滅活逆轉錄酶。

表2 反轉錄反應體系Table 2 RNA reverse transcription reaction system

（3）熒光定量PCR檢測

采用熒光定量PCR 儀（9600plus，杭州博日科技有限公司）進行定量分析，反應體系如表3 所示。所用引物和反應程序見表4，其中為內參基因。以2計算各樣品基因相對表達量。

表3 qRT?PCR反應體系Table 3 qRT?PCR reaction system

表4 引物序列和qRT?PCR反應程序Table 4 Primers and procedures for qRT?PCR

1.6 數據統(tǒng)計分析

使用SPSS 25.0對試驗數據進行One?way ANOVA差異顯著性分析（＜0.05），每個處理設置3 次重復，試驗結果以“平均值±標準誤（SE）”表示。使用軟件OriginPro 2018做圖。

2 結果與分析

2.1 生物質炭對番茄發(fā)病級別的影響

從圖1 可以看出，與CK 相比，在尖孢鐮刀菌脅迫下，番茄病害程度顯著增加。隨著生物質炭的施加，番茄病害程度顯著降低。當生物質炭施加量為1%時，番茄病害程度比尖孢鐮刀菌脅迫處理顯著降低。繼續(xù)增加生物質炭施加量至3%，番茄病害程度較施加量為1%的處理沒有顯著變化。

圖1 生物質炭對番茄發(fā)病級別的影響Figure 1 Effects of biochar on disease severity of tomato

2.2 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄光合色素含量的影響

生物質炭介導對尖孢鐮刀菌脅迫下光合色素含量的影響如圖2 所示。在尖孢鐮刀菌脅迫下，番茄葉片光合色素含量較CK 均明顯降低，Chl（a+b）、Chl a、Chl b 和Caro 含量分別比CK 降低了29.06%、29.13%、28.89%和13.59%。隨著生物質炭的施加，番茄葉片光合色素含量較尖孢鐮刀菌脅迫處理顯著升高（＜0.05），且含量基本可恢復到CK 組水平。當生物質炭施加量為1%時，Chl（a+b）、Chl a、Chl b和Caro含量分別比尖孢鐮刀菌脅迫處理顯著增加了29.65%、21.76%、51.57%和24.65%。繼續(xù)增加生物質炭施加量至3%，番茄葉片光合色素含量較施加量為1%的處理沒有顯著變化。以上結果表明，生物質炭的介入可顯著緩解尖孢鐮刀菌脅迫對番茄光合作用造成的不利影響。

圖2 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄葉片光合色素含量的影響Figure 2 Effects of biochar on the content of photosynthetic pigments in tomato leaves under Fusarium oxysporum stress

2.3 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄丙二醛含量的影響

生物質炭介導對尖孢鐮刀菌脅迫下MDA 含量的影響如圖3 所示。當番茄植株遭受尖孢鐮刀菌脅迫后，其體內MDA含量顯著高于CK，增加量為72.17%，表明番茄受逆境傷害程度較高。隨著生物質炭的施加，番茄體內MDA 含量較尖孢鐮刀菌脅迫處理時顯著降低，當生物質炭施加量為1%和3%時，MDA 含量分別降低了27.07%和27.17%。以上結果表明，生物質炭可緩解尖孢鐮刀菌帶來的脅迫。

圖3 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄體內丙二醛含量的影響Figure 3 Effects of biochar on the content of malonaldehyde of tomato under Fusarium oxysporum stress

2.4 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄抗氧化酶活性的影響

生物質炭介導對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄體內抗氧化酶活性的影響如圖4所示。由圖4a可知，尖孢鐮刀菌脅迫下番茄CAT 活性較CK 顯著增加了61.48%。隨著生物質炭的施加及其施加量的增加番茄CAT 活性進一步升高。當生物質炭施加量為1%和3%時，番茄CAT活性分別較CK增加了88.02%和104.51%。

由圖4b 可知，與CK 相比，尖孢鐮刀菌脅迫對番茄體內SOD 活性無顯著影響，且生物質炭在低施加量下（1%）同樣對SOD活性無顯著影響。繼續(xù)增加生物質炭用量至3%時，番茄SOD 活性顯著提高，較尖孢鐮刀菌脅迫處理增加17.11%。由此可見，較高添加量（3%）的生物質炭對SOD活性有促進作用。

由圖4c可知，與CK相比，番茄植株遭受尖孢鐮刀菌脅迫時，其體內POD 活性顯著升高，增加量為16.11%。但隨著生物質炭的施加，番茄體內POD活性較尖孢鐮刀菌脅迫處理顯著降低，并恢復到CK水平。

由圖4d 可知，與CK 相比，番茄植株遭受尖孢鐮刀菌脅迫時，其體內APX 活性顯著降低，比CK 降低了30.11%。隨著生物質炭的施加，番茄體內APX 活性較尖孢鐮刀菌脅迫處理升高，且在生物質炭施加量為1%時達到最高，顯著增加了18.62%，但仍低于CK處理；在生物質炭的施加量至3%時，番茄體內APX活性卻較1%時顯著降低。

由圖4e 可知，與CK 相比，番茄遭受尖孢鐮刀菌脅迫后，其體內GR 活性無顯著變化。但隨著生物質炭施加，番茄體內GR 活性卻顯著上升，當生物質炭施加量為3%時，GR活性比CK增加46.96%。

由圖4f 可知，與CK 相比，番茄遭受尖孢鐮刀菌脅迫后，其體內GST活性顯著升高（＜0.05），比CK 增加44.60%。隨著生物質炭施加量的增加，番茄GST活性呈現先升高后降低的趨勢，當施加量為1%，GST活性最高，且比CK增加了75.43%。

圖4 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄抗氧化酶活性的影響Figure 4 Effects of biochar on the antioxidant enzyme activities of tomato under Fusarium oxysporum stress

2.5 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄非酶類抗氧化分子含量的影響

前述結果顯示施加生物質炭可緩解尖孢鐮刀菌入侵引起的氧化損傷，降低MDA 的積累。為進一步探究生物質炭緩解氧化損傷的作用，本研究分析了生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄GSH 和GSSG 含量的影響，結果見圖5。在尖孢鐮刀菌脅迫下，番茄體內GSH 含量升高，但與CK 差異不顯著（圖5a）。但隨著生物質炭的施加，番茄體內GSH 含量較CK 和尖孢鐮刀菌脅迫下的含量顯著升高，在生物質炭施加量為1%和3%時，較CK 分別增加了38.55%和40.99%。番茄植株遭受尖孢鐮刀菌脅迫時，其體內GSSH 含量較CK 顯著增加了37.30%（圖5b）。隨著生物質炭的施加量的增加，GSSG含量呈現下降趨勢，且施加量為3% 時，GSSG 含量較尖孢鐮刀菌脅迫時降低了14.84%。進一步分析谷胱甘肽的GSSG/GSH 值可知（圖5c），在尖孢鐮刀菌脅迫下，GSSG/GSH 值升高，但與CK差異不顯著。隨著生物質炭的施加，GSSG/GSH值逐漸降低，且施加量為3%時，GSSG/GSH 值達到最低。以上結果表明，生物質炭介導提高了番茄體內的還原力，可清除植物體內因外界脅迫而產生的過量活性氧。

圖5 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄谷胱甘肽含量的影響Figure 5 Effects of biochar on the contents of glutathione of tomato under Fusarium oxysporum stress

2.6 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄抗性相關基因表達的影響

為了探究生物質炭介導對尖孢鐮刀菌脅迫下番茄抗性的影響，進一步分析了可能參與番茄系統(tǒng)防御反應的通路相關基因表達情況，包括、、（參與水楊酸合成或信號傳導）、、、（參與茉莉酸合成或信號傳導）和、、（參與乙烯合成或信號傳導）。結果表明，在生物質炭的作用下，水楊酸相關基因、和的轉錄出現下調（圖6a~圖6c），茉莉酸相關基因、、的轉錄卻呈現上調（圖6d~圖6f）。同時，對乙烯信號通路中，尖孢鐮刀菌和生物質炭均能上調基因和的表達（圖6g、圖6i），但基因卻呈現下調（圖6h）。

圖6 生物質炭對尖孢鐮刀菌脅迫下參與水楊酸、茉莉酸及乙烯生物合成和/或信號轉導相關基因表達的影響Figure 6 Effects of biochar on the transcription of genes involved in the endogenous biosynthesis and/or signaling of salicylic acid，jasmonic acid and ethylene under Fusarium oxysporum stress

3 討論

生物質炭對多種植物病害表現出抑制作用，其作用機理可能涉及到生物質炭?土壤、生物質炭?植物、土壤?植物和生物質炭?土壤?植物系統(tǒng)等多個體系的相互作用。生物質炭對存在于土壤中的病原菌有直接或間接的抑制作用，其可通過改良土壤性質、吸附細胞壁降解酶和毒性代謝物及提高土壤微生物群落多樣性等作用抑制病原菌向植物的入侵，同時，生物質炭可激活植物對病原菌的防御能力。本研究結果表明，生物質炭可從抗氧化酶活性、非酶類抗氧化分子含量及信號分子（水楊酸、茉莉酸和乙烯）相關基因表達方面提高番茄抗性，降低尖孢鐮刀菌對番茄的脅迫。

在尖孢鐮刀菌脅迫下，番茄體內CAT、POD、GR和GST 活性顯著增加，SOD 活性無顯著變化，而APX活性顯著降低。隨著生物質炭的施加，番茄體內CAT、SOD、GR、APX和GST活性較尖孢鐮刀菌脅迫時顯著增加，而POD 活性顯著降低。APX 在宿主植物的病害防御過程中具有重要作用，其可通過建立結構屏障或通過產生大量活性氧和活性氮創(chuàng)造劇毒環(huán)境來限制感染細胞的擴散。但活性氧的過度積累會破壞細胞膜結構和功能，進而使得病原菌更容易入侵。因此，植物會產生“解毒酶”（包括CAT、SOD、GR 和GST）來降低過量活性氧的危害。在本研究中，生物質炭可提高尖孢鐮刀菌脅迫下番茄體內“解毒酶”活性，說明生物質炭能較好地緩解尖孢鐮刀菌入侵造成的番茄植株過氧化現象，進而防御其入侵。

JAISWAL 等比較了接種病原菌并經生物質炭處理和未接種病原菌且未添加生物質炭處理組的植物基因表達模式的差異，結果表明，生物質炭處理對被病原菌侵染的植物基因表達具有啟動效應。啟動效應是誘導性系統(tǒng)抗性和系統(tǒng)獲得性抗性的一個重要組成部分，并通過依賴于茉莉酸、水楊酸、乙烯、脫落酸、活性氧和苯丙素類的通路介導。本研究發(fā)現，與對照處理相比，尖孢鐮刀菌脅迫和生物質炭的施加對番茄系統(tǒng)防御的啟動效應主要依賴于茉莉酸和乙烯通路介導。JAISWAL 等通過設置番茄茉莉酸缺失突變體為對照的方法證實在生物質炭介導下，茉莉酸通路在番茄對尖孢鐮刀菌（f. sp.Jarvis and Shoemaker）的抗性中發(fā)揮關鍵作用。事實上，茉莉酸作為一種信號分子，可參與各種植物的發(fā)育和防御過程，在草莓中也發(fā)現了由生物質炭介導的茉莉酸參與的葉面病原菌的防御過程。

在本研究中，與水楊酸合成和信號傳導相關的基因全部呈現下調，該結果與JAISWAL 等學者的研究結果相同。其研究結果表明水楊酸對番茄抗病有負面影響，且水楊酸和茉莉酸相關的防御通路之間存在相互拮抗作用。同樣，有研究指出在對死體營養(yǎng)型病原菌的免疫過程中，茉莉酸是必需的，而水楊酸的拮抗作用可能導致植物對病原菌更加敏感。但有報道得到不同的研究結果，MELLER 等研究了生物質炭對草莓灰霉病、炭疽病和白粉病的抗性，通過分析葉片中與抗性相關的基因表達，發(fā)現草莓在接種病原菌后，生物質炭處理同時誘導了水楊酸途徑相關的系統(tǒng)獲得性抗性和茉莉酸及乙烯途徑相關的誘導性系統(tǒng)抗性，從而增強植物的抗病性。MEHARI 等的研究表明生物質炭在降低番茄灰霉病發(fā)病率的同時，顯著上調與乙烯和水楊酸途徑相關的抗病基因的表達，進一步證實生物質炭介導植株的抗病性與水楊酸代謝途徑有關。造成這一不同現象的原因可能與生物質炭的制備原料、宿主植物種類以及病害類型等密切相關。

4 結論

（1）生物質炭可顯著提高番茄葉片光合色素含量，同時可顯著降低因尖孢鐮刀菌脅迫造成的丙二醛含量增加。

（2）生物質炭可通過增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽S?轉移酶活性來降低過量活性氧造成的細胞損傷。同時，非酶類抗氧化分子還原型谷胱甘肽在生物質炭的作用下得到有效提高，且氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽比值也顯著降低。因此，生物質炭的介入可從不同途徑增強番茄的抗氧化能力。

（3）施加生物質炭可增強番茄系統(tǒng)防御尖孢鐮刀菌入侵的啟動效應和能力，主要依賴于茉莉酸和乙烯的通路介導。同時，發(fā)現水楊酸和茉莉酸相關的防御通路之間可能存在相互拮抗的作用。