我國長三角地區淡水池塘養殖水產品中抗生素殘留及對人體暴露的貢獻評價

賈斌，庾旸，馬海川，陳以芹*，李娟英

（1.上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306；2.上海中學東校，上海 201306）

近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們越來越重視健康科學的飲食結構。水產品中含有豐富的蛋白質和礦物質，營養價值較高，是人類主要的高蛋白食物之一。隨著水產品產量的穩定增長，我國已成為世界上最大的水產品生產和消費國。雖然我國對水產養殖業抗生素的使用進行管控，但實際密集養殖中，抗生素顯著的抗菌能力和低副作用使其成為水產養殖疾病防治的常用藥物。然而研究發現只有20%~30%的抗生素能被水產品吸收和利用，剩余的殘留在養殖水體或蓄積到底泥中的抗生素，不僅會改變環境中的微生物區系，對細菌產生選擇壓力誘導抗生素抗性基因的產生，還會導致養殖產品中殘留藥物通過食物鏈傳播，從而對人體健康產生潛在的威脅。

同期研究發現，人體尿液中抗生素的檢測頻率較高，人群已經暴露于多種人用或獸用抗生素。尿液抗生素是潛在的人體暴露的生物標志物，基于尿液中抗生素的代謝物濃度可估算每日暴露總量。將水產養殖食品中抗生素的每日攝入量與估算的每日總暴露量進行比較，即可量化通過食用水產品暴露途徑的相對貢獻，從而評估食用水產品是否為人體抗生素主要途徑。因此，本研究的具體研究目標包括：（1）評估我國長三角地區淡水水產品肌肉中抗生素的殘留量；（2）估算通過水產品攝入抗生素的每日暴露量，并根據尿液中的抗生素殘留估算抗生素的每日總攝入量；（3）確定食用水產養殖產品對不同人群（兒童、成人、孕婦）的抗生素每日總暴露量的貢獻范圍，為人們的合理膳食提供科學數據，同時為水產養殖業的綠色可持續發展提供管理依據。

1 材料與方法

1.1 化學藥劑

基于所研究的水產養殖區域中抗生素的檢測頻率，選擇了9 種目標抗生素，其中磺胺甲嘧啶（SMZ）、磺胺甲惡唑（SMX）、磺胺嘧啶（SDZ）、恩諾沙星（EFX）、諾氟沙星（NFX）、氧氟沙星（OFX）、環丙沙星（CFX）和甲氧芐啶（TMP）購自Dr. Ehrenstorfer GmbH（德國），羅紅霉素（RTM）購自Sigma?Aldrich（美國）。內標磺胺嘧啶（SMR）購自Dr. Ehrenstorfer GmbH（德國），環丙沙星?D（CFX?D）和紅霉素?C ?D（ETM?C?D）購自多倫多研究化學公司（加拿大）。SMR 作為SDZ、SMZ、SMX 和TMP 的內標，CFX?D作為NFX、CFX、OFX 和EFX 的內標，ETM?C?D作為RTM 的內標。HPLC 級的甲醇、乙腈、甲酸和乙酸銨購自Sigma?Aldrich（美國）。乙二胺四乙酸為分析純，購自耀華化學試劑廠（中國）。檸檬酸和檸檬酸鈉為分析純，購自阿拉丁試劑有限公司，Oasis HLB SPE 萃取柱（6 mL，200 mg）和SMX 柱（6 mL，500 mg）購自Varian（美國）。

1.2 樣品采集

本研究采集了我國上海、浙江、江蘇、安徽、福建5 個地區（圖1）淡水養殖池塘中常見的3 大類共21 份水產品，其中魚類包括草魚（）、鰱魚（）、武昌魚（）、鱸魚（）、鳙魚（）、黑魚（）、鯉魚（）；蟹類包括中華絨螯蟹（）；蝦類包括羅氏沼蝦（）。生物樣品基本信息見表1。采集的樣品均為即將上市的水產品。樣品用鋁箔袋密封包裝后低溫運輸至實驗室，冷凍干燥并置于?20 ℃冰箱保存。

表1 生物樣品基本信息Table 1 Basic information of marine organisms

圖1 采樣點分布圖Figure 1 The sampling sites of this study

1.3 樣品預處理及檢測

取2 g預先冷凍干燥并研磨過篩的生物肌肉樣品于30 mL的玻璃離心管中，向離心管中依次加入10 mL檸檬酸鈉緩沖溶液、10 mL 乙腈和10 μL 的3 種內標品。依次振蕩10 min、超聲15 min、離心15 min（3 000 r·min）。重復3次并收集上清液至200 mL的圓底燒瓶中。將圓底燒瓶在50 ℃的恒溫加熱板上進行蒸發，并用超純水稀釋至200 mL 使得溶液中的有機溶劑含量低于5%。將溶液通過SAX 柱和SPE 柱串聯萃取，洗脫并氮吹，最后用乙酸銨溶液定容至200 μL，經0.22 μm 針頭式濾膜過濾樣品至2 mL 棕色進樣瓶中。

采用LC?MS/MS（Agilent 液相色譜1200 系列LC系統和Agilent 6460 TSQ Quantum LC?MS，美國）進行分析。色譜條件：Agilent Plus?C18 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃；流動相A 為0.2%甲酸和2 mmol·L乙酸銨水溶液，B為乙腈溶液；流速為0.3 mL·min。質 譜 條 件：離 子 源 為 電 噴 霧 電 離（ESI+）；毛細管電壓3.5 kV；離子源溫度120 ℃；氣體溫度325 ℃，流速6 L·min；霧化器壓力310 kPa；錐孔氣流速11 L·min；檢測模式為MRM。

1.4 健康風險評估

通過食用魚、蝦和蟹類3 種常見的水產品，人體每日抗生素攝入量（Estimated daily intake，）的計算公式如下：

式中：為人體抗生素日攝入量，μg·kg·d；為水產品中的抗生素含量，g·g（魚類的含水量為70%、蝦類為80%、螃蟹類為75%）；為水產品的每日攝入率，g·kg·d。水產品的每日消費量數據基于文獻[14]。具體而言，兒童魚、蝦、蟹水產品攝入量分別為0.71、0.13、0.59 g·kg·d；成人魚、蝦、蟹水產品攝入量分別為1.20、0.22、1.00 g·kg·d，孕婦魚、蝦、蟹水產品攝入量分別為1.07、0.20、0.89 g·kg·d。

根據尿液中相應的抗生素的濃度，用公式（2）計算通過所有可能的暴露途徑估計的抗生素的每日攝入量（Daily exposure dose，）：

式中：為抗生素日暴露量，μg·kg·d；為尿液中抗生素的濃度，μg·mL，數據來源為涉及上海435名3~18歲健康兒童、我國東部地區854名16~42歲的健康孕婦、上海822 名20~75 歲的健康成年人尿液抗生素數據的3 份已有研究；為平均每日尿量，24 mL·kg·d，孕 婦 平 均 每 日 尿 量 為21 mL·kg·d；為抗生素的排泄比例（未改變和呈葡萄糖醛酸結合形式，表2）。尿液抗生素低于檢出限時，按照檢出限（LOD）的1/2值計算。

表2 未改變和呈葡萄糖醛酸結合形式的尿液中9種抗生素的排泄率[18]（%）Table 2 Excretion proportions of 9 antibiotics in urine as unchanged and glucuronide?conjugated species（%）

人體總抗生素暴露的貢獻率（）計算如公式（3）所示：

1.5 質量控制與保證

生物樣品的回收率為68%~105%，相對標準偏差小于15%，檢出限為0.015~0.016 ng·g（干質量），同時設定2個空白樣和2個平行樣。

2 結果和討論

2.1 水產品中抗生素殘留特征

本研究中9 種目標抗生素均有檢出（表3），檢出頻率在38.1%（磺胺嘧啶）~90.5%（恩諾沙星）之間。抗生素在水產品中的平均濃度順序為磺胺甲惡唑＞恩諾沙星＞磺胺嘧啶＞諾氟沙星＞氧氟沙星＞甲氧芐啶＞羅紅霉素＞磺胺甲嘧啶＞環丙沙星。其中磺胺甲惡唑的檢出濃度最高，為25.25 ng·g（以干質量計），其次是恩諾沙星，為17.65 ng·g（以干質量計），比其他檢測到的抗生素濃度高2~4個數量級，這可能與不同養殖品種使用的抗生素種類和劑量不同有關。除羅紅霉素沒有最大殘留限量值外，其余8 種抗生素的檢出值均低于《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》（NY 5070—2002）和《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中的最大殘留限量（MRL）。

表3 淡水養殖水產品中抗生素的濃度和檢出率（n=21）Table 3 Concentration and detection rate of antibiotics in freshwater aquaculture products（n=21）

魚、蝦和蟹3 種水產品抗生素的平均濃度分別為4.27、4.56 ng·g和0.56 ng·g（圖2），魚類和蝦類體內抗生素殘留濃度較高，可能是由于蟹類的生長和攝食條件優于魚類和蝦類，不易感染疾病，養殖過程中抗生素使用量較少。此外抗生素的濃度還受到許多其他因素的影響，例如性別、生長階段以及飼料抗生素添加劑的停藥期等，這還有待進一步研究。恩諾沙星和磺胺甲惡唑是魚類檢出的主要抗生素，對總抗生素濃度的貢獻分別為63.6%和20.7%；磺胺甲惡唑是蝦類檢出的主要抗生素，對總抗生素濃度的貢獻為79.7%；恩諾沙星是蟹類檢出的主要抗生素，對總抗生素濃度的貢獻為32.6%。綜上所述，恩諾沙星和磺胺甲惡唑是本研究水產品檢出的主要抗生素，這可能是因為二者有廣泛的抗菌譜，一般用于防治因弧菌和嗜水氣單胞菌引起的魚、蝦和蟹的細菌性疾病，并且具有良好的環境遷移能力及化學穩定性，不易發生降解和吸附。進一步分析不同品種魚類之間的抗生素平均濃度的差異（圖3），發現本研究濾食性魚類所有抗生素的濃度均低于飼料投喂魚類。但由于本研究樣本數量較少，后續應擴大樣本數量進一步研究分析二者的差異。為了研究生物因素對水產品抗生素分布的影響，將魚、蝦和蟹類的體長和體質量與抗生素濃度進行相關性分析（表4），結果表明水產品的體長和體質量與抗生素的分布沒有顯著相關性（＞0.05）。受限于該研究的實驗內容，所得結果受多種因素的影響，例如飼料、魚齡、水產品雌雄等，這些有待后續進一步研究分析。

表4 水產品抗生素殘留與其體長和體質量的相關性Table 4 Correlation between antibiotic residues in aquatic products and body length and weight

圖2 水產品（魚、蝦、蟹）中抗生素的殘留濃度Figure 2 Concentration of antibiotics in three aquatic products of fish，shrimp and crab

圖3 不同魚類中抗生素的濃度Figure 3 Concentration of antibiotics in different fishes

2.2 水產品抗生素殘留濃度的比較分析

為全面了解淡水養殖產品中抗生素殘留情況，將本研究的數據與參考文獻中我國淡水養殖、海水養殖與市場購入水產品抗生素濃度進行了比較分析（圖4）。CHEN 等在對廣州淡水養殖區的研究中發現，磺胺甲惡唑和環丙沙星的檢出頻率最高，達到48%，恩諾沙星殘留量最高，高出其他抗生素2 個數量級，約為2 200 ng ·g。YU 等對長江下游魚類抗生素殘留的研究發現，磺胺甲惡唑是最常見的抗生素，檢出頻率為23.7%；檢出濃度最高的磺胺嘧啶濃度為1 261.01 ng·g。ZHOU 等在對太湖地區水產品的研究中發現，殘留水平最高的環丙沙星濃度為32.8 ng·g；CHEN 等對南方海陵島周圍海水養殖場水產品的研究發現，磺胺嘧啶的檢出濃度最高為2.3 ng·g。總體而言，本研究的抗生素濃度偏低或與其他研究水平相當。

圖4 本研究水產品抗生素濃度（中位數和范圍）與其他研究比較Figure 4 Comparisons between the concentration of antibiotics in aquatic products（median and range）in this study and other studies

2.3 水產品中殘留抗生素的人體健康風險評估

2.3.1 水產品的食用安全性

假定烹飪過程不會顯著影響水產品中抗生素的含量，根據最大風險控制原則，分別使用魚、蝦、蟹3 類水產品中每種抗生素的最大檢測濃度計算水產品的，以評估“最壞的情況”，9 種抗生素的范圍為7.7×10~6.5×10μg·kg·d（表5）。將與人體可接受的每日攝入量（）進行比較，判斷水產品的攝入風險。結果表明水產品抗生素的值遠小于值，均低2~5 個數量級，說明食用長三角地區水產品不存在健康風險。

表5 食用水產品估計的抗生素的每日攝入量（EDI）及相關的每日可接受攝入量（ADI）（μg·kg?1·d?1）Table 5 Estimated daily intake（EDI）of antibiotics from aquatic products and related acceptable daily intake（ADI）（μg·kg?1·d?1）

2.3.2 水產品消費對人體抗生素暴露的貢獻分析

根據尿液抗生素濃度的最低和最高值估算，并通過公式（3）估算了水產品消費對我國長三角地區3 類人群（兒童、成人和孕婦）人體總暴露的最低和最高貢獻率（），結果見表6。結果表明，Σ 抗生素的貢獻率范圍為＜0.01%~29.77%。其中Σ 磺胺類貢獻率為＜0.01%~7.56%，Σ 喹諾酮類貢獻率為＜0.01%~20.93%，Σ 大環內酯類貢獻率為＜0.01%~29.77%，后兩者有較高的貢獻率。磺胺類抗生素對人體抗生素暴露貢獻率最低，盡管其在水產品中的檢出濃度較高（表3）。這可能是因為本研究所選擇的磺胺類抗生素為優先獸用抗生素，其作為飼料添加劑用于促進動物生長和預防疾病，或作為獸藥用于感染治療，人群接觸此類抗生素的來源更有可能為其他肉類食品而非水產品，例如，2015 年對寧波豬肉抗生素殘留的研究發現，最大磺胺類殘留為194.8 ng·g，高出本研究最大殘留濃度2 個數量級。喹諾酮類抗生素為本研究水產品主要抗生素殘留之一，對人體暴露貢獻率較高。這可能是因為喹諾酮類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌力強、安全性高、價格低廉、毒副作用低等特性，因此被用于魚類細菌性疾病的防治，但隨著對其在環境中的殘留和風險評價研究的不斷深入，很多喹諾酮抗生素已逐漸被我國歸為食品動物生產過程中的禁用藥物。本研究所選擇的大環內酯類抗生素羅紅霉素不作為獸用抗生素，人群主要暴露來源可能為臨床用藥，且濃度低于其他抗生素1~7個數量級，因此水平較低，但即使水產品檢出濃度范圍較低，也可能導致對人體較高的貢獻率。此外，對于不同人群，3 類抗生素對孕婦的暴露貢獻最高。這可能是因為孕婦對水產品攝入有更高的營養需求，導致其具有最高的，同時，孕婦比其他人群更關注藥物安全，從而更謹慎地選擇藥物，導致其水平較低。

表6 淡水養殖水產品消費對3組人群抗生素暴露的貢獻率（CR，%）Table 6 Contribution rate of freshwater aquaculture product consumption to antibiotic exposure in three groups（CR，%）

本研究在得出結論的同時也存在以下局限性：首先，本研究假設烹飪水產品不會顯著影響其抗生素含量，未考慮烹飪過程對抗生素降解的影響，這很可能會高估水產品中抗生素的每日攝入量。其次，一次的尿液收集不能捕獲所有的抗生素暴露，特別是半衰期短的抗生素，這可能低估了抗生素的總暴露。為了解決這些問題，在未來的研究中應該加強烹飪過程對水產品抗生素殘留影響的研究，并增加更多時間點的尿液抗生素樣品采集，以了解人體對抗生素的長期接觸情況。總體而言，食用水產品不會造成顯著的健康風險，但可能會導致低劑量多種抗生素的混合暴露，而現有一些研究表明低劑量抗生素對人體健康也會產生不良影響，例如尿液中的一些低水平抗生素可能與兒童肥胖有關。因此今后仍需加強養殖環境和水產品中抗生素殘留的研究。

3 結論

（1）9 種目標抗生素在我國長三角主要省區淡水養殖水產品中均被檢出，但其濃度水平顯著低于最大殘留限量值，其中恩諾沙星和磺胺甲惡唑是濃度較高的抗生素。

（2）水產品中殘留抗生素估算的每日攝入量遠小于可接受的每日攝入量，在正常情況下食用本研究地區養殖的水產品不會對人體健康造成威脅。

（3）基于尿液中抗生素代謝濃度回推人體抗生素總暴露量，評估水產品消費帶來的健康風險貢獻率的結果表明，喹諾酮類抗生素可能具有較高的人體健康風險貢獻，但后續應繼續加強降低結果變異性的相關研究，進而更準確地評估抗生素暴露的風險貢獻。