褪黑素對鎘脅迫下紫蘇根系特征的影響

李亮，辛在軍，王璽洋，李曉暉，孫小艷*

（1.江西省科學院微生物研究所，南昌 330096；2.江西省重金屬污染生態修復工程技術研究中心，南昌 330096）

土壤重金屬污染是我國面臨的嚴峻環境問題。全國土壤污染狀況調查公報顯示，我國耕地土壤污染點位超標率為19.4%，其中重金屬超標點位占總超標點位的82.8%。以鎘為代表的重金屬污染耕地面積達7.33×10hm。鎘是植物生長非必需元素，但其在土壤中具有較強的化學活性，易被植物吸收、累積，并通過食物鏈危害人體健康。高濃度鎘脅迫會導致植物體內代謝功能紊亂，細胞內核酸、蛋白質、脂質氧化損傷，抑制植物生長發育，嚴重時甚至導致植物死亡。因此，降低土壤中鎘的含量和活性，提高植物耐鎘能力，并降低植物對鎘的吸收富集成為農產品安全生產的重要內容。目前，研究人員對土壤酸堿度調節、栽培措施、中微量元素拮抗等技術措施控制植物吸收富集重金屬開展了大量研究。其中，利用生長素、細胞分裂素、赤霉素、水楊酸等植物激素調節植物抗重金屬能力、調控植物富集重金屬特性受到較多的關注。

褪黑素是一種吲哚類小分子化合物，廣泛存在于動物、植物及微生物體內。目前對于褪黑素對植物抗逆的作用已開展了較為廣泛的研究，褪黑素具有：通過激發抗氧化酶、清除活性氧提高植物抗氧化水平；與脫落酸相互作用，介導氣孔運動，保護葉綠素免受降解，提高光合效率；減少重金屬和鈉鹽等有毒化合物的積累；上調防御基因；增強次生代謝物的生物合成；修飾細胞壁成分，減少細胞損傷等眾多機制來增強植物抵抗干旱、高溫、重金屬、高鹽等非生物脅迫的能力。關于褪黑素提高植物鎘脅迫耐受性的研究目前主要關注褪黑素對植物生理特征的作用，如褪黑素通過調節螯合素的生物合成、液泡隔離和抗氧化酶水平減輕鎘對番茄（Solanum lycopersicum）的毒害，通過清除過量累積的活性氧，并抑制鎘吸收和轉運相關的基因表達減少鎘脅迫對小白菜（Brassica chinen?sis）和油菜（Brassica napus）的毒害，通過增加可溶性蛋白、脯氨酸、酚類化合物等增強錦葵（Malva parvi?flora）對鎘脅迫的耐受能力。由于一些植物必需的營養元素（如鋅、鐵、錳）與鎘有相同的轉運蛋白，褪黑素對鎘轉運體的調節是否會影響其他營養元素的吸收，目前還未有相關研究。此外，褪黑素對植物形態建成，特別是根系形態構建有顯著的調控作用，而植物根系的形態和解剖結構對鎘的吸收和轉運有重要作用，但褪黑素對根系形態構建的調控如何影響植物對鎘脅迫的耐受性還不清楚，明確這一問題將為植物品種篩選和培育提供重要參考依據。

紫蘇（Perilla frutescens）為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，在我國各地均有栽培，植株和籽油具有食用和藥用價值。有研究表明，紫蘇在鎘脅迫下生物量顯著降低，且葉片具有一定的鎘富集能力，但油用紫蘇其籽油中鎘、鉛等重金屬含量極低。肖清鐵等探討了不同栽培措施對鎘脅迫下紫蘇生長和鎘累積的影響，但植物激素對鎘脅迫下紫蘇生長、根系形態、鎘累積等方面的影響還未見報道。本研究以紫蘇為實驗材料，利用水培實驗，探討外源褪黑素對不同濃度鎘脅迫下紫蘇根系形態構建及鎘和相關必需元素吸收和累積的影響，并深入分析以上根系特征在褪黑素緩解植物鎘脅迫中的調節作用，為重金屬污染耕地植物安全利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取飽滿且大小一致的紫蘇種子，用10%（V∶V）的雙氧水消毒20 min，去離子水沖洗2 遍，25 ℃下萌發，7 d 后將幼苗移植到黑色不透光水培盒（容量800 mL）中繼續培養，每盒3株，1/2 Hoagland培養液培養。調節營養液pH 為5.8~6.0，培養7 d 后換全營養液繼續培養7 d，以待后續處理。

1.2 實驗設計

在設置實驗處理前參考相關研究開展預實驗，對長勢一致的紫蘇植株進行5 個濃度（0、5、10、20、50 mg·L）的鎘處理，以及4 個濃度（0、1、10、50 μmol·L）的外源褪黑素處理。通過觀察地上部和根系的生長情況發現，紫蘇地上部生長在5 mg·L和10 mg·L的鎘處理下已經受到顯著抑制，分別添加10 μmol·L和50 μmol·L的褪黑素處理后，根系形態有顯著變化，但對地上部長勢均無顯著影響，兩個褪黑素處理間無顯著差異，添加1 μmol·L的褪黑素處理對根系形態和地上部生長均無顯著影響。在20 mg·L和50 mg·L的鎘處理下紫蘇葉片萎蔫、根系發黑，地上部和根系基本停止生長。在未添加鎘處理下，添加1 μmol·L的褪黑素對紫蘇地上部和根系生長均無顯著影響，添加10 μmol·L和50 μmol·L的褪黑素對紫蘇地上部無顯著影響，但根系形態顯著改變，且50 μmol·L的褪黑素處理對紫蘇根系的生物量有顯著的抑制作用。

根據以上預實驗結果，正式實驗去掉了5、20 mg·L和50 mg·L的鎘處理，設置了一個更低濃度的鎘處理以探討外源褪黑素能否對低濃度鎘脅迫下紫蘇地上部的生長產生顯著效應，最終鎘脅迫處理設置為：不添加、添加2 mg·L（低濃度）和添加10 mg·L（高濃度）的氯化鎘。考慮到1 μmol·L的褪黑素處理對紫蘇生長作用不顯著，而50 μmol·L的褪黑素對紫蘇根系生長有抑制作用，正式實驗中僅設置了2個外源褪黑素處理，即不添加和添加10 μmol·L的褪黑素。褪黑素和鎘脅迫兩因素共6 個實驗處理分別記為：MtCd（不添加褪黑素、不添加鎘）、MtCd（添加褪黑素、不添加鎘）、MtCd（不添加褪黑素、低濃度鎘）、MtCd（添加褪黑素、低濃度鎘）、MtCd（不添加褪黑素、高濃度鎘）以及MtCd（添加褪黑素、高濃度鎘）。選擇長勢一致的植株開始實驗處理，每個處理12 株。對有褪黑素處理的植株，為使褪黑素充分發揮對根系的調控作用，提前3 d 添加褪黑素進行預處理，之后每3 d 更換一次營養液并同時添加相應濃度的褪黑素和鎘，連續培養14 d后取樣分析。水培實驗在光照培養箱中進行，光照強度為200~250 μmol·m·s，光周期為14 h光照/10 h黑暗，溫度為光照25 ℃/黑暗22 ℃，濕度為75%。

1.3 取樣和指標測定

取樣時先將每株紫蘇根系用0.5 mmol·L氯化鈣溶液浸泡10 min，再用去離子水沖洗2 遍，去除吸附于根系表面的鎘離子后進行取樣。隨機選擇6 株植株，分為地上部和根系，65 ℃烘干48 h 后稱質量，計算單株生物量。從剩余的6 株植株中隨機選取10 條約10 cm 長的根段放入FAA 固定液保存，從每條根段隨機選取3 個位置進行石蠟切片（橫切）和番紅固綠染色，用顯微鏡觀察并拍照，利用ImageJ（National Institutes of Health，USA）和RootScan軟件提取出皮層厚度、中柱直徑、皮層細胞層數、皮層細胞大小、皮層占比（面積占橫切面積的比例）以及皮層通氣組織占比（面積占皮層面積的比例）等數據。剩下的根系用掃描儀（EPSON V600）以400 ppi 分辨率掃描根系，利用根系分析軟件（WinRhizo pro，Regent Instruments，Canada）分析圖片，計算根系長度和平均直徑。同時將掃描后的根進行烘干稱質量，計算生物量，并結合根系長度和直徑數據計算得到比根長和比表面積等根形態指標。烘干稱質量后的紫蘇地上部及根系樣品經研磨后分別稱取0.200 g（精確至0.001 g），加入消煮液（V∶V=4∶1），在微波消煮儀（MDS?8GQ）中控溫消煮至透明澄清，定容至50 mL后利用電感耦合等離子體質譜（ICP?MS）測定鎘、鋅、銅、鐵、鎂濃度。鎘轉運系數=紫蘇地上部鎘含量（mg·kg）/根系鎘含量（mg·kg）。

1.4 數據分析

利用統計軟件PASW Statistics 18進行數據分析，對添加褪黑素和鎘對紫蘇地上部和根系生長和形態指標變異的作用進行方差分析，利用LSD多重檢驗比較各指標在處理之間的差異。

2 結果與分析

2.1 紫蘇生物量

本研究以單株的地上和地下生物量變化衡量鎘對紫蘇生長的脅迫作用及褪黑素對紫蘇鎘脅迫的緩解效應，結果見圖1。低濃度和高濃度鎘處理均顯著抑制了紫蘇地上部生物量（＜0.05），2 mg·L（MtCd）和10 mg·L鎘處理（MtCd）下紫蘇地上部生物量比不添加鎘處理（MtCd）分別降低55.7%和60.4%。而兩個濃度的鎘處理對地下根系生物量的抑制作用不顯著（＞0.05）。低濃度鎘脅迫下添加褪黑素處理（MtCd）的紫蘇地上部生物量比不添加褪黑素處理（MtCd）顯著增加了106.7%（＜0.05），高濃度鎘脅迫下的紫蘇地上部生物量以及所有鎘處理的根系生物量在添加褪黑素后沒有顯著變化（＞0.05）。表明褪黑素對紫蘇鎘脅迫的緩解效應與鎘的濃度有關，褪黑素可以緩解低濃度鎘對紫蘇地上部生長的抑制，但未能緩解高濃度鎘脅迫下的紫蘇生長抑制。

2.2 紫蘇鎘含量和鎘累積量

闡明紫蘇不同器官的鎘含量和累積特征是探討褪黑素緩解紫蘇鎘脅迫機制的基礎。低濃度鎘脅迫下添加外源褪黑素后（MtCd）紫蘇地上部鎘含量、根系鎘含量、地上部鎘累積量、根系鎘累積量以及鎘轉運系數分別比未添加褪黑素處理（MtCd）顯著降低了70.7%、59.4%、38.8%、55.8%和27.8%（＜0.05，圖2），表明褪黑素緩解紫蘇低濃度鎘脅迫的作用與其對鎘吸收和轉運過程的抑制有關。高濃度鎘脅迫（MtCd）下紫蘇地上部和根系鎘含量分別是低濃度鎘處理（MtCd）的5.0 倍和2.9 倍，添加褪黑素后（MtCd）地上部鎘含量和鎘累積量分別比未添加褪黑素處理（MtCd）顯著降低58.1%和46.9%（＜0.05，圖2a、圖2c），但仍高于低濃度鎘脅迫（MtCd）下的鎘含量（＜0.05），這可以解釋為何褪黑素能夠顯著降低高濃度鎘脅迫下地上部鎘含量，但紫蘇地上部生長依然受到抑制（圖1a）。高濃度鎘脅迫下添加褪黑素后（MtCd）根系鎘含量和鎘累積量以及紫蘇整株的鎘累積量與未添加褪黑素處理（MtCd）相比未發生顯著變化（＞0.05），但轉運系數顯著降低（＜0.05），表明高濃度鎘脅迫下褪黑素仍抑制了鎘向紫蘇地上部的轉運。

圖1 紫蘇生物量對鎘和褪黑素的響應Figure 1 Growth response of P.frutescens to cadmium and melatonin

圖2 鎘脅迫下添加褪黑素對鎘在紫蘇體內轉運和累積的影響Figure 2 Effects of adding melatonin under cadmium stress on the translocation and accumulation of cadmium in P.frutescens

2.3 紫蘇根系形態

根系形態變化會影響紫蘇對鎘和營養元素的吸收。低濃度和高濃度鎘處理使單株紫蘇的根系總長度及表面積顯著降低（圖3），根系平均直徑變粗（＜0.05），而比根長、比表面積及根尖數等形態指標沒有顯著變化（＞0.05）。與不添加鎘處理（MtCd）相比，添加2 mg·L（MtCd）和10 mg·L鎘處理（MtCd）的根系總長度分別降低23.8%和22.9%，根系表面積分別降低35.4% 和22.4%，根系平均直徑分別增加21.4%和19.6%，表明鎘脅迫降低了紫蘇根系的吸收能力，有助于減少紫蘇對鎘的吸收，但同時也會減少必需營養元素（如鐵）的吸收，導致其地上部生長受到抑制。褪黑素改變了鎘脅迫下紫蘇根系形態，低濃度鎘脅迫下添加褪黑素處理（MtCd）的根系長度和表面積比不添加褪黑素處理（MtCd）分別顯著升高40.1%和54.8%（＜0.01），根系平均直徑降低9.2%（＜0.05），說明褪黑素的添加增強了根系吸收能力，但在提高養分吸收的同時也增加了鎘吸收的風險。同時，褪黑素對紫蘇根系形態的作用受鎘濃度的影響，高濃度鎘脅迫下的根系長度、表面積及平均直徑在添加褪黑素后沒有顯著變化（＞0.05）。此外，褪黑素對不同鎘處理的比根長、比表面積以及根尖數沒有顯著影響（＞0.05）。

圖3 紫蘇根系形態對鎘和褪黑素的響應Figure 3 Response of P.frutescens root morphology to cadmium and melatonin

2.4 紫蘇根系解剖結構

解剖結構可以反映根系的吸收和轉運能力。低濃度和高濃度鎘處理下紫蘇根皮層占橫切面比例顯著降低（＜0.05，圖4）。與不添加鎘處理（MtCd）相比，添 加2 mg·L（MtCd）和10 mg·L鎘 處 理（MtCd）的根中柱直徑分別增加63.4%和25.7%，皮層占比分別降低5.9%和5.0%。以上變化表明根系在鎘脅迫下向地上部傳輸鎘的能力提高，是減少鎘對根系傷害的適應性響應，但同時也增加了鎘在地上部的累積。此外，高濃度鎘脅迫還使皮層通氣組織的占比降低以及皮層細胞層數增加（＜0.05），與不添加鎘處理（MtCd）相比，添加10 mg·L鎘處理（MtCd）的根皮層通氣組織占比降低了70.6%，皮層細胞層數增加15%，這不利于水培條件下紫蘇根系對低氧環境的適應。褪黑素也導致鎘脅迫下紫蘇根系解剖結構的變化，低濃度和高濃度鎘脅迫下添加褪黑素（MtCd和MtCd）使皮層占比分別比未添加褪黑素處理（MtCd和MtCd）顯著提高2.8%和3.1%（＜0.05）。低濃度鎘脅迫下褪黑素對皮層占比的影響可能與褪黑素使鎘脅迫處理下的根中柱直徑降低（＜0.05，圖4b）有關，即降低了根系向地上部傳輸鎘的能力。此外，高濃度鎘脅迫下添加褪黑素（MtCd）與未添加褪黑素處理（MtCd）相比，皮層通氣組織占比顯著提高（＜0.05），從而提高了根系對水培條件下低氧環境的適應性。

圖4 紫蘇根系解剖結構對鎘和褪黑素的響應Figure 4 Response of P.frutescens root anatomy to cadmium and melatonin

2.5 紫蘇微量元素含量

其他微量元素會影響根系對鎘的吸收，不同處理下紫蘇微量元素含量見表1。低濃度鎘脅迫（MtCd）與未添加鎘處理（MtCd）相比，紫蘇地上部和根系中鐵含量分別顯著降低38.7%和29.3%（＜0.05），而地上部和根系中鋅、鎂、銅含量未發生顯著變化（＞0.05）。添加褪黑素后（MtCd），與未添加褪黑素處理（MtCd）相比，地上部鐵和鎂含量分別顯著增加72.2%和44.9%（＜0.05），根系鋅和鐵含量分別顯著增加117.9%和159.9%（＜0.05），而地上部鋅和銅含量以及根系鎂和銅含量未發生顯著變化（＞0.05）。表明低濃度鎘脅迫抑制了紫蘇根系對鐵的吸收，而褪黑素可以緩解鎘脅迫對鐵吸收的抑制作用。同時褪黑素還增加了根系對鋅的吸收，通過鋅和鎘的競爭關系抑制鎘的吸收。與未添加鎘處理（MtCd）相比，高濃度鎘脅迫（MtCd）下紫蘇地上部鐵含量顯著降低40.0%（＜0.05），根系鋅和銅含量分別顯著升高95.4%和120.7%（＜0.05）。與未添加褪黑素處理（MtCd）相比，添加外源褪黑素后（MtCd）根系鋅含量顯著升高135.0%（＜0.05），而地上部鋅、鐵、鎂和銅含量以及根系鐵、鎂和銅含量均未發生顯著變化（＞0.05），表明褪黑素未能緩解高濃度鎘脅迫對鐵吸收的抑制作用，同時，盡管褪黑素提高了高濃度鎘脅迫下根系對鋅的吸收，但未能抑制根系對鎘的吸收。

表1 紫蘇中微量元素對添加鎘和褪黑素的響應（mg·kg?1）Table 1 Responses of microelements in P.frutescens to cadmium and melatonin additions（mg·kg?1）

3 討論

重金屬鎘是植物非必需元素，植物受到鎘脅迫后生長發育會受到影響。本研究表明，低濃度和高濃度鎘脅迫均對紫蘇地上部的生長產生了顯著的抑制作用。這一結果與鎘脅迫對小麥、玉米、水稻等作物生長的影響一致。此外根系形態和解剖結構以及微量元素含量也受到顯著影響。本研究中鎘脅迫并未造成紫蘇根系生物量的顯著降低（圖1b），因此紫蘇根系長度和表面積降低，會造成根系其他特征的變化，如根系直徑變粗（圖3f）、中柱直徑變粗（圖4b）、皮層占比降低（圖4e）。中柱是主要負責水分和養分向上傳輸的組織，其直徑及橫切面占比與根系傳導能力呈正相關，而根系總長度、表面積和皮層占橫切面比例的降低則反映出根系吸收能力的下降。紫蘇根系對鎘脅迫的綜合響應表明根系在降低吸收能力的同時增加傳導能力，以此來減弱過量的鎘對植物根系的脅迫作用。然而，根系對鎘脅迫的適應性調整可能會造成過量的鎘對地上部的生長抑制（圖1a），同時也可能會影響紫蘇對其他必需元素的吸收和轉運，如鐵含量在鎘脅迫下顯著降低（表1）。

外源褪黑素可通過改變紫蘇根系形態和解剖結構，進而緩解鎘脅迫對紫蘇地上部生長的抑制。一方面，褪黑素通過降低根系中柱直徑（圖4b）、提高皮層占比（圖4e）、減少皮層通氣組織占比（圖4f），增加了鎘從外皮層向中柱鞘徑向運輸的阻力，從而減少鎘向地上部的轉運（圖2f），緩解鎘對地上部的抑制和傷害，促進地上部的生長（圖1a）。另一方面，褪黑素使紫蘇根變細（圖3b）、根系總長度變長（圖3a），而皮層厚度、皮層細胞層數以及細胞大小均未受到顯著影響（圖4），可以推斷根系皮層細胞數量增加，在一定程度上降低了皮層細胞中鎘的相對含量，從而減弱鎘對根系的傷害。值得注意的是，在低濃度鎘脅迫下，褪黑素通過調控根系形態變化緩解鎘脅迫傷害的效應較高濃度鎘脅迫更加明顯。在高濃度鎘脅迫下，雖然褪黑素降低了中柱直徑（圖4b），提高了根系皮層的占比（圖4e），降低了鎘向地上部的轉運及累積，但根系鎘含量和累積量并未降低，地上部的鎘含量過高（圖2），依然使紫蘇生長受到抑制（圖1）。受實驗處理設置的限制，本研究目前未能確定適度增加外源褪黑素的濃度是否能進一步降低紫蘇各器官鎘含量，同時緩解高濃度鎘脅迫對紫蘇地上部生長的抑制。

雖然根系形態和解剖結構對褪黑素的響應可以減少紫蘇地上部和根系的鎘含量，但添加褪黑素后根系總長度和表面積的增加并不利于減少根系吸收鎘的總量，而外源褪黑素對根系鋅和鐵等微量元素的調控可能是降低其對鎘吸收的潛在影響因素。植物根系中的鋅可以加速吲哚類物質的分解，因此添加褪黑素（吲哚類）導致紫蘇根系中鋅含量增加（表1），這可能是紫蘇為降低根系中相對較高的外源褪黑素含量做出的適應性調整。鋅和鎘的化學性質相似，在根表面有類似的吸收位點，植物根系對兩種元素的吸收存在權衡關系，即負相關關系。有研究表明，添加鋅肥可以抑制植物對鎘的吸收。因此，本研究中，在低濃度鎘脅迫下添加褪黑素導致紫蘇根系中鋅含量增加也可能是造成紫蘇根系及地上部鎘含量降低的重要原因之一。低濃度的鎘脅迫也造成紫蘇根系及地上部鐵含量的降低（表1），鐵元素是葉綠素形成不可缺少的條件，因此葉片中鐵含量的減少可能導致葉綠素含量及地上生物量降低，而添加褪黑素后地上部生物量的恢復也可能與鐵元素含量的增加有密切關系。此外，鋅、鐵和鎘在進入一些植物根系皮層時共用相同的轉運蛋白，相關研究也表明外源褪黑素可以調控轉運蛋白相關基因的表達，其是否可以抑制紫蘇根系鎘吸收相關的轉運蛋白的合成，以及根系中鋅、鐵含量的增加和鎘含量的降低是不是由競爭相同的轉運蛋白而引起，這些分子調控機制還有待進一步研究。

根系是紫蘇響應鎘脅迫的重要器官，其形態及解剖結構改變，會影響鋅、鐵等微量元素的吸收和累積，這些適應性調整對植物抵御鎘脅迫起重要作用。低濃度鎘脅迫下，外源褪黑素通過增加根系長度和表面積促進根系對鋅和鐵的吸收，降低根系對鎘的吸收及其向地上部的轉運，進而緩解鎘對地上器官的傷害及對地上部生長的抑制；在高濃度鎘脅迫下，外源褪黑素抑制了鎘從根系向地上部的轉運，降低了地上部鎘含量，說明褪黑素通過調控鎘脅迫下植物對重金屬離子的吸收和轉運，降低鎘向地上部的運輸，緩解植物鎘脅迫毒害效應。需要注意的是，本研究提出的外源褪黑素通過調控根系形態、解剖結構以及微量元素含量從而緩解植物鎘脅迫機制的普遍性仍需要通過其他種類的植物進行驗證，同時本研究討論的一些根系特征指標與鎘吸收和轉運的定量關系，如鎘脅迫下根系總長度與根系對營養元素和鎘吸收能力、根中柱直徑或橫切面占比與鎘轉運能力、根系鋅和鐵含量與鎘吸收能力等的直接證據，仍需更多實驗數據的支撐，以進一步確定褪黑素通過調控根系特征緩解植物鎘脅迫的機制。

4 結論

（1）鎘脅迫對紫蘇地上部生物量產生了顯著的抑制作用，但對紫蘇根系生物量影響不顯著。根系對鎘脅迫的響應主要體現在形態和解剖結構方面。

（2）添加外源褪黑素可以通過改變紫蘇根系形態和解剖結構，同時促進根系對鋅和鐵等微量元素的吸收，降低根系對鎘的吸收及向地上部的轉運，緩解鎘對地上部生長的抑制，但緩解作用因紫蘇受鎘脅迫程度不同而有所差異。