耐鹽菌對鹽脅迫下水稻種子萌發及幼苗生長的影響

劉鵬，畢江濤，羅成科，惠治兵，李文兵，肖國舉，王靜

（1.寧夏大學農學院，銀川 750021；2.寧夏大學生態環境學院，銀川 750021）

我國存在大面積鹽漬土，其主要分布在東北、華北、西北內陸和長江以北沿海地區，是我國農業生產力發展的主要障礙之一。土壤鹽漬化一方面造成土壤板結與肥力下降，阻礙植物吸收養分；另一方面通過滲透和離子脅迫影響植物和細胞水平的生理過程，使種子萌發受阻，葉綠素含量降低，光合作用下降，根系活力降低，能量消耗增加，從而加速植物衰老，并最終導致枯萎或死亡。當植物受到鹽分脅迫時，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等保護酶將參與控制活性氧的含量，在提高植物耐鹽性中發揮著重要作用。

水稻（）是寧夏的優勢作物，年均種植面積8 萬hm，總產量約6 億kg，該區是全國優質粳稻的最佳生產區之一，北部引黃灌區土地平整、水資源便利、適合水稻大面積種植，但該地區降水量少、氣候干旱、地下水位高、蒸發作用強烈，存在不同程度的鹽漬化。因此，通過生物學措施提高水稻耐鹽性，增加鹽堿地水稻產量，對鹽堿地開發利用具有重要意義。

土壤是巨大的微生物儲存庫，大量有益微生物能定植于植物根部，通過調節植物體內激素變化、誘導植物產生抗活性氧酶、促進植物中滲透保護物質增加、產生胞外多糖、調控植物體內離子平衡、誘導光合速率變化等過程提高作物耐鹽性。目前，對添加外源物質提高作物抗逆性的研究已有很多，利用微生物促進種子萌發、幼苗生長和提高作物抗逆性越來越受到重視。黃瓜、紫花苜蓿、黑麥草、煙草、小麥等作物在鹽脅迫下通過添加耐鹽微生物提高作物耐鹽性的研究較多，但在鹽堿環境條件下對水稻生長發育的影響研究相對不足，且缺乏系統性。

種子萌發期是水稻在鹽脅迫環境條件下生長發育過程中最脆弱的階段，萌發期的生長狀況對水稻后期的生長發育及產量至關重要。因此，本研究開展不同菌株組合對鹽脅迫下水稻種子萌發及幼苗生長的影響，通過測定葉綠素、根系活力和酶活性等，篩選出促進鹽脅迫下水稻幼苗生長最佳的菌株組合，初步闡述微生物誘導水稻的抗鹽機理，以期為生物修復改良鹽堿地提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為寧粳28 號，品種審定編號為寧審稻2003004，購自寧夏回族自治區原種場。

供試菌株：4 株耐鹽菌由課題組分離自寧夏鹽堿土，各菌株耐鹽均可達100 g·L左右，且菌株之間無拮抗作用，菌株純化保存于寧夏大學生態環境學院環境微生物實驗室，菌株名稱和來源見表1。

表1 供試菌株及其來源Table 1 Test strains and sources

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液制備

菌株活化后，各取2 環分別接種于LB 液體培養基中，30 ℃、180 r·min振蕩培養24 h。將培養液分裝于無菌離心管中，室溫條件下6 000 r·min離心15 min，收集菌體。張治振等的研究結果顯示，150 mmol·LNaCl 可使15 個品種的水稻生長受到抑制，故使用150 mmol·L的無菌NaCl 溶液洗滌菌體3 次并調配成菌懸液，使吸光度OD=1.0。

1.2.2 水稻種子處理

選取適量籽粒飽滿、顆粒大小相當的種子，蒸餾水清洗表面灰塵，先用10%的NaClO 溶液浸泡10 min后用無菌去離子水清洗5~8 次，再用75%酒精浸泡5 min，最后用無菌去離子水淋洗5~7 次，消毒后的水稻種子在無菌去離子水中室溫浸泡24 h，備用。

1.2.3 試驗設計

將鋪有2 層濾紙的90 mm 的玻璃培養皿在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min，待培養皿冷卻后，取30粒種子均勻擺放在培養皿中，加入10 mL菌懸液后，將培養皿放入28 ℃的光照恒溫培育箱。試驗共設置17個處理（表2），每個處理重復9次。T1為陽性對照處理，用無菌去離子水代替菌懸液；T2~T16 為試驗處理，各培養皿均加入10 mL 菌懸液，將各菌懸液等比例混合作為組合處理液；T17 為陰性對照處理，用150 mmol·L的NaCl 溶液代替菌懸液。培養期間每2 d更換一次處理液，以保證脅迫環境不變。

表2 菌株組合設置Table 2 Strain combination settings

1.3 測定指標及方法

1.3.1 形態指標的測定

培養期間每日記錄水稻種子萌發數量，以芽長達到種子長度的1/2 為發芽標準，觀察記錄種子的萌發情況，第4 d 統計發芽勢，第8 d 統計發芽率并測定水稻幼苗的根長、芽長，計算發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、耐鹽指數和相對鹽害率。

種子發芽勢=4 d內發芽種子數/供試種子數

種子發芽率=8 d內發芽種子數/供試種子數

種子發芽指數=∑（/）

式中：為天的發芽數；為發芽日數。

活力指數=×平均幼苗長度

幼苗長度=根長+芽長

耐鹽指數=/×100式中：為鹽脅迫下的萌發活力指數；為陽性對照下的萌發活力指數。

相對鹽害率=（對照發芽率?處理發芽率）/清水處理發芽率×100%

1.3.2 生理指標的測定

葉綠素含量采用95%乙醇浸提?分光光度法測定：稱取新鮮水稻幼芽0.2 g，剪碎放入研缽，加少量石英砂和碳酸鈣及3 mL 95%乙醇研磨成勻漿，再加5 mL 95%乙醇研磨至組織變白，室溫靜置3~5 min 后轉移到10 mL 離心管中4 000 r·min離心5 min，取上清液，用95%乙醇定容至25 mL 后在波長665 nm 和649 nm 下比色，通過吸光值分別計算葉綠素a（）和葉綠素b（）的濃度（mg·L），二者之和即為葉綠素總濃度（mg·L）。

根系活力采用乙酸乙酯浸提?TTC 還原法測定：稱取根0.5 g，放入培養皿，加入0.4%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液和1/15 mol·L磷酸緩沖液的等比例混合液10 mL，使根充分浸于溶液，37 ℃暗處恒溫振蕩培養1 h，加入2 mL 1 mol·LHSO終止反應。取出根并吸干溶液，加4 mL乙酸乙酯和少量石英砂研磨提取三苯基甲臜（TTF）。把多次提取液合并于試管中，用乙酸乙酯定容至10 mL，于485 nm下比色，利用吸光值和標準曲線，得出TTC的還原量。

式中：為TTC 樣品吸光度在標準曲線中所查到的相對應的還原量，μg；為根質量，g；為反應時間，h。

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定：將水稻幼芽洗凈擦干，稱取0.2 g 放入研缽，加入2 mL 10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，冰浴研磨至勻漿，再加8 mL TCA 進一步研磨，將勻漿于4 000 r·min離心10 min，取2 mL 上清液，再加2 mL 0.6%TBA溶液，混勻，沸水浴中反應15 min，迅速冷卻后離心。取上清液測定450、532、600 nm下的吸光值。

MDA 含量（μmol·g）=[6.45（A?A）?0.56A]/式中：為提取液體積，mL；為植物組織鮮質量，g。

抗氧化酶活性：取新鮮水稻幼芽0.5 g，采用液氮研磨法進行研磨，研磨后的樣品置于0~4 ℃預冷的0.2 mol·L、pH 7.0 的磷酸緩沖液中浸提2 h，4 ℃下6 000 r·min離心10 min，上清液可用于同時測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性的混合酶液。采用氮藍四唑（NBT）法測定SOD 活性，以抑制NBT 光化還原的50%為一個酶活單位（U）；采用愈創木酚法測定POD 活性，以1 min 內A變化0.01 為1 個活性單位（U）；采用紫外分光光度法測定CAT 活性，以1 min 內吸光值A減少0.1的酶量為1個酶活單位（U）。上述指標均參照《植物生理學實驗教程》完成，每個處理設3個重復。

1.4 數據處理

采用SPSS 26 統計分析軟件對各項指標進行單因素方差分析，采用Microsoft Excel 2010 和Origin 2019軟件整理數據和繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 添加耐鹽菌對鹽脅迫下水稻種子萌發的影響

由表3 可知，150 mmol·L的NaCl 脅迫對水稻種子萌發具有顯著的抑制作用，而菌懸液的添加對鹽脅迫下水稻種子萌發具有促進作用。鹽脅迫下，水稻種子萌發受到抑制，其發芽勢、發芽率和發芽指數均顯著低于無脅迫處理（＜0.05），種子發芽率低于50%，比無脅迫處理低36.30 個百分點，發芽指數低12.08；添加不同菌懸液后，發芽勢提高4.07~20.37 個百分點，發芽率提高7.04~22.96 個百分點，發芽指數提高2.34~9.18。不同菌株組合對種子萌發效果的影響存在差異，鹽脅迫下T13水稻種子發芽勢顯著高于其他處理（＜0.05）；T13種子發芽率和發芽指數最高，其次為T16，但二者差異不顯著（＞0.05），發芽率可提高約20個百分點，發芽指數可提高8左右。

表3 不同菌株組合對鹽脅迫下水稻種子萌發的影響Table 3 Effects of different strain combinations on rice seed germination under salt stress

2.2 添加耐鹽菌對鹽脅迫下水稻種子生長的影響

2.2.1 對水稻根長和芽長的影響

由圖1 可知，150 mmol·L的NaCl 脅迫導致水稻幼苗生長受到抑制，其根長和芽長顯著短于無鹽分脅迫（＜0.05）。耐鹽菌懸液添加顯著促進了幼苗根和芽的生長，T16 是促進芽和根生長效果最好的菌株組合，其次為T13 和T2，其中T16 處理后的芽長是T17的5.7 倍，說明4 株菌協作能有效減輕鹽分脅迫對水稻幼苗的毒害作用，促進幼苗生長。

圖1 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻芽長和根長的影響Figure 1 Effects of salt?tolerant bacteria on rice bud length and root length under salt stress

2.2.2 對水稻種子活力指數的影響

與傳統的發芽率相比，種子活力能反映種子在實際條件下的發芽速度和均勻性，以及幼苗的健壯生長潛力。由圖2 可知，150 mmol·L的NaCl 脅迫會顯著降低種子活力（＜0.05），T1 種子活力指數是T17 的6倍；微生物添加均能顯著提高鹽脅迫下種子活力（＜0.05），T16 效果最好，其次為T13，再次為T2，這三者之間差異顯著（＜0.05），分別較T17 的種子活力指數提高了3.19 倍、2.51 倍和1.98 倍；T5 對提高種子活力影響最小，僅提高了0.38倍。

圖2 不同菌株組合對鹽脅迫下水稻種子活力指數的影響Figure 2 Effects of different strain combinations on rice seed vigor index under salt stress

2.2.3 對水稻種子耐鹽指數和相對鹽害率的影響

耐鹽指數反映了種子對鹽堿脅迫的耐受程度，相對鹽害率反映了種子在鹽脅迫下的損傷程度。由表4 可知，菌懸液添加顯著提高鹽脅迫下水稻種子的耐鹽指數、降低相對鹽害率（＜0.05），其中T16 水稻種子耐鹽指數最高，其次為T13，T5的影響最小；T13相對鹽害率最低，其次為T16，分別較T17 降低了79.48%和71.79%，T13與T16二者差異不顯著（＞0.05）。

表4 不同菌株組合對鹽脅迫下水稻種子耐鹽指數和相對鹽害率的影響Table 4 Effects of different strain combinations on the salt tolerance index and relative salt damage rate of rice seeds under salt stress

2.3 添加耐鹽菌對鹽脅迫下水稻幼苗生理特性的影響

2.3.1 對水稻幼苗葉綠素含量的影響

由圖3 可知，在NaCl 脅迫下，水稻幼苗莖葉中葉綠素含量顯著降低（＜0.05），多菌株組合菌懸液添加可提高葉綠素含量，且效果優于單菌株，其中T8效果最佳，其次為T16，葉綠素含量分別較T17 增加了33.75% 和31.90%，T8 和T16 二者差異不顯著（＞0.05）。

圖3 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻幼苗葉綠素含量的影響Figure 3 Effects of salt?tolerant bacteria on the chlorophyll content of rice seedlings under salt stress

2.3.2 對水稻幼苗根系活力的影響

由圖4可知，NaCl脅迫導致水稻幼苗根系活力顯著降低（＜0.05），菌懸液添加可顯著提高鹽脅迫下水稻幼苗根系活力，但不同菌株組合對根系活力影響差異較大，其中T2 影響最大，較T17 提高12.47 倍，與T1無顯著差異（＞0.05），其次為T16、T6 和T5，T14 影響最小，較T17提高了1.37倍。

圖4 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻幼苗根系活力的影響Figure 4 Effects of salt?tolerant bacteria on rice seedling root activity under salt stress

2.3.3 對水稻幼苗莖葉丙二醛含量及保護酶活性的影響

由圖5 可知，150 mmol·LNaCl 脅迫致使水稻幼苗莖葉中MDA 含量顯著升高，比T1 高49.25%，干擾了水稻的正常生命活動。加菌懸液后，葉片中MDA含量均有所降低，除T7、T12 和T15 外，其他處理均達到了顯著水平（＜0.05），其中，T16效果最佳，與T1無顯著差異（＞0.05），說明添加耐鹽菌可以緩解鹽脅迫對水稻葉片膜脂過氧化的傷害，且多菌株組合對鹽脅迫的緩解作用更大。

圖5 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻幼苗莖葉MDA含量的影響Figure 5 Effects of salt?tolerant bacteria on MDA content of rice seedling stems and leaves under salt stress

由圖6 可知，150 mmol·LNaCl 脅迫使水稻幼苗CAT 活性降低，但與T1 差異不顯著。不同菌懸液添加對鹽脅迫下水稻幼苗CAT 活性影響不同，T2、T6使CAT 含量顯著降低（＜0.05），T3、T4、T8、T9、T13、T16使CAT 含量顯著升高（＜0.05），其中T13 較T1 提高了74.38%。

圖6 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻幼苗莖葉CAT活性的影響Figure 6 Effects of salt?tolerant bacteria on CAT activity of rice seedling stems and leaves under salt stress

由圖7 可知，150 mmol·LNaCl 脅迫能使水稻幼苗POD 活性顯著降低，添加菌懸液能夠顯著提高POD 活性，但不同菌株組合對POD 活性影響差異較大。T9 較T17 提高1.43 倍，與T1 無顯著差異（＞0.05），T5 和T14 使鹽脅迫下水稻幼苗POD 活性分別較T17降低了25.98%和31.94%。

圖7 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻幼苗莖葉POD活性的影響Figure 7 Effects of salt?tolerant bacteria on POD activity of rice seedling stems and leaves under salt stress

由圖8 可知，150 mmol·LNaCl 脅迫能使水稻幼苗SOD 活性顯著升高，除T5、T6 和T9 外，其他添加菌懸液處理均能夠顯著提高鹽脅迫下水稻幼苗中SOD活性（＜0.05），但不同組合對SOD 活性影響差異較大，T11 對鹽脅迫下幼苗SOD 活性影響最大，較T17可提高1倍以上。

圖8 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻幼苗莖葉SOD活性的影響Figure 8 Effects of salt?tolerant bacteria on SOD activity of rice seedling stems and leaves under salt stress

3 討論

3.1 耐鹽菌對鹽脅迫下水稻種子及幼苗的影響

植物能否在鹽堿地上生長取決于其種子在鹽分脅迫條件下能否萌發成苗，當土壤中含鹽量超過0.3%時，水稻發芽就會受到抑制，出現葉尖焦枯、老葉死亡等現象。隨著NaCl 濃度的升高，水稻種子發芽勢、發芽率、萌發指數呈遞減趨勢。多項研究顯示，鹽脅迫條件下添加有益微生物可以有效降低鹽脅迫、促進植物生長發育，枯草芽孢桿菌GB03菌液浸泡紫花苜蓿種子可以顯著提高鹽脅迫下發芽勢與發

芽率，對株高和根長及生物量均有不同程度的提升作用，接種于土壤可直接或間接調節鹽脅迫下白三葉草的葉片滲透勢，細胞膜完整性和離子積累。Fan等從鹽堿地植物根際分離出具有溶磷、產IAA 等促生功能基因的節桿菌（）和巨大芽孢桿菌（），兩菌株可以提高鹽脅迫下番茄種子的發芽率、幼苗高度、活力指數以及植物的鮮質量和干質量。武珈亦等的研究結果顯示，在0.3%的NaCl 脅迫下，熒光假單胞菌（）與巴西固氮螺菌（）菌液按1∶1 混合接入水稻根際，可顯著提高水稻劍葉光合速率、生物量、分蘗能力、結實率和千粒質量。在本研究中，150 mmol·L（質量分數約0.9%）的NaCl顯著抑制了水稻種子萌發及幼苗生長，將枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌及阿氏芽孢桿菌菌懸液單獨或等比例混入鹽溶液，各處理均能有效促進鹽脅迫下水稻種子萌發、種子活力、耐鹽指數、幼苗生物量，耐鹽性有所增加，相對鹽害率顯著降低，另外，多菌株組合促生效果總體上優于單菌株，但菌株不同組合之間對鹽脅迫下水稻促生效果存在差異，其原因有待進一步研究。

植物光合作用是受鹽脅迫影響的生理過程之一。高等植物的色素主要是由葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素組成，光合色素含量減少是光合作用效率降低的一個主要原因。鹽濃度越高、作用時間越長，對光合作用影響越大。韓慶慶等和武珈亦等接種菌株，在促進鹽脅迫下植物生長的同時也增加了其葉綠素含量，提高了光合作用速率。本研究中，單菌株添加對鹽脅迫下水稻葉綠素含量影響較小，但多菌株組合不同程度提高了鹽脅迫下水稻幼苗葉綠素含量。

根系作為植物重要的吸收代謝器官，是植物在土壤鹽漬化中最直接的受害部位，也是生長受抑制最早和最明顯的部位。根系活力反映了根系的代謝能力，直接影響植物的生長和抗逆性。隨著鹽濃度的增長，水稻、羅布麻、小麥、番茄等作物的根系活力均受到抑制；添加熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌可以提高煙草和黑麥草根系活力。本研究中，鹽脅迫顯著降低了水稻幼苗根系活力，加入菌懸液后根系活力顯著提高，其中枯草芽孢桿菌效果最好，枯草芽孢桿菌自身合成的α?淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類和多種B 族維生素可與植株體內的酶協同發揮作用，促進植物生長發育，但在菌株復配后其效果有所降低，可能與菌株之間相互作用有關。對于鹽脅迫條件下微生物參與提高水稻根系活力的機理還有待進一步研究。

高濃度鹽會使植物細胞膜受到損傷，產生大量的MDA，同時體內活性氧大量積累，SOD、CAT、POD 是植物體內酶促防御系統的3 個重要保護酶，這3 種酶協同作用以控制植物體內自由基的含量，減輕細胞膜系統的損傷。在低濃度鹽脅迫下，幼苗可通過提高保護酶活性減輕鹽害，但這種能力不會隨鹽濃度增加而持續增強，當鹽濃度過高時，保護酶活性就會降低。不同基因型的同種作物在鹽脅迫下的酶活性變化也可能不同。80 mmol·L鹽脅迫下，水稻SOD、POD 和CAT 活性增強，MDA 含量增加。本研究中，水稻種子在150 mmol·LNaCl 脅迫下，MDA 含量和SOD 活性顯著上升，但POD 活性顯著下降，CAT活性無顯著變化，這可能是鹽濃度差異造成的。CHEN 等的研究結果表明，解淀粉芽孢桿菌SQR9可能會通過總可溶性糖（TSS）含量增加而減輕對細胞的破壞，提高CAT 和POD 活性，降低Na毒性，提高玉米耐鹽性，促進玉米幼苗生長；韓冰等的研究結果顯示，接種叢枝菌根真菌AMF 可提高SOD、POD 和CAT 活性，降低MDA 含量，緩解蘆筍鹽脅迫。本研究中各微生物處理與不加微生物處理相比，幼苗MDA含量均有所下降，大多處理的CAT、POD 和SOD 活性有不同程度提高，且多菌株混合在提高SOD 活性中具有較好的效果。各菌株對酶活性影響具有一定的差異性，菌株復配后各處理間差異較大可能與菌株間的相互作用有關。

3.2 菌株在鹽脅迫下水稻種子萌發及幼苗生長中的作用

枯草芽孢桿菌和多黏類芽孢桿菌是兼具生防和促生功能的菌株；蘇云金芽孢桿菌常被用作殺蟲劑，阿氏芽孢桿菌是2009 年分離出的新種，能夠提高植物對金屬離子、干旱、病害的抗性，二者均對植物具有一定的促生作用。本研究中枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌3 株菌組合提高了鹽脅迫下種子發芽率、發芽指數和CAT 活性，顯著降低了鹽脅迫下種子相對鹽害率，效果優于4 株菌組合，這在某種程度上說明復合菌種類數越多其效果不一定越好。枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌組合能顯著提高種子活力指數、耐鹽指數，促進幼苗和根系生長，顯著降低鹽脅迫下水稻幼苗MDA 含量。蘇云金芽孢桿菌在提高種子發芽率、發芽勢和幼苗CAT 活性方面效果優于多黏類芽孢桿菌，但提高SOD 活性效果不如多黏類芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌在鹽脅迫下種子萌發、幼苗生長、提高幼苗CAT 活性和降低MDA含量方面具有較強的相似性，但在提高根系活力方面枯草芽孢桿菌效果更為突出，在提高幼苗SOD 活性方面阿氏芽孢桿菌效果更優。菌株不同量、不同組合對鹽脅迫下植物的促生效果不同，可根據植物生長需求對菌株進行配比。

4 結論

在150 mmol·LNaCl溶液中，耐鹽芽孢桿菌可以顯著提高水稻種子發芽率、增加幼苗葉綠素含量、提高根系活力和抗氧化酶活性，促進幼苗生長，多菌株復配效果優于單菌株，但不同菌株組合的功能存在一定差異，可根據植物生長需求進一步優化菌株配比。