干旱脅迫下紅、綠莖馬齒莧幼苗的生理生化特性比較

吳 曼，金 葦，李 影，張文慈，向文珍，周 訊，石曉雨，劉玉貞，付 珊, 2, 3,5，朱旺新，陳 亮, 2, 3,5

(1.湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石 435000；2.特色野菜良種繁育與綜合利用湖北省工程技術研究中心，湖北 黃石 435000；3.食用野生植物資源保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435000；4.湖北省黃岡市英山縣自然資源和規劃局，湖北 黃岡 438799；5.湖泊生物多樣性與環境保護黃石市重點實驗室(湖北師范大學)，湖北 黃石 435000)

0 引言

干旱是自然界中主要的非生物脅迫之一，也是影響植物生長發育、產量以及分布的重要因素之一[1]。隨著全球變暖，干旱造成的危害日益嚴重。因此，研究植物的抗旱性以及如何提高植物的抗旱能力成為研究者們的重要工作之一。

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)又稱馬莧、豚耳等，是馬齒莧科馬齒莧屬的一年生肉質草本植物[2]，因其形似“馬齒”，味類“莧菜”而有馬齒莧之名。馬齒莧分布廣泛，遍及溫帶和熱帶的大部分地區，在我國大多數省份都有分布，常見生長于菜地、荒土以及農田中。馬齒莧富含蛋白質、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素C等，是深受人們喜愛的食用野菜之一。馬齒莧也具有重要的藥用價值，如清熱利濕，散血消腫，涼血解毒[3]，抗蟲殺菌[4]等功效。此外，馬齒莧因其葉片肥嫩多汁、營養豐富，而莖稈纖維不多，使其成為備受畜牧業青睞的良好飼料。總之，馬齒莧是集食用價值、藥用價值、畜牧價值于一身的植物，目前人工栽培馬齒莧面積逐年增多，其利用前景可觀。野生馬齒莧常見有三個品種，寬葉莧、窄葉莧、觀賞莧[5]，本實驗根據馬齒莧采樣、調查得到，野生的馬齒莧在自然狀態下存在紅桿、綠桿兩種不同生態功能型(紅莖馬齒莧生境干旱，綠莖馬齒莧生境相對潮濕)。目前學界對馬齒莧的形態結構、化學成分等方面的研究比較多，但針對馬齒莧在干旱脅迫環境下的生理指標的研究文獻還比較少，特別是對紅莖、綠莖兩種生態型馬齒莧在干旱脅迫環境下的幼苗生長狀況以及生理指標等方面的研究更是鮮見報道。

因此，本研究以兩種生態型的紅、綠莖馬齒莧為材料，通過人為控制澆水，對其盆栽幼苗進行正常澆水(對照組)、干旱五天、干旱十天的脅迫處理，結束脅迫后測定紅、綠莖馬齒莧的生長指標以及生理指標，從生理層面對其抗旱機制進行探索，初步分析其抗逆機制，以期加速馬齒莧耐旱品種的選育，有效開發和利用馬齒莧資源、促進馬齒莧產業化利用、建設好我省高山地區(四大片區)特色蔬菜產業，以及加快精準扶貧提供重要的理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養

紅莖、綠莖馬齒莧種子于2018～2019年采集于湖北師范大學校園內，在實驗室內培養后進行后續實驗。

挑取形態完整、大小相差無幾的健康的紅莖、綠莖馬齒莧種子，分別浸泡于水中過夜，再將種子置于陰涼通風、干燥黑暗處晾干積水，4 h后取適量種子均勻平鋪于有四層紗布、雙層濾紙鋪墊的培養皿中，并在培養皿上做好標記，澆水適量以浸潤種子為宜。將種子置于25 ℃人工氣候培養箱中培養，光照時間為12 h·d-1，濕度為90%，等待發芽。

將發芽后的紅莖、綠莖馬齒莧幼苗分別移栽入高7.3 cm，上口徑7 cm，下口徑5 cm的裝有無菌生長基質(土壤∶蛭石=4∶1)的小盆中，種植密度為每小盆9株幼苗。將幼苗轉入25℃溫室中培養，每日每小盆澆水0.03 L，以保持土壤濕潤為宜。待幼苗長出兩對真葉時對紅莖、綠莖幼苗分別進行分盆，以保障幼苗能獲得充足的生長空間，此時的種植密度為每小盆4株幼苗，并分別對馬齒莧紅莖植株和綠莖植株展開正常澆水(對照組，每天澆水15 mL)、干旱5 d、干旱10 d的脅迫處理。干旱脅迫處理20 d后，分別選取長勢一致的紅莖、綠莖馬齒莧各個干旱脅迫梯度的葉片，測量各項生理指標。

1.2 主要試劑與儀器設備

1.2.1 主要儀器設備

1)電子天平(AB204-N型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)

2)優普超純水機(UPH-IV-60L型，成都超純水有限科技公司)

3)烘箱(WMK-02型，武漢電控儀器廠)

4)紫外-可見光分光光度計(UV2102PC型，龍尼柯上海儀器有限公司)

5)恒溫水浴鍋(HH-4型，金壇市精達儀器制造廠)

6)光照培養箱(GX2-2808M型，寧波楊輝儀器有限公司)

7)其它：試管(帶塞)，燒杯，玻棒，玻璃漏斗，量筒，濾紙，移液槍，試管架，研缽、培養皿、膠頭滴管等。

1.2.2 主要試劑與溶液

1)濃硫酸(分析純，開封東大化工有限公司試劑廠)

2)無水乙醇(分析純，上海試劑三廠)

3)蒽酮試劑(分析純，上海化學試劑采購供應五聯化工廠)

4)活性炭(天津市恒興化學試劑制造有限公司)

5)葡萄糖(分析純，上海試劑三廠)

6)磺基水楊酸(指示劑，湘中精細化學品廠)

7)茚三酮(分析純，上海試劑三廠)

8)磷酸(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)

9)甲苯(分析純，上海試劑三廠)

10)冰乙酸(分析純，上海試劑三廠)

11)脯氨酸(上海易蒙斯化工科技有限公司)

12)鹽酸(分析純，武漢市江北化學試劑有限責任公司)

13)氫氧化鈉(分析純，上海試劑三廠)

14)亞硝酸鈉(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)

15)丙酮(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)

16)石英砂(分析純，上海試劑三廠)

17)碳酸鈣(化學純，廣東汕頭西隴化工廠)

18)二甲苯(分析純，shanghai Macklin Biochemical Co, Ltd.)

1.3 生長指標的測定

株高的測量：用直尺分別測量干旱脅迫處理20 d后的紅莖和綠莖馬齒莧幼苗的植株高度(即由第一個根毛最末端的根尖至莖頂端的長度)，并記錄數據，每組實驗3～5個重復。

植株莖、葉變化：待馬齒莧干旱脅迫處理20 d后，分別記錄馬齒莧紅莖、綠莖植株三個干旱脅迫梯度之間莖、葉形態的變化與差異。

1.4 生理指標的測定

取干旱脅迫處理20 d后的紅莖和綠莖馬齒莧幼苗，測定各項生理指標。

1.4.1 可溶性糖含量測定 可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[6]。分別稱取紅、綠莖馬齒莧粉末50 mg，每組設置3個重復，利用80%乙醇在80℃水浴浸提40 min，用活性炭80℃脫色30 min，加入蒽酮試劑，在625 nm波長下測吸光值。將結果與標準曲線對比，根據公式求出紅、綠莖馬齒莧中可溶性總糖的含量：

式中C表示可溶性糖含量(%)，A表示從標曲中查的糖量(μg)，VT表示樣品提取液總體積(mL)，N表示稀釋倍數，V1表示顯色時取樣量(mL)，W表示樣品重(g).

1.4.2 MDA含量測定 丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測定，采用硫代巴比妥酸比色法[7]。取0.5 g新鮮紅、綠莖馬齒莧剪碎后加入5 mL 10%TCA進行研磨提取，離心后取上清，為樣品提取液。取2 mL樣品提取液(對照組加2 mL蒸餾水)加入2 mL 0.6%TBA溶液，搖勻，沸水浴15 min后取出并迅速冷卻。取上清液測定532 nm、600 nm和450 nm波長下的OD值。根據公式求出紅、綠莖馬齒莧中MDA的濃度：

C1=6.45(D532-D600)-0.56D450

C2=C1×V/W

式中C1表示植物樣品提取液中MDA的濃度(μmol·L-1)，D表示該波長下的吸光度值，C2表示MDA含量(μmol·g-1)，V表示提取液體積(mL)，W表示植物組織鮮重(g)。

1.4.3 花青素含量測定 取0.5 g新鮮紅、綠莖馬齒莧剪碎，加入0.1 mol·L-1HCl 10 mL(HCl用量可視花青素含量而增減)提取，用稱量紙封住杯口。置于32℃恒溫箱中，至少浸漬4h.浸漬完成后過濾。取濾液，在波長530 nm下、以0.1 mol·L-1HCl為空白對照讀取OD值。當OD值為0.1時的花青素濃度稱為一個單位，以比較花青素的相對含量。將測得的OD值乘以10，則可以用來表示花青素的相對濃度單位。

1.4.4 POD活性測定 過氧化物酶POD(Peroxidase，POD)活性測定，采用愈創木酚法[8]。取0.5 g新鮮紅、綠莖馬齒莧剪碎后加入20 mmol·L-1KH2PO4溶液進行研磨提取，離心后取上清，最后定容至4 mL，為酶提取液。取0.5 mL酶提取液(對照組加0.5 mL 20 mmol·L-1KH2PO4)加入3 mL反應混合液(每100 mL反應混合液由100 mL pH=6的磷酸緩沖液、56 μL 0.25%愈創木酚和38 μL 30%H2O2組成)迅速震蕩搖勻，同時，立即開啟秒表，此時讀取的OD470nm值為0 s時的OD值。每30 s讀取一次OD值，讀取5 min內的OD值。每分鐘的OD變化快慢可以表示酶的活性大小度量，可用每分鐘OD值變化0.01作為一個過氧化物酶活性單位(U)。根據公式求出紅、綠莖馬齒莧中POD活性：

F=ΔA470×VT/(W×VS×t×0.01)

式中F表示過氧化物酶活性(U·g-1·min-1)，ΔA470表示反應時間內OD470nm的變化量，W表示植物鮮重(g)，VT表示提取酶液總體積(mL)，VS表示測定時用取酶液體積(mL)，t表示反應時間(min).

1.5 數據統計與分析

利用Microsoft Excel 2010對上述紅莖、綠莖馬齒莧的生長指標、生理指標相關數據展開數據分析，并使用IBM SPSS Statistics 25軟件進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。利用Microsoft Excel 2010軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對紅、綠莖馬齒莧幼苗生長指標的影響

此外，隨著干旱脅迫程度的加強，紅、綠莖馬齒莧幼苗枝條節間變短，莖稈變細，葉面積減少，葉片顏色發暗，葉緣變紅，葉片皺縮合攏，葉數量增加緩慢(圖1)。由圖2可知，隨著干旱脅迫程度的逐漸增加，紅、綠莖馬齒莧株高均呈逐漸下降的趨勢。在干旱10 d處理下，紅、綠莖馬齒莧株高分別為8.7cm、6.9cm，相較于對照組有顯著性差異(P<0.05)。由此說明，干旱脅迫對紅、綠莖馬齒莧株高的生長均有抑制作用，且對綠莖馬齒莧的抑制作用強于紅莖馬齒莧。

圖1 干旱脅迫下紅、綠莖馬齒莧的表型圖，其中A圖為干旱脅迫下綠莖馬齒莧表型圖；B圖為干旱脅迫下紅莖馬齒莧表型圖。

2.2 干旱脅迫對紅、綠莖馬齒莧幼苗生理指標的影響

圖2 干旱脅迫下紅、綠莖馬齒莧幼苗的株高

2.2.1 干旱脅迫對紅、綠莖馬齒莧幼苗可溶性糖含量的影響 參與滲透調節、提供營養物質是可溶性糖在植物受到干旱脅迫時承擔的重要使命。植物的葉片中含有較高含量的可溶性糖，不僅可以作為植物的營養物質還可以增強植物對外界脅迫的響應。由圖3可以看出，隨著干旱脅迫程度的加強，紅、綠莖馬齒莧中可溶性糖含量均呈依次增加的趨勢。在不同干旱脅迫程度下，綠莖中可溶性糖含量高于紅莖，但是無顯著性差異。在干旱10 d處理下，可溶性糖含量達到最多，紅、綠莖分別為16.78×10-6mg·mg-1、18.54×10-6mg·mg-1，相較于對照組有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

2.2.2 干旱脅迫對紅、綠莖馬齒莧幼苗MDA含量的影響 植物體內MDA含量的高低，是衡量植物處于干旱脅迫的生長環境下而引發植物細胞膜脂過氧化作用的強度的重要指標。因此，對馬齒莧紅莖、綠莖的MDA含量進行測量可以體現出兩種生態型馬齒莧(綠莖、紅莖)的抗旱能力。實驗結果顯示，隨著干旱脅迫程度的加強，紅、綠莖馬齒莧中MDA含量均呈逐漸上升的趨勢，且綠莖馬齒莧中的含量高于紅莖。在干旱10 d脅迫處理下，丙二醛含量達到最多，紅、綠莖分別為1.38×10-6mol·g-1FW、1.62×10-6mol·g-1FW，相較對照組有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

圖3 干旱脅迫下紅、綠莖馬齒莧幼苗可溶性糖的含量 圖4 干旱脅迫下紅、綠莖馬齒莧幼苗的MDA含量

2.2.3 干旱脅迫對紅、綠莖馬齒莧幼苗花青素含量影響 花青素是植物中分布廣泛的一類多酚類色素，可以保護植物免受多種非生物以及生物脅迫。由圖5可知，隨著干旱脅迫程度的加強，紅、綠莖馬齒莧中花青素含量均呈逐漸上升的趨勢，說明干旱促進了花青素的合成。并且，在不同的干旱脅迫程度下，紅莖中花青素含量顯著性高于綠莖，表明紅莖馬齒莧相較于綠莖具有更強的耐旱作用。此外，在干旱10 d脅迫處理下，花青素含量達最高值，紅、綠莖馬齒莧的含量分別為5.2、4.23(相對含量)，相較于對照組有顯著性差異(P<0.05)。

圖5 干旱脅迫下紅、綠莖馬齒莧幼苗花青素的含量

2.2.4 干旱脅迫對紅、綠莖馬齒莧幼苗POD活性的影響 POD活性是一種廣泛存在于植物體中的活性酶，它與呼吸作用，光合作用及生長素的氧化等都有密切聯系。由圖6可知，隨著干旱脅迫程度的加強，紅、綠莖馬齒莧中POD活性均呈逐漸上升的趨勢，且紅莖中POD活性強于綠莖。在干旱10 d處理下，POD活性達到最大，紅、綠莖分別為560 U·min-1·g-1FW、480 U·min-1·g-1FW，相較于對照組有顯著性差異(P<0.05)。由此可見，干旱脅迫的加劇可以使紅、綠莖馬齒莧中POD活性增強。

圖6 干旱脅迫下紅、綠莖馬齒莧幼苗POD的活性

3 討論

干旱是限制植物生長和發育的關鍵因子之一[9]。植物在遭受到干旱脅迫時，脅迫強度的增加和脅迫時間的延長都會對植株造成嚴重的損害[10]。 許多研究表明，干旱脅迫下植物經常表現為植株生長減弱，最大葉面積、比葉面積(單位重量的葉面積)、葉面積的生長率、葉片數量和生物產量都顯著降低[11，12]。如唐健民等[13]研究發現，隨著干旱脅迫的程度不斷加劇東興金花茶幼苗會葉片萎蔫、打卷，同時光合速率和蒸騰速率下降，甚至死亡；丁雪丹等[14]研究發現干旱脅迫對不同花境植物的葉片數增量均有抑制作用，葉片數量受干旱影響均呈下降趨勢，不同花境植物隨干旱脅迫的增強葉面積呈降低趨勢。Michelena和Boyer[15]研究認為，在干旱脅迫環境下植物形態發生改變可能與細胞壁的硬化響應有關。在干旱條件下細胞壁的硬化限制了植物葉面積的擴大，使得植物的蒸騰失水顯著降低，提高植株的存活時間。在本研究中發現，在干旱脅迫下，紅莖、綠莖馬齒莧生長受到抑制，株高降低、葉片皺縮、葉面積縮小，并且隨著干旱脅迫程度的增加，抑制強度增加(圖1)。此外，干旱脅迫對綠莖株高生長的抑制作用強于紅莖，說明紅莖馬齒莧相較于綠莖具有更強的耐旱能力(圖2)。

研究表明遭受逆境脅迫時，植物體內會積累大量的滲透調節物質，從而降低細胞的水勢，減輕植株受到的傷害[16，17]。可溶性糖是植物體內滲透調節最重要的物質之一，其在處于干旱脅迫過程中的植物體內的變化能在一定程度上反映植株對不良環境的適應能力[18]。高昆[19]等人的研究結果表明，干旱脅迫程度越強，錦燈籠(PhysalisalkengiL.var.franchetii(Mast.) Makino)幼苗中可溶性糖的含量就越高。而在本研究中，兩種生態型馬齒莧幼苗中的可溶性糖含量在兩種干旱脅迫梯度隨干旱脅迫程度的增強逐漸增加(圖3)，說明這兩種生境的馬齒莧對干旱均具有一定的耐受性。但是，在同一干旱程度下，綠莖馬齒莧中可溶性糖含量略高于紅莖馬齒莧，表明二者對干旱的耐受機制存在一定的差異。雖然紅莖馬齒莧對干旱的耐受能力強于綠莖(圖3～6)，但是為了應對干旱脅迫，綠莖馬齒莧也通過增加過多的可溶性糖含量來提高其生存率。

在干旱、低溫等不良環境脅迫時，植物體內常常發生膜脂過氧化作用。膜脂過氧化的產物O2-、-OH和H2O2自由基，會破壞膜系統，導致植物傷害[20]。POD能夠通過在氧化相應基質(如酚類化合物)時清除低濃度的H2O2，將H2O2還原成H2O，以消除細胞內的H2O2[21]，維持細胞正常生理功能。且干旱條件下，POD的調節能力越大，表明作物抗旱性越強[22]。在植物體內，MDA也是脂質過氧化的主要產物之一，它的積累是活性氧毒害作用的表現，因此其含量可以反映出植物遭受逆境脅迫的傷害程度[23]。高昆、王佳琪[19]研究發現，植物幼苗隨著干旱脅迫程度的增加，MDA含量同樣呈增高的趨勢。花青素屬于黃酮類化合物，而黃酮類化合物具有清除自由基和抗氧化的生理活性功能，在植物生長中起調節作用。查閱文獻可知花青素能夠清除和抑制-OH、H2O2等活性氧[24]。由此可見，測量紅莖、綠莖馬齒莧幼苗在干旱脅迫下的POD活性、MDA含量、花青素含量，可以反映出馬齒莧幼苗在干旱脅迫下植株發生過氧化作用的程度，從而了解紅莖、綠莖馬齒莧幼苗抗旱的能力。在本研究中，隨著干旱脅迫程度的加強，使得紅、綠莖馬齒莧中的花青素含量和MDA含量增加、POD活性增強，其中干旱10 d與對照組相比均有顯著性差異。并且，同一干旱脅迫程度下，紅莖馬齒莧中花青素的含量顯著性高于綠莖(圖5)，POD活性也高于綠莖馬齒莧(圖6)，而MDA含量低于綠莖馬齒莧(圖4)，說明紅莖馬齒莧對干旱的耐受能力高于綠莖馬齒莧。

馬齒莧是具有藥食兩用的重要植物之一，本實驗對干旱脅迫下紅莖、綠莖馬齒莧幼苗的株高、莖葉生長情況以及可溶性糖含量、MDA含量、花青素含量和POD活性這些指標的測定，闡明了這兩種不同生態型馬齒莧具有一定的抗旱能力，且紅莖馬齒莧對干旱的耐受能力強于綠莖，本研究為開發新的耐旱馬齒莧品種奠定了一定的理論和實驗基礎。